摘要：上皮/內(nèi)皮細(xì)胞分子(EpCAM)是癌干細(xì)胞(CSC)重要的表面標(biāo)記物分子。利用噬菌體展示肽庫進(jìn)行親和消減富集生物淘篩(Biopanning), 經(jīng)過5輪淘篩, 從最后一輪的噬菌體洗脫庫中隨機(jī)挑選47個克隆擴(kuò)增, 通過ELISA方法初步確定30個陽性噬菌體克隆并進(jìn)行測序, 序列分析后獲得5個共有序列克隆群, 隨后通過細(xì)胞免疫熒光實驗驗證和鑒定了其CSC靶向結(jié)合特異性。經(jīng)綜合分析, 確定R8噬菌體克隆的EpCAM結(jié)合特異性和敏感性最佳, 將其多肽序列命名為ESP1。該EpCAM靶向肽ESP1未來在癌化療靶向遞送藥物研發(fā)方面具有潛在使用價值, 可使藥物盡可能多地殺傷CSC, 進(jìn)而提高療效, 減少復(fù)發(fā)。
癌化療藥物缺乏靶向性或者靶向性不足而導(dǎo)致癌化療效果不佳是目前癌癥臨床遇到的主要瓶頸問題之一[1-6], 特別是癌干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)是導(dǎo)致癌癥增生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的重要癌細(xì)胞群, 目前學(xué)界共識是化療應(yīng)盡可能多地殺滅CSC[7-10]。CSC具有多種高表達(dá)的表面標(biāo)記分子, 其中上皮/內(nèi)皮細(xì)胞分子(epithelial/endothelial cell adhesion molecule, EpCAM)是CSC細(xì)胞表面重要的標(biāo)志性分子之一, 并且可能與癌的侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性表型的產(chǎn)生有密切關(guān)系[11-13], 已有多篇權(quán)威文獻(xiàn)報道了以EpCAM為靶點的多種腫瘤化療新藥研發(fā)嘗試策略, 包括以適配體(aptamer)作為導(dǎo)向元件等[14-15]。但是, 多肽以其分子量小、無毒、免疫原性低、易合成和高特異性等優(yōu)勢, 被認(rèn)為是用于細(xì)胞/組織靶向?qū)蛟淖罴堰x擇[16-19], 而利用肽庫淘篩(Biopanning)技術(shù)獲得分子或細(xì)胞高特異性結(jié)合多肽是目前最常用的方法[20-21]。
噬菌體展示肽庫(phage displayed peptide library)的淘篩(Biopanning)技術(shù)是一種快速簡便的、目前最常用的細(xì)胞或分子靶向多肽的篩選方法, 由美國NEB(New England Biolabs, Boston, MT)出品的這類肽庫也是目前世界上最被認(rèn)可的、使用最多的肽庫[22-25]。以此類方法篩選的癌靶向多肽作為靶向分子元件, 被廣泛用于癌癥早期分子影像學(xué)診斷、靶向納米生物材料和靶向抗癌藥物遞送等研究[26-27]。
1 材料與方法
1.1 主要實驗材料
(1) 噬菌體展示肽庫: 噬菌體隨機(jī)十二肽展示文庫(Ph.D-12TM phage display peptide library kit)購自美國NEB。
(2) 細(xì)胞株 : 人胚腎 HEK293細(xì)胞株、肝癌HepG2細(xì)胞株、乳腺癌MCF-7細(xì)胞株, 均為本實驗室儲存。用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養(yǎng)基, 于37 °C、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
(3) DMEM培養(yǎng)基: Gibco公司(New York, NY)。
(4) 宿主菌: E. coli ER2738購自New England Biolabs, 美國。以含50%甘油的菌體培養(yǎng)物形式貯存于–80 °C冰箱。
(5) 抗體: 鼠抗M13多克隆抗體購自Abcam(ab24229), 英國; 辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗鼠多克隆抗體購自Abcam(ab6789)公司; 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、DAPI細(xì)胞核染液購自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司。
1.2 主要實驗方法
1.2.1 肽庫消減富集生物淘篩(Biopanning) 復(fù)蘇宿主菌ER2738進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng), 按照試劑盒Ph.D-12說明書提供的實驗步驟滴定Ph.D-12文庫, 然后以EpCAM為靶點, 按照本實驗室改良的Biopanning程序[2,19], 將EpCAM純化蛋白(100 μg/mL)以及pH8.4的碳酸氫鈉溶液, 以每孔100 μL包被于96孔板, 于4 °C孵育過夜。為使陽性克隆得到更好的富集, 進(jìn)行5輪Biopanning并隨機(jī)挑選若干噬菌體克隆, 再以ELISA進(jìn)一步篩選陽性噬菌體克隆。
1.2.2 酶聯(lián)免疫實驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 使用常規(guī)96孔板法, 用ELX800全自動酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-TEK, Los Angeles, CA)進(jìn)行檢測, 把EpCAM的D值記為P, BSA的D值記為N。以P/N的A450比值≥2.1為陽性界定標(biāo)準(zhǔn), 比值≤1.5界定為陰性。
1.2.3 噬菌體克隆測序 將ELISA法篩選的陽性克隆送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序, 獲得各克隆的十二肽序并通過分析獲得共有序列 (consensus sequence)。
1.2.4 EpCAM的網(wǎng)絡(luò)分析 為進(jìn)一步確認(rèn)篩選得到的陽性噬菌體克隆與EpCAM在細(xì)胞水平的靶向性, 通過CCLE數(shù)據(jù)庫(https://portals.broadinstitute.org/)對EpCAM在多種癌癥中的表達(dá)情況進(jìn)行分析, 從而選擇合適的細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞層面的驗證。
1.2.5 細(xì)胞免疫熒光法
(1) 細(xì)胞爬片。取滅過菌的規(guī)格為5 mm×5 mm的蓋玻片, 將其置于30 mm的培養(yǎng)皿中, 取處于指數(shù)期且生長狀況良好的人胚腎細(xì)胞HEK293、乳腺癌細(xì)胞MCF-7以及肝癌細(xì)胞HepG2進(jìn)行傳代并計數(shù), 將5×105個/mL的細(xì)胞懸液接種至30 mm的培養(yǎng)皿中, 每皿加2 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基, 于5% CO2、37 °C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。
(2) 陽性噬菌體克隆對細(xì)胞表面EpCAM的親和力分析。將MCF7細(xì)胞、HEK293細(xì)胞和HepG2細(xì)胞接種至30 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中, 長滿單層后用PBS洗滌3次, 4%多聚甲醛固定30 min, 再次洗滌3次后加入1 mL 1% BSA, 于37 °C恒溫培養(yǎng)箱中封閉30 min。棄封閉液, 分別加入陽性噬菌體克隆(1×1012 pfu), 每個克隆1皿, 于37 °C恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h。洗滌后加入鼠抗M13多克隆抗體(工作濃度1:1 000), 于4 °C中過夜孵育。次日以PBS洗滌3次后滴加FITC標(biāo)記的山羊抗鼠多克隆抗體(工作濃度1:500), 37 °C避光孵育30 min。PBS洗滌3次后加入DAPI染液, 37 °C避光孵育15 min。PBS再次洗滌后用90%的甘油封片, 于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。
1.2.6 最佳克隆序列與EpCAM的分子對接(dock-ing) 通過SWISS-PDB viewer(v4.1)軟件預(yù)測最佳克隆的肽序空間結(jié)構(gòu), 然后從PDB主頁下載EpCAM的PDB模板文件, 最后利用AutoDock Vina軟件(v4.2)將EpCAM與最佳克隆的肽序進(jìn)行分子docking, 從分子空間構(gòu)型模擬及docking參數(shù)多角度分析該多肽序列與EpCAM分子的靶向親和力。
2 結(jié)果
2.1 經(jīng)過5輪Biopanning, EpCAM靶向克隆明顯富集擴(kuò)增
噬菌體肽庫滴定的結(jié)果為1.6×1013 pfu/mL, 首輪投入10 μL噬菌體/孔, 通過5輪“吸附→洗脫→富集”篩選, 得到五級洗脫的肽庫, 計算每輪的產(chǎn)出與投入比, 結(jié)果(表1和圖1)顯示了良好的EpCAM靶向噬菌體的消減富集。
2.2 獲得了足夠數(shù)量的陽性噬菌體克隆
對第5輪篩選的洗脫肽庫進(jìn)行LB/IPTG/Xgal鋪板顯色, 并隨機(jī)挑選了47個克隆進(jìn)行擴(kuò)增純化, 利用ELISA方法, 按照陽性克隆界定標(biāo)準(zhǔn)共獲得了30個陽性克隆, 對它們進(jìn)一步的ELISA確認(rèn)結(jié)果如圖2所示。
結(jié)果確認(rèn)了30個陽性克隆與EpCAM的結(jié)合力, 其中R8克隆結(jié)合能力最強(qiáng)。對30個陽性克隆及對照克隆進(jìn)行測序, 結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)了由23個克隆組成的5個共有序列群如表2所示。
2.3 陽性克隆及最佳克隆對細(xì)胞EpCAM具有敏感的特異結(jié)合特性
2.3.1 網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn) EpCAM在常見癌細(xì)胞 /組織表達(dá)水平有明顯差異
CCLE數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)EpCAM在常見癌癥的表達(dá)情況 : EpCAM在乳腺癌、肺癌、食管癌、結(jié)直腸癌中表達(dá)較高, 而在肝癌、黑色素瘤、膠質(zhì)瘤、淋巴瘤等癌癥中表達(dá)較低(圖3)。
2.3.2 R8克隆顯示了最佳的細(xì)胞EpCAM特異性結(jié)合力 EpCAM是CSC細(xì)胞表面重要的標(biāo)志物, 而CSC無論是在癌組織還是培養(yǎng)的癌細(xì)胞里都是極少數(shù)的, 上述數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示, 乳腺癌細(xì)胞中EpCAM表達(dá)水平相對較高(圖3)。所以, 本研究將EpCAM表達(dá)水平較高的乳腺癌細(xì)胞 MCF-7、EpCAM, 表達(dá)水平較低的肝癌細(xì)胞HepG2和非癌細(xì)胞HEK293進(jìn)行了細(xì)胞水平的噬菌體克隆結(jié)合特異性和敏感性的篩選鑒定。
在通過ELISA篩選的5個共有序列克隆群中, 每群選取一個P/N值最高的克隆R8(ESP1)、R5(ESP2)、R16(ESP3)、R15(ESP4)、R25(ESP5)做細(xì)胞免疫熒光實驗, 進(jìn)一步驗證其與EpCAM在細(xì)胞水平上的結(jié)合特異性和敏感性, 結(jié)果顯示, R8克隆(ESP1序列)與MCF-7細(xì)胞中EpCAM表達(dá)細(xì)胞(CSC細(xì)胞)的結(jié)合敏感性強(qiáng)于其他克隆(圖4A)。將圖4A中各克隆與MCF-7細(xì)胞中EpCAM表達(dá)細(xì)胞的檢測結(jié)果局部放大觀察, 結(jié)果顯示, R8克隆與EpCAM的靶向特異性、敏感性最強(qiáng)(圖4B)。
通過以上鑒定, 確定R8代表的ESP1多肽序列為最佳EpCAM靶向序列。
2.4 ESP1序列與EpCAM具有良好的分子模擬對接效應(yīng)
為了進(jìn)一步確認(rèn)最佳克隆序列與EpCAM的親和力, 通過Autodock Vina軟件對兩者的親和力進(jìn)行了Docking模擬測試, 結(jié)果顯示, ESP1序列與EpCAM分子在空間構(gòu)型的多個角度都具有良好的對接效應(yīng)(圖5)和表3。
3 討論
癌化療藥物缺乏靶向性或者靶向性不足導(dǎo)致癌化療效果不佳是目前癌癥臨床遇到的主要瓶頸問題之一[28-29], 而癌干細(xì)胞(CSC)是導(dǎo)致癌癥增生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的重要癌細(xì)胞群, 目前學(xué)界共識是化療應(yīng)盡可能地殺滅CSC[14-15]。EpCAM是CSC表面重要的標(biāo)志性分子之一, 可能與癌的侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性表型的產(chǎn)生有密切關(guān)系, 可以作為CSC的靶向標(biāo)志物[14-15]。多肽分子具有低毒、分子量小、低免疫原性、結(jié)構(gòu)簡單、對腫瘤的高滲透性及易于被修飾等特點, 是被寄以厚望的癌靶向?qū)蛟x擇[16-19], 多肽可以與納米材料、納米藥物等偶聯(lián)而賦予其癌細(xì)胞/組織靶向特性從而進(jìn)行腫瘤的靶向遞送和治療[30-33]。靶向多肽還可以被熒光素、同位素等標(biāo)記而成為特異性探針, 用于癌癥的早期分子影像診斷, 對于“早發(fā)現(xiàn)、早治療”的癌防治策略具有重要意義[34]。但這些都取決于特異、敏感的多肽片段的獲得。
本研究以EpCAM為Biopanning的靶分子, 從NEB12肽庫以改良的Biopanning流程進(jìn)行了5輪消減富集篩選, 以ELISA方法從末輪富集庫隨機(jī)挑選的47個克隆中鑒定了30個陽性克隆(圖2), 通過測序獲得了5條共有序列(ESP1、ESP2、ESP3、ESP4、ESP5)(表2)。
CSC無論是在癌組織還是培養(yǎng)的癌細(xì)胞里都是極少數(shù), 其標(biāo)志物EpCAM在各種癌細(xì)胞/組織中的表達(dá)水平差異較大, 在乳腺癌細(xì)胞/組織中表達(dá)水平較高(圖3), 所以本研究選用EpCAM表達(dá)水平較高的乳腺癌細(xì)胞MCF-7和表達(dá)水平較低的肝癌細(xì)胞HepG2以及非癌細(xì)胞HEK293, 通過細(xì)胞免疫熒光實驗檢測了5個共有序列對乳腺癌細(xì)胞CSC細(xì)胞EpCAM的結(jié)合特異性和敏感性, 發(fā)現(xiàn)ESP1(R8)、ESP5(R25)序列對EpCAM高表達(dá)細(xì)胞(CSC細(xì)胞)具有明顯的結(jié)合特異性和敏感性(圖4A), 把5個共有序列克隆對MCF-7的檢測結(jié)果進(jìn)行放大處理的結(jié)果(圖4B)顯示ESP1(R8)序列的特異性和敏感性明顯強(qiáng)于ESP5(R25), 從而確定其為最佳EpCAM靶向12肽序列。
以分子空間模擬構(gòu)型的對接(docking)對ESP1與EpCAM的靶向親和力進(jìn)行的分析顯示, ESP1肽序列在EpCAM分子不同空間構(gòu)型角度都對EpCAM具有良好的靶向結(jié)合力(圖5)。
以上研究結(jié)果充分顯示了多肽序列 ESP1的EpCAM也即CSC的靶向結(jié)合特異性和敏感性, 這些特點賦予了ESP1在未來新型癌靶向化療藥物研發(fā)方面重要的使用價值, 通過對CSC的靶向殺傷, 有可能達(dá)到改善癌化療效果、降低癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的目標(biāo)。
4 結(jié)論
本文以EpCAM為Biopanning靶分子, 從噬菌體12肽庫篩選、鑒定獲得了對CSC細(xì)胞EpCAM具有良好靶向特異性和敏感性的12肽序列ESP1, 細(xì)胞水平的檢測和分子空間構(gòu)型的模擬預(yù)測都證實了該多肽片段對CSC細(xì)胞EpCAM具有良好靶向性。該研究結(jié)果為未來高效、低毒、抗復(fù)發(fā)的新型癌癥靶向化療藥物的研發(fā)提供了一個重要的靶向元件選擇。
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