摘要：對水產(chǎn)加工過程中的魚皮廢棄物進(jìn)行深加工處理，對其高附加值利用可以變廢為寶，減少環(huán)境污染；魚皮來源生物活性肽具有抗氧化、抗高血壓、抗菌等功效。對魚皮廢棄物中生物活性肽的提取、分離鑒定方法及其功能活性進(jìn)行深入探討，可為食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥品和化工產(chǎn)品等相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。本文綜述了酶法、化學(xué)法及發(fā)酵法提取魚皮來源生物活性肽的優(yōu)缺點(diǎn)，酶法相對于化學(xué)法應(yīng)用廣泛，獲得的生物活性肽活性高，發(fā)酵法成本低，適用于批量生產(chǎn)。歸納總結(jié)了超濾、納濾、凝膠過濾、離子交換和高效液相色譜及質(zhì)譜聯(lián)用等魚皮生物活性肽的分離純化和鑒定方法，多種分離、鑒定方法相結(jié)合來獲取具有特定功能活性的魚皮生物活性肽是首選，但獲得高純度及高活性的目標(biāo)產(chǎn)物仍是當(dāng)前亟待突破的難點(diǎn)。此外，分析了魚皮生物活性肽在抗氧化性、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme, ACE）抑制活性、抗菌性及其他生物活性的研究現(xiàn)狀，歸納了功能活性與肽的分子量大小、肽序列結(jié)構(gòu)及位置的構(gòu)效關(guān)系。最后展望了生物活性肽在功能活性研發(fā)方面的不足之處及進(jìn)一步研究的方向，以期可為魚類加工業(yè)打造高值化利用功能性產(chǎn)品提供參考。
我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，每年水產(chǎn)加工產(chǎn)生的魚皮、魚鱗和魚骨等下腳料高達(dá)250萬噸，其中，魚皮價(jià)格低廉，在水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物中占主導(dǎo)，約占魚類加工總量的7%-8%。目前，僅加工成魚飼料等低值化產(chǎn)品或者掩埋丟棄的方式處理魚皮等加工副產(chǎn)物，不僅造成資源浪費(fèi)，甚至可直接導(dǎo)致環(huán)境污染[1]。與陸生動(dòng)物性副產(chǎn)物資源相比，魚皮來源廣泛、易于加工、生物安全性高[2]。魚皮中蛋白質(zhì)含量豐富，可通過蛋白酶水解法、化學(xué)法或微生物發(fā)酵法等生產(chǎn)功能性生物活性肽[3]。由于肽的生物活性與其氨基酸組成及序列密切相關(guān)，不同的提取方法得到的產(chǎn)物功能活性不一[4]。魚皮生物活性肽豐富的疏水性氨基酸，使其具有一定的抗氧化性[5]、ACE抑制活性[6-7]。此外，魚皮生物活性肽還具有抗菌[8]、免疫調(diào)節(jié)[9]、抗癌[10]等功效。魚皮生物活性肽一般含有2-20個(gè)氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量低于6 000 Da，屬于小分子肽。由于小分子肽更能抵抗內(nèi)源性消化酶的水解，與氨基酸和蛋白質(zhì)相比具有更高的生物可利用性[11]。因此，對水產(chǎn)加工產(chǎn)生的魚皮廢棄物中生物活性肽的提取、分離鑒定方法及其功能活性進(jìn)行深入探討，不僅有助于以之為基礎(chǔ)的新功能食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥品和化工產(chǎn)品等的開發(fā)，提高其附加值，而且能將其變廢為寶，減少環(huán)境的污染，為魚類水產(chǎn)加工業(yè)的發(fā)展提供更加廣闊的前景。
基于此，本文對近年來國內(nèi)外魚皮來源生物活性肽的提取、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其功能活性等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行全面介紹，重點(diǎn)介紹生物活性肽在抗氧化性、ACE抑制活性、抗菌性、免疫調(diào)節(jié)性、神經(jīng)保護(hù)活性與肽結(jié)構(gòu)的構(gòu)效關(guān)系，以期為我國水產(chǎn)魚皮廢棄物高值化功能性產(chǎn)品的深入打造提供理論指導(dǎo)和有力借鑒。
1 魚皮生物活性肽的提取
酶法是指蛋白質(zhì)在一定條件（溫度、pH、酶濃度等）下水解生成肽的方法。酶法生產(chǎn)條件溫和、安全、過程容易，反應(yīng)過程可以控制，且不會破壞蛋白質(zhì)中的氨基酸，目前在膠原蛋白肽制備中得到廣泛應(yīng)用[12-13]。酶法步驟包括材料前處理、蛋白酶的選擇、水解度的測定、均質(zhì)和加熱滅活蛋白酶等[16]。常用的商業(yè)化蛋白酶主要有堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶等[17-18]。
酶法提取魚皮生物活性肽既可采用單一蛋白酶進(jìn)行，也可采用復(fù)合蛋白酶或分步酶解法配合進(jìn)行。酶的最適反應(yīng)濃度、pH值和溫度均因酶的種類不同而有所差異，酶濃度（0.001%-0.005%，W/W）、pH值（1.5-11）和溫度（35℃-60℃）是常用的制備條件[19]。秦倩倩等[20]以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH·）清除率為指標(biāo)，從5種蛋白酶中篩選出堿性蛋白酶為草魚皮膠原蛋白的最佳水解酶；通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken中心組合試驗(yàn)優(yōu)化，得出最優(yōu)酶解條件為酶解時(shí)間3.0 h，酶解溫度46.5℃，用酶量7 025.2 U/g；在此條件下，酶解產(chǎn)物對DPPH·清除率達(dá)78.3%。此外，Himaya等[21]采用分步酶解法水解太平洋鱈魚（Gadus macrocephalus）皮，采用胃蛋白酶水解魚皮，再采用胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶雙酶法酶解，最終得到相對分子量為1 301 Da的寡肽，該酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的ACE抑制活性。
為了提高酶解產(chǎn)率，需優(yōu)化蛋白酶的水解條件，如蛋白酶用量、水解pH值和溫度等[22]。靳書杰[23]以日本黃姑魚（Nibea japonicus）魚皮為原料，分別采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶對其進(jìn)行酶解，以DPPH·清除率為評價(jià)指標(biāo)，結(jié)果顯示中性蛋白酶酶解產(chǎn)物DPPH·清除能力最大，而后選取中性蛋白酶為最優(yōu)酶，再進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化得到其最優(yōu)水解條件為酶解時(shí)間5 h、加酶量1 500 U/g、料液比1∶6、酶解溫度45℃和pH 7.0。
綜上所述，為了提高酶解生物活性肽的提取效率，首先應(yīng)選擇合適的蛋白酶或者復(fù)合蛋白酶水解魚皮，并對蛋白酶的水解條件進(jìn)行優(yōu)化，提高蛋白酶的水解效率。
化學(xué)法包括酸法、堿法提取或者酸堿法混合提取，是通過強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿水解蛋白質(zhì)使肽鍵斷裂的方法。魚皮被堿水解后，特定的氨基酸，如色氨酸、絲氨酸和蘇氨酸會被強(qiáng)堿破壞，因此在水解的過程必須嚴(yán)格控制反應(yīng)pH和溫度[4]。生物活性肽通過酸法、堿法提取的一般步驟包括：用堿液（一般為NaOH）對魚皮進(jìn)行前處理，并在一定的溫度下攪拌一定的時(shí)間。重復(fù)3遍堿處理除去非蛋白物質(zhì)和色素等雜質(zhì)后，反復(fù)用酸液（一般為HCl，也可以是醋酸）處理。在酸、堿處理后，用蒸餾水將魚皮洗滌至中性，溶解于蒸餾水中65℃保持4 h。有些研究提取步驟還包括脫脂，如Jongjareonrak等[24]采用正丁醇脫脂處理24-48 h，每8 h換液一次，上清液用醋酸溶解并溫和攪拌24 h，通過脫脂處理可以提高活性肽的純度。上述步驟得到蛋白質(zhì)水解物后，采用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿使蛋白質(zhì)水解為生物活性肽。提取條件為6-12 mol/L HCl或者4 mol/L H2SO4、100-200℃，水解12-24 h；或者6 mol/L的NaOH或2 mol/L的Ba（OH）2、水解6 h，然后經(jīng)活性炭脫色，再通過701型樹脂除去酸和鹽[25]。Cole等[26]從比目魚（Pleuronectes americanus）表皮和黏液提取物中得到抗菌肽，從皮膚上刮取黏液，加入50 mL 0.2 mol/L Na2Ac，0.2% Triton X-100, 1 mmol/L苯基甲基磺酰氟，均質(zhì)，勻漿，再以20 000×g離心20 min，將上清液進(jìn)一步純化，得到含有25個(gè)氨基酸殘基的抗菌肽，其氨基酸序列為：GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALTHY。
化學(xué)法具有操作簡便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但是相比于酶法提取，該法存在一定的不足：反應(yīng)過程難以控制，會引入有毒化學(xué)物質(zhì)，還會破壞特定的氨基酸結(jié)構(gòu)，如色氨酸、絲氨酸和蘇氨酸[27]；同時(shí)，由于化學(xué)試劑裂解多肽化學(xué)鍵不具有特異性，導(dǎo)致化學(xué)法制備生物活性肽難以復(fù)制；水解產(chǎn)物成分復(fù)雜，應(yīng)用范圍受限等。因此酶法比化學(xué)法應(yīng)用更廣泛。
發(fā)酵法是利用微生物菌種在生長繁殖代謝過程中產(chǎn)生的蛋白酶來水解蛋白質(zhì)底物制備生物活性肽的方法。該法可有效回收或?qū)⑹称忿D(zhuǎn)化為酶、有機(jī)酸等高價(jià)值產(chǎn)品[28]。在發(fā)酵的過程中，生物活性肽在微生物和內(nèi)源性蛋白酶水解的過程中被釋放出來。
目前，用于發(fā)酵法制備生物活性肽的菌種主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、曲霉菌（Aspergillus）以及乳酸菌（Lactic acid bacteria）等[29]。Jemil等[30]通過一種蛋白水解菌枯草芽孢桿菌（B. subtilis）A26發(fā)酵幾種魚類蛋白質(zhì)，生產(chǎn)蛋白質(zhì)水解物。在發(fā)酵過程中，魚皮蛋白質(zhì)釋放出的一些生物肽和氨基酸在蛋白質(zhì)水解酶的作用下，可被菌株用作碳氮基質(zhì)增長。吳海濱[31]利用米曲霉（Aspergillus oryzae）發(fā)酵鱈魚皮制備生物活性膚，對米曲霉的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇最優(yōu)條件進(jìn)行活性肽發(fā)酵，分離得到較強(qiáng)抗氧化性和ACE抑制活性的肽。邢瀚文等[32]以羅非魚（Oreochromis niloticus）魚皮為原料，利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵（solid-state fermentation，SSF）制備膠原蛋白肽，發(fā)酵活性肽中含有7種必需氨基酸，分子量小于5 000 Da的肽段抗氧化性最強(qiáng)，清除羥基自由基（hydroxyl free radical，·OH）、超氧陰離子自由基（·O2-）和DPPH·的IC50值分別為3.83、4.19和2.37 mg/mL，且具有較好的還原力。
發(fā)酵法的酶水解由微生物蛋白酶進(jìn)行，生物活性肽無需進(jìn)一步水解就可直接分離獲得。相比其他方法，發(fā)酵法操作較為簡便，成本較低，適合批量生產(chǎn)，并且可以增加產(chǎn)物風(fēng)味、去腥。但是相比于酶法，發(fā)酵法的效率低，產(chǎn)物純化比較困難，部分產(chǎn)酶菌株可能會對機(jī)體產(chǎn)生一定的毒害作用、安全性低等限制了發(fā)酵法的廣泛應(yīng)用[15]，因而安全高效的發(fā)酵菌株的獲得及選擇顯得至關(guān)重要。
2 魚皮生物活性肽的分離鑒定
雖然當(dāng)前已有大量的生物活性肽分離鑒定方法，但探索可獲得高純度及高活性的目標(biāo)產(chǎn)物仍是當(dāng)前迫切需要突破的難點(diǎn)。目前我國魚皮生物活性肽的研究發(fā)展非常迅猛，開發(fā)出高效且精準(zhǔn)的魚皮生物活性肽分離鑒定技術(shù)，可推動(dòng)魚皮生物活性肽的健康有序發(fā)展[44]。
3 魚皮生物活性肽的功能活性
從以上結(jié)果可以看出，魚皮來源抗氧化肽分子量大部分小于1 000 Da，且大部分含有疏水性氨基酸，如丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和賴氨酸（Lys）。魚皮膠原蛋白中含有豐富的抗氧化活性肽，是理想的抗氧化活性肽的來源之一，有望應(yīng)用在藥品、化妝品和食品中。不過，未來的研究方向應(yīng)該是魚皮生物活性肽在體內(nèi)的實(shí)際應(yīng)用效果。
血管緊張素轉(zhuǎn)化酶ACE（EC 3.4.15.1）是一種金屬二肽酶，它在血壓的調(diào)整上具有必不可少的作用。ACE是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的一部分，可以將血管緊張素I（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu）從C末端切除His-Leu，轉(zhuǎn)化成血管緊張素II（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe），而血管緊張素II可以使小動(dòng)脈收縮和加速心臟搏動(dòng)導(dǎo)致血壓升高。另一方面，ACE也是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）的重要組成部分，它可以催化緩解激肽成為失活片段，從而加速機(jī)體血壓升高。因此，ACE抑制劑可以起到降低血壓的作用[57]。由于傳統(tǒng)的抗血壓藥物會引起一定的副作用，因此，尋找天然安全的具有抗血壓活性的生物活性肽成為研究的熱點(diǎn)。
ACE抑制活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系尚未確定，但有研究報(bào)道，大部分ACE抑制肽包含脯氨酸、賴氨酸或芳香族氨基酸，且受肽鏈C端的氨基酸序列影響，尤其是當(dāng)肽鏈C端為脯氨酸等疏水性氨基酸時(shí)，ACE抑制活性更強(qiáng)[58]。ACE抑制活性的檢測方法主要有分光光度法、RP-HPLC法[59]、熒光法[60]和毛細(xì)血管電泳法（CE）。其中，分光光度法和毛細(xì)血管電泳法主要原理都是ACE通過水解底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu hydrate, HHL）產(chǎn)生馬尿酸（HA）的量來確定ACE抑制率，抑制率大小一般通過半抑制濃度（IC50）表示。RP-HPLC法采用C18柱檢測HA的成分，雖然省去了萃取HA的步驟，但需要消耗大量的流動(dòng)相，對樣品量多的情況不適用。
由于人體內(nèi)腸道與體外的環(huán)境條件不同，因此要想了解ACE抑制肽在人體內(nèi)的實(shí)際效果，需首先建立一套模擬體內(nèi)消化系統(tǒng)的研究方法。一方面，未來的主流研究方向可能是基于電子計(jì)算機(jī)信息系統(tǒng)輔助建立腸胃消化酶系統(tǒng)模擬研究模型；另一方面，未來ACE抑制肽研究應(yīng)重點(diǎn)在其對腸胃消化酶的抑制活性以及細(xì)胞的可行性等方面[57]。
魚類生活環(huán)境一般都有大量致病微生物，它們經(jīng)常會直接接觸潛在的病原體。魚皮可直接為魚提供天然的物理屏障保護(hù)，也可通過天然免疫因子如抑菌肽（AMPs）作為化學(xué)保護(hù)屏障來間接保護(hù)自己[63]。AMPs的生物活性在很大程度上與其電荷、螺旋度、疏水性及序列等物理化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)[64]。
綜上可知，部分魚皮來源的多肽具有一定的抗菌性，其抗菌性強(qiáng)弱與肽的序列、結(jié)構(gòu)、大小密切相關(guān)，將來有望應(yīng)用在食品保藏和化妝品生產(chǎn)等領(lǐng)域。
4 總結(jié)與展望
通過酶法、化學(xué)法及發(fā)酵法等進(jìn)行提取，進(jìn)而利用超濾、HPLC、質(zhì)譜等對提取物進(jìn)行分離純化及鑒定，可以獲得廣泛功能的魚皮來源生物活性肽，如抗氧化性、抗血壓性、抗菌性和免疫調(diào)節(jié)性等。目前，圍繞魚皮來源生物活性肽功能活性的研究主要包括以下3個(gè)方面：（1）對不同種類魚皮來源活性肽進(jìn)行工藝提取研究，并優(yōu)化提取效率和產(chǎn)物質(zhì)量；（2）分離鑒定方法的創(chuàng)新；（3）活性肽的結(jié)構(gòu)與功能活性如抗氧化性、ACE抑制性及抗菌性等作用的關(guān)聯(lián)機(jī)制研究。
綜上所述，今后魚皮生物活性肽研究應(yīng)著重在如下方面：探索高效安全的提取方法，提高提取效率；開發(fā)安全高效的發(fā)酵菌株；利用現(xiàn)代化信息技術(shù)，開發(fā)高效、精準(zhǔn)的分離、純化及鑒定技術(shù)，提高活性肽的活性和利用率；開展功能活性人體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探明活性肽的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)聯(lián)機(jī)制；抗氧化肽的潛在免疫調(diào)節(jié)活性，即抗炎、抗過敏和調(diào)節(jié)細(xì)胞的信號通路等值得進(jìn)一步關(guān)注。另外，當(dāng)前關(guān)注較少的生物活性如免疫調(diào)節(jié)性、神經(jīng)保護(hù)作用、抗癌性等方面值得進(jìn)一步細(xì)致全面地探索，如對阿爾茨海默癥中觀察到的β相關(guān)神經(jīng)毒素性疾病的神經(jīng)保護(hù)作用等。
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