[摘要] 目的 合成能夠與碳酸酐酶9(carbonic anhydrase Ⅸ，CAⅨ)蛋白多糖區(qū)特異性結(jié)合的多肽分子(proteoglycan-like region peptide, PGLR-P1), 并初步探討其在體外的尋靶能力。方法 通過化學(xué)固相合成法合成多肽分子，對(duì)其純度和相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行分析，并初步探討其與CAⅨ蛋白、表達(dá)CAⅨ的腫瘤細(xì)胞和相應(yīng)移植瘤組織的結(jié)合能力以及攜載多肽的靶向納米泡的體外尋靶能力。結(jié)果 合成的多肽分子純度高于98%，相對(duì)分子質(zhì)量(1 722.2±0.4)，其能與CAⅨ蛋白、表達(dá)CAⅨ的腫瘤細(xì)胞及相應(yīng)移植瘤組織發(fā)生特異性靶向結(jié)合，且攜載多肽的靶向納米泡特異性靶向結(jié)合CAⅨ表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞。結(jié)論 化學(xué)合成的多肽分子PGLR-P1在分子、細(xì)胞和組織水平均能與CAⅨ蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。
碳酸酐酶9(carbonic anhydrase Ⅸ，CAⅨ)又稱G250、MN，是一種位于多種惡性腫瘤細(xì)胞膜上，由酸性氨基酸組成的跨膜蛋白。其結(jié)構(gòu)可以分為胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)，胞外區(qū)主要由酶催化區(qū)與蛋白多糖區(qū)組成。與其他碳酸酐酶同工酶相比，蛋白多糖區(qū)是CAⅨ所特有的結(jié)構(gòu)，故特異性靶向于CAⅨ蛋白多糖區(qū)的配體，不會(huì)與其他碳酸酐酶同工酶相結(jié)合，引起交叉反應(yīng)[1]。因此，構(gòu)建和合成短小、穩(wěn)定、特異性靶向于CAⅨ蛋白多糖區(qū)的配體，有利于多種惡性腫瘤(乳腺癌、胃癌、小細(xì)胞肺癌、腎癌、宮頸癌等)的靶向分子顯像和靶向治療。多肽是由α-氨基酸以肽鍵的方式連接成的化合物，通常由10～100個(gè)氨基酸分子脫水縮合而成。多肽分子化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分布廣泛、性質(zhì)穩(wěn)定，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)中。Rana等[2]通過噬菌體展示庫(kù)技術(shù)淘選出針對(duì)CAⅨ蛋白多糖區(qū)的多肽分子(proteoglycan-like region peptide, PGLR-P1，NMPKDVTTRMSS)，并研究其與CAⅨ蛋白分子的結(jié)合能力和體內(nèi)代謝分布，但尚未從病理學(xué)上證實(shí)其與腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織的結(jié)合能力以及連接到超聲納米泡表面后是否改變其與CAⅨ的親和力。因此，本實(shí)驗(yàn)通過化學(xué)固相合成法合成靶向于CAⅨ蛋白多糖區(qū)的特異性多肽分子PGLR-P1，并在分子、細(xì)胞和組織水平初步探討其與CAⅨ特異性結(jié)合的能力，從而為惡性腫瘤的分子影像學(xué)提供一種理想配體。
1 材料與方法
人腎癌786-0細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞和人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自HyClone公司, 各型氨基酸購(gòu)自蘇州天馬醫(yī)藥集團(tuán)精細(xì)化學(xué)品有限公司, 小鼠抗人CAⅨ單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司, FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、TMB顯色液和DAPI染色液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司, FITC標(biāo)記鏈霉親和素和鏈霉親和素均購(gòu)自博士德生物技術(shù)有限公司。
采用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)固相合成法合成生物素化多肽分子PLGR-P1[H2N-NMPKDVTTRMSSk(biotin)-CONH2]。具體步驟如下：二氯甲烷溶脹樹脂后，接上第1個(gè)氨基酸(賴氨酸)，脫除Fmoc保護(hù)，茚三酮檢測(cè)樹脂上氨基酸。重復(fù)上述步驟，從右至左依次連接序列中的氨基酸，最后進(jìn)行生物素化標(biāo)記。合成結(jié)束后，切割下多肽，乙醚洗滌后，得到多肽粗品。采用高效液相色譜法(HPLC)分離純化多肽粗品，并進(jìn)行純度與相對(duì)分子質(zhì)量檢測(cè)。
用包被液稀釋重組人CAⅨ蛋白胞外區(qū)至10 μg/mL，酶標(biāo)板中每孔加入100 μL，4 ℃包被過夜，洗板，用5%的BSA封閉2 h。加入化學(xué)合成的生物素化多肽，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h。洗板后加入1 ∶5 000的HRP-鏈霉親和素，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h。洗板后加入TMB顯色液100 μL/孔，室溫反應(yīng)15 min，每孔再加入50 μL濃度為2 mol/L的濃硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔的光密度值[D(450)]。以多肽溶液直接包被酶標(biāo)板作為陽(yáng)性對(duì)照，以包被液替代CAⅨ蛋白作為空白對(duì)照。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的腎癌786-0、宮頸癌HeLa和胰腺癌BxPC-3細(xì)胞，按2×104/mL接種在96孔板，培養(yǎng)過夜。洗板后4%多聚甲醛固定15 min，每孔加入100 μL的3%的過氧化氫液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，37 ℃孵育30 min。洗板后加入5%的BSA封閉2 h，每孔加入100 μL的多肽，37 ℃孵育1 h，其后處理如上。以多肽溶液直接包被作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替細(xì)胞作為空白對(duì)照。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的腎癌786-0、宮頸癌HeLa和胰腺癌BxPC-3細(xì)胞，按5×104/mL接種在鋪有玻片的24孔板上，培養(yǎng)過夜。洗板后4%多聚甲醛固定15 min，加入5%的BSA封閉2 h，每孔加入100 μL的小鼠抗人CAⅨ單抗，4 ℃過夜孵育。PBS漂洗3次后，加入100 μL的FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，37 ℃避光孵育2 h。PBS漂洗后用DAPI染色液進(jìn)行復(fù)染3 min，漂洗后在激光共聚焦鏡下觀察。以同樣的步驟使用多肽進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光測(cè)定，以檢測(cè)多肽與表達(dá)CAⅨ細(xì)胞的結(jié)合力。
將DPPC、DPPG、DPPE、DPPA以及生物素化的DSPE-PEG(2000)按一定比例溶于有機(jī)溶劑中，振蕩過夜后移至西林瓶，全氟丙烷置換瓶中空氣，ST銀汞膠囊調(diào)和器振蕩后靜置過夜。離心后分離得到空白納米泡。通過生物素-親和素系統(tǒng)將多肽連接到空白納米泡表面得到攜載多肽的靶向納米泡。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的786-0、HeLa和BxPC-3細(xì)胞以5×104細(xì)胞/孔接種在24孔中，過夜培養(yǎng)后用4%多聚甲醛固定，漂洗后加入納米泡。每種細(xì)胞分為2組，一組加入30 μL的靶向納米泡，一組加入30 μL的等濃度空白納米泡，4 ℃冰箱中孵育2 h。玻片清洗3次后，將玻片倒置于切片上，在普通光學(xué)顯微鏡(Olympus)下觀察。
2 結(jié)果
3 討論
惡性腫瘤嚴(yán)重影響人類的生命健康，據(jù)全國(guó)腫瘤登記中心統(tǒng)計(jì)，全國(guó)每年惡性腫瘤的發(fā)生率與致死率不斷上升，早期診斷和及時(shí)治療對(duì)于提高腫瘤患者生存質(zhì)量和改善患者預(yù)后具有極為重要的價(jià)值[3-4]。由于常規(guī)的醫(yī)學(xué)影像技術(shù)尚不能在組織發(fā)生解剖結(jié)構(gòu)改變之前檢測(cè)出惡性腫瘤的分子表達(dá)改變，因此腫瘤的早期診斷和特異性顯像一直是近年來(lái)醫(yī)學(xué)影像學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，分子影像學(xué)的出現(xiàn)為早期發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤分子表達(dá)改變提供了一種新方法和希望，其主要包括核素分子影像、磁共振分子影像、超聲分子影像等[5]。其中，超聲分子影像學(xué)是分子影像學(xué)的重要組成部分，目前用于腫瘤超聲分子影像學(xué)的特異性靶點(diǎn)主要局限在血管內(nèi)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2)，只能實(shí)現(xiàn)腫瘤組織血池內(nèi)顯像，不能穿過腫瘤血管壁，到達(dá)腫瘤組織，實(shí)現(xiàn)腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞特異性超聲顯像[6]。同時(shí)這些靶點(diǎn)不具有腫瘤特異性，如VEGFR-2在炎癥反應(yīng)時(shí)其表達(dá)量也會(huì)增加，故針對(duì)VEGFR-2的超聲造影劑也能顯著增強(qiáng)炎癥組織顯像效果，但尚不能真正實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的特異性超聲分子顯像[7]。實(shí)現(xiàn)腫瘤分子顯像的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)是選擇能與惡性腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的靶點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上才能構(gòu)建出特異性強(qiáng)、性能穩(wěn)定的靶向分子探針。
惡性腫瘤由于組織高密度生長(zhǎng)，易發(fā)生缺氧，導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子-1表達(dá)，進(jìn)而多種實(shí)體惡性腫瘤組織的實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜上均高表達(dá)CAⅨ，而其在大多數(shù)正常組織中不表達(dá)[8]。同時(shí)CAⅨ胞外蛋白多糖區(qū)是其特有結(jié)構(gòu)，有利于攜載針對(duì)CAⅨ蛋白多糖區(qū)抗體的造影劑和藥物直接特異性靶向結(jié)合惡性腫瘤細(xì)胞，而不會(huì)與正常組織細(xì)胞結(jié)合，故CAⅨ是惡性腫瘤靶向治療和分子顯像中理想靶點(diǎn)，因此本研究選擇CAⅨ作為惡性腫瘤的特異性靶點(diǎn)，合成并研究能與CAⅨ蛋白多糖區(qū)特異性靶向結(jié)合的配體。
目前，有多種配體可與CAⅨ蛋白多糖區(qū)發(fā)生特異性結(jié)合，包括單克隆抗體M75、G250，重組合成的抗體片段A3和CC7，多肽CaⅨ-P1[9-11]。其中，抗CAⅨ單克隆抗體已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，如124I標(biāo)記的嵌合單克隆抗體cG250診斷腎透明細(xì)胞癌的靈敏度和特異性分別達(dá)到94%和100%，同時(shí)cG250可作為抗體藥物，延長(zhǎng)腎癌患者生存時(shí)間[12]。然而，單克隆抗體具有相對(duì)分子質(zhì)量大、免疫原性高等缺點(diǎn)，因此嚴(yán)重限制了其作為靶向配體在腫瘤特異性顯像和治療中的深入研究。與傳統(tǒng)的單克隆抗體相比，
多肽分子具有相對(duì)分子質(zhì)量低、選擇性與特異性高、細(xì)胞滲透性強(qiáng)、易于修飾且不影響多肽自身特性、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，是分子影像學(xué)中理想配體[13]。目前，靶向于腫瘤血管的攜載VEGFR-2多肽分子的超聲造影劑(BR55)已用于二期臨床試驗(yàn)，其能使豐富、紊亂的腫瘤血管特異性顯像，表明以多肽為配體的靶向超聲造影劑具有較好的臨床應(yīng)用前景[14]。結(jié)合上述研究進(jìn)展，我們選擇CAⅨ作為腫瘤細(xì)胞靶點(diǎn)，多肽PGLR-P1作為CAⅨ的靶向配體，通過免疫熒光法進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)生物素化的PGLR-P1特異性靶向結(jié)合CAⅨ表達(dá)陽(yáng)性的786-0和HeLa細(xì)胞及其相應(yīng)移植瘤組織，且與CAⅨ表達(dá)陰性的BxPC-3細(xì)胞及其移植瘤組織無(wú)結(jié)合能力，進(jìn)而證實(shí)多肽PGLR-P1靶向結(jié)合CAⅨ表達(dá)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織。同時(shí)我們制備了攜載多肽的靶向納米泡和空白納米泡，發(fā)現(xiàn)攜載多肽的靶向納米泡能特異靶向聚集在CAⅨ表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞周圍，即連接到超聲納米泡表面后未明顯改變多肽PGLR-P1對(duì)CAⅨ的親和力，故其可作為惡性腫瘤超聲分子影像學(xué)中的特異性配體，攜載多肽PGLR-P1的靶向納米泡可作為惡性腫瘤早期靶向診斷的一種新型靶向超聲造影劑。
總之，我們通過化學(xué)合成的方法合成多肽PGLR-P1，并在體內(nèi)外多水平探討其與CAⅨ蛋白、CAⅨ表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞以及相應(yīng)移植瘤組織特異性靶向結(jié)合的能力，且初步探討攜載CAⅨ多肽靶向納米泡的體外尋靶能力。然而本研究也存在不足，比如雖然酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞免疫熒光定性證實(shí)了多肽PGLR-P1靶向特異性，但是未進(jìn)一步量化其與CAⅨ的親和力。下一步，我們將研究攜載多肽的靶向納米泡的基本物理特點(diǎn)以及其在體內(nèi)的靶向顯像能力，實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞的超聲分子顯像。
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