摘要 目的 研究抗菌肽ET12的抗菌活性及機(jī)制。方法 通過微量肉湯稀釋法檢測(cè)抗菌肽ET12對(duì)臨床常見菌株的最低抑菌濃度(MIC)，激光共聚焦顯微鏡觀察抗菌肽ET12對(duì)表皮葡萄球菌生物膜形成和細(xì)胞膜通透性的影響，透射電鏡觀察抗菌肽ET12對(duì)表皮葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)的影響，利用脫纖維綿羊血檢測(cè)抗菌肽ET12的溶血活性，利用CCK-8試劑盒檢測(cè)抗菌肽ET12對(duì)細(xì)胞的毒性。結(jié)果 抗菌肽ET12對(duì)革蘭陽(yáng)性菌特別是表皮葡萄球菌具有良好的抗菌活性，MIC值在8~64 μg/mL之間。ET12能夠有效抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成及破壞細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性。在有效抗菌濃度范圍內(nèi)，ET12對(duì)綿羊紅細(xì)胞的溶血率小于2.5%，RAW264.7細(xì)胞存活率大于80%。結(jié)論 抗菌肽ET12對(duì)革蘭陽(yáng)性菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，細(xì)胞膜可能是其抗菌作用靶點(diǎn)，且溶血活性和細(xì)胞毒性較低。
在過去幾十年中, 多藥耐藥菌迅速蔓延, 導(dǎo)致醫(yī)院感染和住院死亡率增加, 對(duì)全球健康構(gòu)成威脅。隨著抗生素耐藥性的上升, 尋找替代性抗生素已成為治療耐藥菌的首要任務(wù)�？咕�(antimicrobial peptides, AMPs)存在于從細(xì)菌到植物、脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的所有生命形式中, 是其固有免疫防御的普遍組成部分, 已經(jīng)被廣泛研究。由于抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性好、對(duì)宿主毒性小等特征, 抗菌肽具有作為抗菌藥物使用的潛力[1-3]; 此外, 大多數(shù)抗菌藥物通常作用于特定蛋白質(zhì), 而抗菌肽大多作用于細(xì)菌膜或其他廣義靶點(diǎn), 使得細(xì)菌通過基因突變獲得耐藥性的可能性變得很小[4]。
抗菌肽是病原微生物入侵有機(jī)體后, 有機(jī)體產(chǎn)生的一種具有抗菌作用的小分子多肽。從來源上分類, 可分為內(nèi)源性抗菌肽和人工合成抗菌肽兩類。內(nèi)源性抗菌肽是從有機(jī)體中直接提取的, 具有廣譜抗菌能力[5]。人工合成的抗菌肽主要是為了解決內(nèi)源性抗菌肽產(chǎn)量小、技術(shù)難度高、新陳代謝穩(wěn)定率和生物藥效率低等問題而設(shè)計(jì)和改造的[6]。我們根據(jù)糞腸球菌產(chǎn)生的腸毒素中的一段氨基酸序列[7], 在保證有較好抗菌活性的基礎(chǔ)上, 盡可能減小分子量, 設(shè)計(jì)出3條具有9~12個(gè)氨基酸的多肽, 經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)含有12個(gè)氨基酸殘基的抗菌肽ET12對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、特別是表皮葡萄球菌抗菌效果較好。因此, 本研究擬通過調(diào)查其抗菌活性、抗生物膜形成能力、細(xì)胞毒性、溶血性, 從而確定ET12是一種可應(yīng)用的、效果良好的抗革蘭陽(yáng)性菌活性肽; 并在此基礎(chǔ)上, 通過透射電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察抗菌肽處理前后細(xì)菌形態(tài)和細(xì)胞膜通透性的變化, 初步探究抗菌肽ET12的抗菌機(jī)制, 以期為開發(fā)新抗菌藥物提供實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。
1 材料與方法
小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW264.7)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。試劑：DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(HyClone, SH30243.01);胎牛血清(HyClone, SV30087.03);哥倫比亞血瓊脂平板(龐通醫(yī)療, PB1101);M-H肉湯(北京路橋, CM901);TSB培養(yǎng)基(索萊寶, LA0110);異硫氰酸熒光標(biāo)記的伴刀豆球蛋白A(FITC-ConA; Sigma, C7642);碘化丙啶(PI; Simga, P4170);脫纖維綿羊血(索萊寶, TX0030);增強(qiáng)型CCK-8試劑盒(碧云天, C0017);Triton X-100(碧云天, ST795);二甲亞砜(DMSO; 碧云天, ST038);戊二醛溶液(阿拉丁, G105907)。儀器：玻底培養(yǎng)皿(NEST, 801002);3111型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司); Muhiskan Spectrum型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司); MAXQ 481R型搖床(美國(guó)Thermo公司); JEM-1400型透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社); LSM 780型激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)ZEISS公司)。
抗菌肽ET12含有12個(gè)氨基酸殘基, 序列為苯丙氨酸-賴氨酸-賴氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-精氨酸-精氨酸-色氨酸-苯丙氨酸-異亮氨酸。通過芴甲氧羰基(Fmoc)固相化學(xué)方法合成多肽ET12(批號(hào)：P15064-2-20171220), 利用高效液相色譜法進(jìn)行純化, 并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)抗菌肽ET12對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌的MIC。各菌株分別接種至哥倫比亞血瓊脂平板上, 37 ℃培養(yǎng)20 h后, 取單菌落, 并用生理鹽水稀釋至0.5個(gè)麥?zhǔn)媳葷釂挝? 用M-H肉湯進(jìn)一步稀釋1 000倍備用。少量DMSO溶解抗菌肽ET12, 按倍比稀釋法用M-H肉湯將其稀釋成512~1 μg/mL的濃度梯度。取100 μL各濃度的抗菌肽ET12溶液分別與100 μL稀釋菌液一起加入96孔板中; 取100 μL稀釋菌液和100 μL M-H肉湯作為生長(zhǎng)對(duì)照孔。37 ℃培養(yǎng)20 h后, 讀取MIC結(jié)果。
用TSB培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)的表皮葡萄球菌比濁稀釋至1.0×108 CFU/L; 無菌6孔板中放入無菌蓋玻片, 加入2.5 mL菌液和2.5 mL的抗菌肽ET12溶液, 使得抗菌肽ET12的最終濃度為1/4 MIC, 以TSB培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)24 h。取出蓋玻片, 用PBS溶液輕柔沖洗, 去除未粘附細(xì)菌, 并用吸水紙吸去多余水分, 加入2.5%的戊二醛溶液, 固定1.5 h。PBS溶液沖洗后, 加入50 mg/mL的FITC-ConA溶液, 4 ℃避光染色30 min。PBS溶液沖洗后, 加入5 mg/L的PI溶液, 4 ℃避光染色15 min。PBS再次清洗后, 晾半干, 50%甘油封片。激光共聚焦顯微鏡定性觀察標(biāo)記為綠色熒光的多糖和標(biāo)記為紅色熒光的細(xì)菌細(xì)胞核。
參照文獻(xiàn)[8]描述的方法利用透射電子顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的表皮葡萄球菌與MIC濃度的ET12, 37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)30 min。菌液與PBS共培養(yǎng)作為空白對(duì)照。1 000 r/min離心10 min, 棄上清, 無菌生理鹽水洗滌3次后, 用2.5%戊二醛固定2 h后, 送至電鏡室進(jìn)行樣品固定、脫水、包埋、切片和染色, 最后用透射電子顯微鏡觀察。
通過PI染色觀察ET12對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響[9]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的表皮葡萄球菌與MIC濃度的抗菌肽ET12(PBS作為空白對(duì)照)共培養(yǎng)30 min后, 用PBS清洗細(xì)菌3次。100 μg/mL的PI溶液染色15 min后, 加入玻底培養(yǎng)皿中。激光共聚焦顯微鏡定性觀察標(biāo)記為紅色熒光的膜破細(xì)菌。
取脫纖維綿羊血1 000 r/min離心10 min。棄上清, 用PBS反復(fù)多次洗滌紅細(xì)胞, 直至上清透亮。用10倍體積的PBS重懸紅細(xì)胞, 制備紅細(xì)胞懸液。用PBS按照倍比稀釋法將抗菌肽ET12稀釋為5 120、2 560、1 280、640、320、160、80、40 μg/mL的濃度, 分別取10 μL肽液加入96孔板中, 作為實(shí)驗(yàn)組, 另取10 μL PBS和10%的Triton X-100分別作為陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。每孔加入1×105個(gè)紅細(xì)胞懸液, 每組5個(gè)復(fù)孔。5% CO2、37 ℃孵育30 min, 1 500 r/min離心10 min, 取上清至新的96孔板中, 于450 nm處測(cè)光密度值[D(450)], 并計(jì)算溶血率。溶血率=[實(shí)驗(yàn)組D(450)-陰性對(duì)照組D(450)]/[陽(yáng)性對(duì)照組D(450)-陰性對(duì)照組D(450)]×100%。
小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW264.7)按照1×105個(gè)/孔接種至96孔板中, 在含5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。棄上清, 并用PBS清洗2次。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基按照倍比稀釋法將抗菌肽ET12稀釋為512、256、128、64、32、16、8、4 μg/mL, 分別取100 μL加入清洗好的96孔板細(xì)胞中, 作為實(shí)驗(yàn)組, 并設(shè)置對(duì)照組(含有細(xì)胞和培養(yǎng)基)和空白組(只含有培養(yǎng)基), 每組3個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液, 細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min后, 在450 nm處測(cè)光密度值[D(450)], 并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率= [實(shí)驗(yàn)組D(450)-空白組D(450)]/[對(duì)照組D(450)-空白組D(450)]×100%。
2 結(jié)果
抗菌肽ET12對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌的MIC結(jié)果如表 1所示�？咕腅T12對(duì)革蘭陰性菌幾乎沒有抗菌效果, MIC值大部分均大于256 μg/mL。相對(duì)而言, ET12對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的抗菌活性良好, 其中對(duì)表皮葡萄球菌的抗菌活性最好, MIC值均在16 μg/mL及以下。由于ET12對(duì)表皮葡萄球菌臨床菌株50的抗菌活性最好, 因此將其作為后續(xù)生物膜、細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞膜通透性實(shí)驗(yàn)的菌株。
抗菌肽ET12的細(xì)胞毒性如圖 6所示。隨著抗菌肽ET12濃度的增加, RAW264.7細(xì)胞的存活率呈下降趨勢(shì)。在512 μg/mL的濃度下, 細(xì)胞存活率最低, 為47.82%。在抗菌肽ET12對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的MIC范圍內(nèi)(MIC≤64 μg/mL), RAW264.7細(xì)胞的存活率都大于80%。結(jié)果表明, 抗菌肽ET12的細(xì)胞毒性較小。
3 討論
由于抗菌藥物的大量及不合理使用, 多重耐藥菌不斷增加, 給臨床治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。目前抗菌藥物的研發(fā)速度遠(yuǎn)低于耐藥菌的出現(xiàn), 因此尋找新的抗菌藥物成為亟待解決的問題。近年來, 越來越多的人工抗菌肽被設(shè)計(jì)合成并發(fā)現(xiàn)具有廣譜的抗菌活性[10-12]。本研究設(shè)計(jì)合成了一種抗菌肽ET12, 通過MIC測(cè)定發(fā)現(xiàn)其對(duì)革蘭陽(yáng)性菌, 特別是表皮葡萄球菌具有較強(qiáng)的抗菌效果。ET12對(duì)表皮葡萄球菌的MIC均≤16 μg/mL, 與臨床常用抗菌藥物的MIC值相當(dāng)。抗菌肽ET12由12個(gè)氨基酸殘基組成, 含有4個(gè)正電荷氨基酸和66.67%的疏水氨基酸, 是一種分子量小的陽(yáng)離子疏水肽�？咕腅T12較好的抗革蘭陽(yáng)性菌活性效果可能是由于革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁表面存在的大量磷壁酸和糖醛酸磷壁酸使其對(duì)帶正電的抗菌肽ET12更加敏感[1, 13]。然而, ET12對(duì)革蘭陰性菌幾乎沒有抗菌活性。導(dǎo)致這種差異的原因可能是由于革蘭陰性菌細(xì)胞壁外具有額外的一層外膜, 比革蘭陽(yáng)性菌更能抵抗外來抗菌藥物的入侵[14]。本研究中ET12對(duì)表皮葡萄球菌具有最強(qiáng)的抗菌活性, 因此以表皮葡萄球菌為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)的生物膜、細(xì)菌形態(tài)及細(xì)胞膜通透性實(shí)驗(yàn)。
臨床上80%的感染都與生物膜相關(guān)。表皮葡萄球菌是生物膜相關(guān)感染的重要病原菌之一。表皮葡萄球菌能夠粘附到外科植入材料上形成生物膜, 生物膜中的細(xì)菌能夠抵抗抗菌藥物和宿主免疫系統(tǒng)的攻擊, 比浮游菌的耐藥性高1 000倍[15]。本研究通過激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜, 結(jié)果顯示亞-MIC ET12能夠有效抑制表皮葡萄球菌的生物膜形成, 提示抗菌肽ET12可能作為一種預(yù)防生物膜相關(guān)感染的治療藥物。
為了探討ET12的抗菌作用機(jī)制, 我們首先通過透射電鏡觀察表皮葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)變化, 結(jié)果顯示ET12會(huì)導(dǎo)致表皮葡萄球菌的細(xì)胞破裂, 細(xì)胞質(zhì)向外滲漏。由于PI只穿透受損的膜, 將DNA染成紅色, 因此通過測(cè)定細(xì)菌對(duì)PI的攝取量研究ET12對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ET12會(huì)造成表皮葡萄球菌細(xì)胞膜破裂, 通透性增加。據(jù)此我們推測(cè), 陽(yáng)離子抗菌肽ET12可能在穿過細(xì)胞壁后, 通過作用于細(xì)胞膜, 造成細(xì)胞膜破裂而表現(xiàn)出抗菌活性[16-18]。然而具體的作用方式, 仍需更加深入的研究。
溶血活性和細(xì)胞毒性是衡量抗菌肽安全性的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究中, 抗菌肽ET12雖然在高濃度中具有一定的溶血活性和細(xì)胞毒性, 但在≤128 μg/mL濃度范圍內(nèi)溶血性和細(xì)胞毒性較低。研究結(jié)果表明抗菌肽ET12在保證對(duì)革蘭陽(yáng)性菌具有良好的抗菌活性和抗生物膜形成活性的同時(shí), 還具有溶血率低, 對(duì)正常細(xì)胞無毒性的特征, 有作為抗生素替代藥物的潛力。
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