摘要：上皮/內皮細胞分子(EpCAM)是癌干細胞(CSC)重要的表面標記物分子。利用噬菌體展示肽庫進行親和消減富集生物淘篩(Biopanning), 經(jīng)過5輪淘篩, 從最后一輪的噬菌體洗脫庫中隨機挑選47個克隆擴增, 通過ELISA方法初步確定30個陽性噬菌體克隆并進行測序, 序列分析后獲得5個共有序列克隆群, 隨后通過細胞免疫熒光實驗驗證和鑒定了其CSC靶向結合特異性。經(jīng)綜合分析, 確定R8噬菌體克隆的EpCAM結合特異性和敏感性最佳, 將其多肽序列命名為ESP1。該EpCAM靶向肽ESP1未來在癌化療靶向遞送藥物研發(fā)方面具有潛在使用價值, 可使藥物盡可能多地殺傷CSC, 進而提高療效, 減少復發(fā)。
癌化療藥物缺乏靶向性或者靶向性不足而導致癌化療效果不佳是目前癌癥臨床遇到的主要瓶頸問題之一[1-6], 特別是癌干細胞(cancer stem cell, CSC)是導致癌癥增生、轉移、復發(fā)的重要癌細胞群, 目前學界共識是化療應盡可能多地殺滅CSC[7-10]。CSC具有多種高表達的表面標記分子, 其中上皮/內皮細胞分子(epithelial/endothelial cell adhesion molecule, EpCAM)是CSC細胞表面重要的標志性分子之一, 并且可能與癌的侵襲、轉移等惡性表型的產(chǎn)生有密切關系[11-13], 已有多篇權威文獻報道了以EpCAM為靶點的多種腫瘤化療新藥研發(fā)嘗試策略, 包括以適配體(aptamer)作為導向元件等[14-15]。但是, 多肽以其分子量小、無毒、免疫原性低、易合成和高特異性等優(yōu)勢, 被認為是用于細胞/組織靶向導向元件的最佳選擇[16-19], 而利用肽庫淘篩(Biopanning)技術獲得分子或細胞高特異性結合多肽是目前最常用的方法[20-21]。
噬菌體展示肽庫(phage displayed peptide library)的淘篩(Biopanning)技術是一種快速簡便的、目前最常用的細胞或分子靶向多肽的篩選方法, 由美國NEB(New England Biolabs, Boston, MT)出品的這類肽庫也是目前世界上最被認可的、使用最多的肽庫[22-25]。以此類方法篩選的癌靶向多肽作為靶向分子元件, 被廣泛用于癌癥早期分子影像學診斷、靶向納米生物材料和靶向抗癌藥物遞送等研究[26-27]。
1 材料與方法
1.1 主要實驗材料
(1) 噬菌體展示肽庫: 噬菌體隨機十二肽展示文庫(Ph.D-12TM phage display peptide library kit)購自美國NEB。
(2) 細胞株 : 人胚腎 HEK293細胞株、肝癌HepG2細胞株、乳腺癌MCF-7細胞株, 均為本實驗室儲存。用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養(yǎng)基, 于37 °C、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
(3) DMEM培養(yǎng)基: Gibco公司(New York, NY)。
(4) 宿主菌: E. coli ER2738購自New England Biolabs, 美國。以含50%甘油的菌體培養(yǎng)物形式貯存于–80 °C冰箱。
(5) 抗體: 鼠抗M13多克隆抗體購自Abcam(ab24229), 英國; 辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠多克隆抗體購自Abcam(ab6789)公司; 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、DAPI細胞核染液購自西安沃爾森生物技術有限公司。
1.2 主要實驗方法
1.2.1 肽庫消減富集生物淘篩(Biopanning) 復蘇宿主菌ER2738進行細菌培養(yǎng), 按照試劑盒Ph.D-12說明書提供的實驗步驟滴定Ph.D-12文庫, 然后以EpCAM為靶點, 按照本實驗室改良的Biopanning程序[2,19], 將EpCAM純化蛋白(100 μg/mL)以及pH8.4的碳酸氫鈉溶液, 以每孔100 μL包被于96孔板, 于4 °C孵育過夜。為使陽性克隆得到更好的富集, 進行5輪Biopanning并隨機挑選若干噬菌體克隆, 再以ELISA進一步篩選陽性噬菌體克隆。
1.2.2 酶聯(lián)免疫實驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 使用常規(guī)96孔板法, 用ELX800全自動酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-TEK, Los Angeles, CA)進行檢測, 把EpCAM的D值記為P, BSA的D值記為N。以P/N的A450比值≥2.1為陽性界定標準, 比值≤1.5界定為陰性。
1.2.3 噬菌體克隆測序 將ELISA法篩選的陽性克隆送蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序, 獲得各克隆的十二肽序并通過分析獲得共有序列 (consensus sequence)。
1.2.4 EpCAM的網(wǎng)絡分析 為進一步確認篩選得到的陽性噬菌體克隆與EpCAM在細胞水平的靶向性, 通過CCLE數(shù)據(jù)庫(https://portals.broadinstitute.org/)對EpCAM在多種癌癥中的表達情況進行分析, 從而選擇合適的細胞系進行細胞層面的驗證。
1.2.5 細胞免疫熒光法
(1) 細胞爬片。取滅過菌的規(guī)格為5 mm×5 mm的蓋玻片, 將其置于30 mm的培養(yǎng)皿中, 取處于指數(shù)期且生長狀況良好的人胚腎細胞HEK293、乳腺癌細胞MCF-7以及肝癌細胞HepG2進行傳代并計數(shù), 將5×105個/mL的細胞懸液接種至30 mm的培養(yǎng)皿中, 每皿加2 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基, 于5% CO2、37 °C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。
(2) 陽性噬菌體克隆對細胞表面EpCAM的親和力分析。將MCF7細胞、HEK293細胞和HepG2細胞接種至30 mm細胞培養(yǎng)皿中, 長滿單層后用PBS洗滌3次, 4%多聚甲醛固定30 min, 再次洗滌3次后加入1 mL 1% BSA, 于37 °C恒溫培養(yǎng)箱中封閉30 min。棄封閉液, 分別加入陽性噬菌體克隆(1×1012 pfu), 每個克隆1皿, 于37 °C恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h。洗滌后加入鼠抗M13多克隆抗體(工作濃度1:1 000), 于4 °C中過夜孵育。次日以PBS洗滌3次后滴加FITC標記的山羊抗鼠多克隆抗體(工作濃度1:500), 37 °C避光孵育30 min。PBS洗滌3次后加入DAPI染液, 37 °C避光孵育15 min。PBS再次洗滌后用90%的甘油封片, 于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。
1.2.6 最佳克隆序列與EpCAM的分子對接(dock-ing) 通過SWISS-PDB viewer(v4.1)軟件預測最佳克隆的肽序空間結構, 然后從PDB主頁下載EpCAM的PDB模板文件, 最后利用AutoDock Vina軟件(v4.2)將EpCAM與最佳克隆的肽序進行分子docking, 從分子空間構型模擬及docking參數(shù)多角度分析該多肽序列與EpCAM分子的靶向親和力。
2 結果
2.1 經(jīng)過5輪Biopanning, EpCAM靶向克隆明顯富集擴增
噬菌體肽庫滴定的結果為1.6×1013 pfu/mL, 首輪投入10 μL噬菌體/孔, 通過5輪“吸附→洗脫→富集”篩選, 得到五級洗脫的肽庫, 計算每輪的產(chǎn)出與投入比, 結果(表1和圖1)顯示了良好的EpCAM靶向噬菌體的消減富集。
2.2 獲得了足夠數(shù)量的陽性噬菌體克隆
對第5輪篩選的洗脫肽庫進行LB/IPTG/Xgal鋪板顯色, 并隨機挑選了47個克隆進行擴增純化, 利用ELISA方法, 按照陽性克隆界定標準共獲得了30個陽性克隆, 對它們進一步的ELISA確認結果如圖2所示。
結果確認了30個陽性克隆與EpCAM的結合力, 其中R8克隆結合能力最強。對30個陽性克隆及對照克隆進行測序, 結果分析發(fā)現(xiàn)了由23個克隆組成的5個共有序列群如表2所示。
2.3 陽性克隆及最佳克隆對細胞EpCAM具有敏感的特異結合特性
2.3.1 網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn) EpCAM在常見癌細胞 /組織表達水平有明顯差異
CCLE數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)EpCAM在常見癌癥的表達情況 : EpCAM在乳腺癌、肺癌、食管癌、結直腸癌中表達較高, 而在肝癌、黑色素瘤、膠質瘤、淋巴瘤等癌癥中表達較低(圖3)。
2.3.2 R8克隆顯示了最佳的細胞EpCAM特異性結合力 EpCAM是CSC細胞表面重要的標志物, 而CSC無論是在癌組織還是培養(yǎng)的癌細胞里都是極少數(shù)的, 上述數(shù)據(jù)庫分析結果顯示, 乳腺癌細胞中EpCAM表達水平相對較高(圖3)。所以, 本研究將EpCAM表達水平較高的乳腺癌細胞 MCF-7、EpCAM, 表達水平較低的肝癌細胞HepG2和非癌細胞HEK293進行了細胞水平的噬菌體克隆結合特異性和敏感性的篩選鑒定。
在通過ELISA篩選的5個共有序列克隆群中, 每群選取一個P/N值最高的克隆R8(ESP1)、R5(ESP2)、R16(ESP3)、R15(ESP4)、R25(ESP5)做細胞免疫熒光實驗, 進一步驗證其與EpCAM在細胞水平上的結合特異性和敏感性, 結果顯示, R8克隆(ESP1序列)與MCF-7細胞中EpCAM表達細胞(CSC細胞)的結合敏感性強于其他克隆(圖4A)。將圖4A中各克隆與MCF-7細胞中EpCAM表達細胞的檢測結果局部放大觀察, 結果顯示, R8克隆與EpCAM的靶向特異性、敏感性最強(圖4B)。
通過以上鑒定, 確定R8代表的ESP1多肽序列為最佳EpCAM靶向序列。
2.4 ESP1序列與EpCAM具有良好的分子模擬對接效應
為了進一步確認最佳克隆序列與EpCAM的親和力, 通過Autodock Vina軟件對兩者的親和力進行了Docking模擬測試, 結果顯示, ESP1序列與EpCAM分子在空間構型的多個角度都具有良好的對接效應(圖5)和表3。
3 討論
癌化療藥物缺乏靶向性或者靶向性不足導致癌化療效果不佳是目前癌癥臨床遇到的主要瓶頸問題之一[28-29], 而癌干細胞(CSC)是導致癌癥增生、轉移、復發(fā)的重要癌細胞群, 目前學界共識是化療應盡可能地殺滅CSC[14-15]。EpCAM是CSC表面重要的標志性分子之一, 可能與癌的侵襲、轉移等惡性表型的產(chǎn)生有密切關系, 可以作為CSC的靶向標志物[14-15]。多肽分子具有低毒、分子量小、低免疫原性、結構簡單、對腫瘤的高滲透性及易于被修飾等特點, 是被寄以厚望的癌靶向導向元件選擇[16-19], 多肽可以與納米材料、納米藥物等偶聯(lián)而賦予其癌細胞/組織靶向特性從而進行腫瘤的靶向遞送和治療[30-33]。靶向多肽還可以被熒光素、同位素等標記而成為特異性探針, 用于癌癥的早期分子影像診斷, 對于“早發(fā)現(xiàn)、早治療”的癌防治策略具有重要意義[34]。但這些都取決于特異、敏感的多肽片段的獲得。
本研究以EpCAM為Biopanning的靶分子, 從NEB12肽庫以改良的Biopanning流程進行了5輪消減富集篩選, 以ELISA方法從末輪富集庫隨機挑選的47個克隆中鑒定了30個陽性克隆(圖2), 通過測序獲得了5條共有序列(ESP1、ESP2、ESP3、ESP4、ESP5)(表2)。
CSC無論是在癌組織還是培養(yǎng)的癌細胞里都是極少數(shù), 其標志物EpCAM在各種癌細胞/組織中的表達水平差異較大, 在乳腺癌細胞/組織中表達水平較高(圖3), 所以本研究選用EpCAM表達水平較高的乳腺癌細胞MCF-7和表達水平較低的肝癌細胞HepG2以及非癌細胞HEK293, 通過細胞免疫熒光實驗檢測了5個共有序列對乳腺癌細胞CSC細胞EpCAM的結合特異性和敏感性, 發(fā)現(xiàn)ESP1(R8)、ESP5(R25)序列對EpCAM高表達細胞(CSC細胞)具有明顯的結合特異性和敏感性(圖4A), 把5個共有序列克隆對MCF-7的檢測結果進行放大處理的結果(圖4B)顯示ESP1(R8)序列的特異性和敏感性明顯強于ESP5(R25), 從而確定其為最佳EpCAM靶向12肽序列。
以分子空間模擬構型的對接(docking)對ESP1與EpCAM的靶向親和力進行的分析顯示, ESP1肽序列在EpCAM分子不同空間構型角度都對EpCAM具有良好的靶向結合力(圖5)。
以上研究結果充分顯示了多肽序列 ESP1的EpCAM也即CSC的靶向結合特異性和敏感性, 這些特點賦予了ESP1在未來新型癌靶向化療藥物研發(fā)方面重要的使用價值, 通過對CSC的靶向殺傷, 有可能達到改善癌化療效果、降低癌轉移和復發(fā)的目標。
4 結論
本文以EpCAM為Biopanning靶分子, 從噬菌體12肽庫篩選、鑒定獲得了對CSC細胞EpCAM具有良好靶向特異性和敏感性的12肽序列ESP1, 細胞水平的檢測和分子空間構型的模擬預測都證實了該多肽片段對CSC細胞EpCAM具有良好靶向性。該研究結果為未來高效、低毒、抗復發(fā)的新型癌癥靶向化療藥物的研發(fā)提供了一個重要的靶向元件選擇。
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