摘要：對水產(chǎn)加工過程中的魚皮廢棄物進行深加工處理，對其高附加值利用可以變廢為寶，減少環(huán)境污染；魚皮來源生物活性肽具有抗氧化、抗高血壓、抗菌等功效。對魚皮廢棄物中生物活性肽的提取、分離鑒定方法及其功能活性進行深入探討，可為食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥品和化工產(chǎn)品等相關產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎。本文綜述了酶法、化學法及發(fā)酵法提取魚皮來源生物活性肽的優(yōu)缺點，酶法相對于化學法應用廣泛，獲得的生物活性肽活性高，發(fā)酵法成本低，適用于批量生產(chǎn)。歸納總結了超濾、納濾、凝膠過濾、離子交換和高效液相色譜及質(zhì)譜聯(lián)用等魚皮生物活性肽的分離純化和鑒定方法，多種分離、鑒定方法相結合來獲取具有特定功能活性的魚皮生物活性肽是首選，但獲得高純度及高活性的目標產(chǎn)物仍是當前亟待突破的難點。此外，分析了魚皮生物活性肽在抗氧化性、血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme, ACE）抑制活性、抗菌性及其他生物活性的研究現(xiàn)狀，歸納了功能活性與肽的分子量大小、肽序列結構及位置的構效關系。最后展望了生物活性肽在功能活性研發(fā)方面的不足之處及進一步研究的方向，以期可為魚類加工業(yè)打造高值化利用功能性產(chǎn)品提供參考。
我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，每年水產(chǎn)加工產(chǎn)生的魚皮、魚鱗和魚骨等下腳料高達250萬噸，其中，魚皮價格低廉，在水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物中占主導，約占魚類加工總量的7%-8%。目前，僅加工成魚飼料等低值化產(chǎn)品或者掩埋丟棄的方式處理魚皮等加工副產(chǎn)物，不僅造成資源浪費，甚至可直接導致環(huán)境污染[1]。與陸生動物性副產(chǎn)物資源相比，魚皮來源廣泛、易于加工、生物安全性高[2]。魚皮中蛋白質(zhì)含量豐富，可通過蛋白酶水解法、化學法或微生物發(fā)酵法等生產(chǎn)功能性生物活性肽[3]。由于肽的生物活性與其氨基酸組成及序列密切相關，不同的提取方法得到的產(chǎn)物功能活性不一[4]。魚皮生物活性肽豐富的疏水性氨基酸，使其具有一定的抗氧化性[5]、ACE抑制活性[6-7]。此外，魚皮生物活性肽還具有抗菌[8]、免疫調(diào)節(jié)[9]、抗癌[10]等功效。魚皮生物活性肽一般含有2-20個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量低于6 000 Da，屬于小分子肽。由于小分子肽更能抵抗內(nèi)源性消化酶的水解，與氨基酸和蛋白質(zhì)相比具有更高的生物可利用性[11]。因此，對水產(chǎn)加工產(chǎn)生的魚皮廢棄物中生物活性肽的提取、分離鑒定方法及其功能活性進行深入探討，不僅有助于以之為基礎的新功能食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥品和化工產(chǎn)品等的開發(fā)，提高其附加值，而且能將其變廢為寶，減少環(huán)境的污染，為魚類水產(chǎn)加工業(yè)的發(fā)展提供更加廣闊的前景。
基于此，本文對近年來國內(nèi)外魚皮來源生物活性肽的提取、分離純化、結構鑒定及其功能活性等方面的研究進展進行全面介紹，重點介紹生物活性肽在抗氧化性、ACE抑制活性、抗菌性、免疫調(diào)節(jié)性、神經(jīng)保護活性與肽結構的構效關系，以期為我國水產(chǎn)魚皮廢棄物高值化功能性產(chǎn)品的深入打造提供理論指導和有力借鑒。
1 魚皮生物活性肽的提取
酶法是指蛋白質(zhì)在一定條件（溫度、pH、酶濃度等）下水解生成肽的方法。酶法生產(chǎn)條件溫和、安全、過程容易，反應過程可以控制，且不會破壞蛋白質(zhì)中的氨基酸，目前在膠原蛋白肽制備中得到廣泛應用[12-13]。酶法步驟包括材料前處理、蛋白酶的選擇、水解度的測定、均質(zhì)和加熱滅活蛋白酶等[16]。常用的商業(yè)化蛋白酶主要有堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和復合蛋白酶等[17-18]。
酶法提取魚皮生物活性肽既可采用單一蛋白酶進行，也可采用復合蛋白酶或分步酶解法配合進行。酶的最適反應濃度、pH值和溫度均因酶的種類不同而有所差異，酶濃度（0.001%-0.005%，W/W）、pH值（1.5-11）和溫度（35℃-60℃）是常用的制備條件[19]。秦倩倩等[20]以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH·）清除率為指標，從5種蛋白酶中篩選出堿性蛋白酶為草魚皮膠原蛋白的最佳水解酶；通過Plackett-Burman試驗設計、最陡爬坡試驗和Box-Behnken中心組合試驗優(yōu)化，得出最優(yōu)酶解條件為酶解時間3.0 h，酶解溫度46.5℃，用酶量7 025.2 U/g；在此條件下，酶解產(chǎn)物對DPPH·清除率達78.3%。此外，Himaya等[21]采用分步酶解法水解太平洋鱈魚（Gadus macrocephalus）皮，采用胃蛋白酶水解魚皮，再采用胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶雙酶法酶解，最終得到相對分子量為1 301 Da的寡肽，該酶解產(chǎn)物具有較強的ACE抑制活性。
為了提高酶解產(chǎn)率，需優(yōu)化蛋白酶的水解條件，如蛋白酶用量、水解pH值和溫度等[22]。靳書杰[23]以日本黃姑魚（Nibea japonicus）魚皮為原料，分別采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶對其進行酶解，以DPPH·清除率為評價指標，結果顯示中性蛋白酶酶解產(chǎn)物DPPH·清除能力最大，而后選取中性蛋白酶為最優(yōu)酶，再進行單因素實驗，優(yōu)化得到其最優(yōu)水解條件為酶解時間5 h、加酶量1 500 U/g、料液比1∶6、酶解溫度45℃和pH 7.0。
綜上所述，為了提高酶解生物活性肽的提取效率，首先應選擇合適的蛋白酶或者復合蛋白酶水解魚皮，并對蛋白酶的水解條件進行優(yōu)化，提高蛋白酶的水解效率。
化學法包括酸法、堿法提取或者酸堿法混合提取，是通過強酸或者強堿水解蛋白質(zhì)使肽鍵斷裂的方法。魚皮被堿水解后，特定的氨基酸，如色氨酸、絲氨酸和蘇氨酸會被強堿破壞，因此在水解的過程必須嚴格控制反應pH和溫度[4]。生物活性肽通過酸法、堿法提取的一般步驟包括：用堿液（一般為NaOH）對魚皮進行前處理，并在一定的溫度下攪拌一定的時間。重復3遍堿處理除去非蛋白物質(zhì)和色素等雜質(zhì)后，反復用酸液（一般為HCl，也可以是醋酸）處理。在酸、堿處理后，用蒸餾水將魚皮洗滌至中性，溶解于蒸餾水中65℃保持4 h。有些研究提取步驟還包括脫脂，如Jongjareonrak等[24]采用正丁醇脫脂處理24-48 h，每8 h換液一次，上清液用醋酸溶解并溫和攪拌24 h，通過脫脂處理可以提高活性肽的純度。上述步驟得到蛋白質(zhì)水解物后，采用強酸、強堿使蛋白質(zhì)水解為生物活性肽。提取條件為6-12 mol/L HCl或者4 mol/L H2SO4、100-200℃，水解12-24 h；或者6 mol/L的NaOH或2 mol/L的Ba（OH）2、水解6 h，然后經(jīng)活性炭脫色，再通過701型樹脂除去酸和鹽[25]。Cole等[26]從比目魚（Pleuronectes americanus）表皮和黏液提取物中得到抗菌肽，從皮膚上刮取黏液，加入50 mL 0.2 mol/L Na2Ac，0.2% Triton X-100, 1 mmol/L苯基甲基磺酰氟，均質(zhì)，勻漿，再以20 000×g離心20 min，將上清液進一步純化，得到含有25個氨基酸殘基的抗菌肽，其氨基酸序列為：GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALTHY。
化學法具有操作簡便、成本低廉等優(yōu)點，但是相比于酶法提取，該法存在一定的不足：反應過程難以控制，會引入有毒化學物質(zhì)，還會破壞特定的氨基酸結構，如色氨酸、絲氨酸和蘇氨酸[27]；同時，由于化學試劑裂解多肽化學鍵不具有特異性，導致化學法制備生物活性肽難以復制；水解產(chǎn)物成分復雜，應用范圍受限等。因此酶法比化學法應用更廣泛。
發(fā)酵法是利用微生物菌種在生長繁殖代謝過程中產(chǎn)生的蛋白酶來水解蛋白質(zhì)底物制備生物活性肽的方法。該法可有效回收或?qū)⑹称忿D化為酶、有機酸等高價值產(chǎn)品[28]。在發(fā)酵的過程中，生物活性肽在微生物和內(nèi)源性蛋白酶水解的過程中被釋放出來。
目前，用于發(fā)酵法制備生物活性肽的菌種主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、曲霉菌（Aspergillus）以及乳酸菌（Lactic acid bacteria）等[29]。Jemil等[30]通過一種蛋白水解菌枯草芽孢桿菌（B. subtilis）A26發(fā)酵幾種魚類蛋白質(zhì)，生產(chǎn)蛋白質(zhì)水解物。在發(fā)酵過程中，魚皮蛋白質(zhì)釋放出的一些生物肽和氨基酸在蛋白質(zhì)水解酶的作用下，可被菌株用作碳氮基質(zhì)增長。吳海濱[31]利用米曲霉（Aspergillus oryzae）發(fā)酵鱈魚皮制備生物活性膚，對米曲霉的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，選擇最優(yōu)條件進行活性肽發(fā)酵，分離得到較強抗氧化性和ACE抑制活性的肽。邢瀚文等[32]以羅非魚（Oreochromis niloticus）魚皮為原料，利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵（solid-state fermentation，SSF）制備膠原蛋白肽，發(fā)酵活性肽中含有7種必需氨基酸，分子量小于5 000 Da的肽段抗氧化性最強，清除羥基自由基（hydroxyl free radical，·OH）、超氧陰離子自由基（·O2-）和DPPH·的IC50值分別為3.83、4.19和2.37 mg/mL，且具有較好的還原力。
發(fā)酵法的酶水解由微生物蛋白酶進行，生物活性肽無需進一步水解就可直接分離獲得。相比其他方法，發(fā)酵法操作較為簡便，成本較低，適合批量生產(chǎn)，并且可以增加產(chǎn)物風味、去腥。但是相比于酶法，發(fā)酵法的效率低，產(chǎn)物純化比較困難，部分產(chǎn)酶菌株可能會對機體產(chǎn)生一定的毒害作用、安全性低等限制了發(fā)酵法的廣泛應用[15]，因而安全高效的發(fā)酵菌株的獲得及選擇顯得至關重要。
2 魚皮生物活性肽的分離鑒定
雖然當前已有大量的生物活性肽分離鑒定方法，但探索可獲得高純度及高活性的目標產(chǎn)物仍是當前迫切需要突破的難點。目前我國魚皮生物活性肽的研究發(fā)展非常迅猛，開發(fā)出高效且精準的魚皮生物活性肽分離鑒定技術，可推動魚皮生物活性肽的健康有序發(fā)展[44]。
3 魚皮生物活性肽的功能活性
從以上結果可以看出，魚皮來源抗氧化肽分子量大部分小于1 000 Da，且大部分含有疏水性氨基酸，如丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和賴氨酸（Lys）。魚皮膠原蛋白中含有豐富的抗氧化活性肽，是理想的抗氧化活性肽的來源之一，有望應用在藥品、化妝品和食品中。不過，未來的研究方向應該是魚皮生物活性肽在體內(nèi)的實際應用效果。
血管緊張素轉化酶ACE（EC 3.4.15.1）是一種金屬二肽酶，它在血壓的調(diào)整上具有必不可少的作用。ACE是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的一部分，可以將血管緊張素I（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu）從C末端切除His-Leu，轉化成血管緊張素II（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe），而血管緊張素II可以使小動脈收縮和加速心臟搏動導致血壓升高。另一方面，ACE也是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）的重要組成部分，它可以催化緩解激肽成為失活片段，從而加速機體血壓升高。因此，ACE抑制劑可以起到降低血壓的作用[57]。由于傳統(tǒng)的抗血壓藥物會引起一定的副作用，因此，尋找天然安全的具有抗血壓活性的生物活性肽成為研究的熱點。
ACE抑制活性與結構的關系尚未確定，但有研究報道，大部分ACE抑制肽包含脯氨酸、賴氨酸或芳香族氨基酸，且受肽鏈C端的氨基酸序列影響，尤其是當肽鏈C端為脯氨酸等疏水性氨基酸時，ACE抑制活性更強[58]。ACE抑制活性的檢測方法主要有分光光度法、RP-HPLC法[59]、熒光法[60]和毛細血管電泳法（CE）。其中，分光光度法和毛細血管電泳法主要原理都是ACE通過水解底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu hydrate, HHL）產(chǎn)生馬尿酸（HA）的量來確定ACE抑制率，抑制率大小一般通過半抑制濃度（IC50）表示。RP-HPLC法采用C18柱檢測HA的成分，雖然省去了萃取HA的步驟，但需要消耗大量的流動相，對樣品量多的情況不適用。
由于人體內(nèi)腸道與體外的環(huán)境條件不同，因此要想了解ACE抑制肽在人體內(nèi)的實際效果，需首先建立一套模擬體內(nèi)消化系統(tǒng)的研究方法。一方面，未來的主流研究方向可能是基于電子計算機信息系統(tǒng)輔助建立腸胃消化酶系統(tǒng)模擬研究模型；另一方面，未來ACE抑制肽研究應重點在其對腸胃消化酶的抑制活性以及細胞的可行性等方面[57]。
魚類生活環(huán)境一般都有大量致病微生物，它們經(jīng)常會直接接觸潛在的病原體。魚皮可直接為魚提供天然的物理屏障保護，也可通過天然免疫因子如抑菌肽（AMPs）作為化學保護屏障來間接保護自己[63]。AMPs的生物活性在很大程度上與其電荷、螺旋度、疏水性及序列等物理化學結構有關[64]。
綜上可知，部分魚皮來源的多肽具有一定的抗菌性，其抗菌性強弱與肽的序列、結構、大小密切相關，將來有望應用在食品保藏和化妝品生產(chǎn)等領域。
4 總結與展望
通過酶法、化學法及發(fā)酵法等進行提取，進而利用超濾、HPLC、質(zhì)譜等對提取物進行分離純化及鑒定，可以獲得廣泛功能的魚皮來源生物活性肽，如抗氧化性、抗血壓性、抗菌性和免疫調(diào)節(jié)性等。目前，圍繞魚皮來源生物活性肽功能活性的研究主要包括以下3個方面：（1）對不同種類魚皮來源活性肽進行工藝提取研究，并優(yōu)化提取效率和產(chǎn)物質(zhì)量；（2）分離鑒定方法的創(chuàng)新；（3）活性肽的結構與功能活性如抗氧化性、ACE抑制性及抗菌性等作用的關聯(lián)機制研究。
綜上所述，今后魚皮生物活性肽研究應著重在如下方面：探索高效安全的提取方法，提高提取效率；開發(fā)安全高效的發(fā)酵菌株；利用現(xiàn)代化信息技術，開發(fā)高效、精準的分離、純化及鑒定技術，提高活性肽的活性和利用率；開展功能活性人體內(nèi)實驗，探明活性肽的結構與活性關聯(lián)機制；抗氧化肽的潛在免疫調(diào)節(jié)活性，即抗炎、抗過敏和調(diào)節(jié)細胞的信號通路等值得進一步關注。另外，當前關注較少的生物活性如免疫調(diào)節(jié)性、神經(jīng)保護作用、抗癌性等方面值得進一步細致全面地探索，如對阿爾茨海默癥中觀察到的β相關神經(jīng)毒素性疾病的神經(jīng)保護作用等。
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