摘要 目的 研究抗菌肽ET12的抗菌活性及機制。方法 通過微量肉湯稀釋法檢測抗菌肽ET12對臨床常見菌株的最低抑菌濃度(MIC)，激光共聚焦顯微鏡觀察抗菌肽ET12對表皮葡萄球菌生物膜形成和細(xì)胞膜通透性的影響，透射電鏡觀察抗菌肽ET12對表皮葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)的影響，利用脫纖維綿羊血檢測抗菌肽ET12的溶血活性，利用CCK-8試劑盒檢測抗菌肽ET12對細(xì)胞的毒性。結(jié)果 抗菌肽ET12對革蘭陽性菌特別是表皮葡萄球菌具有良好的抗菌活性，MIC值在8~64 μg/mL之間。ET12能夠有效抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成及破壞細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)，增強細(xì)胞膜通透性。在有效抗菌濃度范圍內(nèi)，ET12對綿羊紅細(xì)胞的溶血率小于2.5%，RAW264.7細(xì)胞存活率大于80%。結(jié)論 抗菌肽ET12對革蘭陽性菌具有較強的抗菌活性，細(xì)胞膜可能是其抗菌作用靶點，且溶血活性和細(xì)胞毒性較低。
在過去幾十年中, 多藥耐藥菌迅速蔓延, 導(dǎo)致醫(yī)院感染和住院死亡率增加, 對全球健康構(gòu)成威脅。隨著抗生素耐藥性的上升, 尋找替代性抗生素已成為治療耐藥菌的首要任務(wù)。抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)存在于從細(xì)菌到植物、脊椎動物和無脊椎動物的所有生命形式中, 是其固有免疫防御的普遍組成部分, 已經(jīng)被廣泛研究。由于抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性好、對宿主毒性小等特征, 抗菌肽具有作為抗菌藥物使用的潛力[1-3]; 此外, 大多數(shù)抗菌藥物通常作用于特定蛋白質(zhì), 而抗菌肽大多作用于細(xì)菌膜或其他廣義靶點, 使得細(xì)菌通過基因突變獲得耐藥性的可能性變得很小[4]。
抗菌肽是病原微生物入侵有機體后, 有機體產(chǎn)生的一種具有抗菌作用的小分子多肽。從來源上分類, 可分為內(nèi)源性抗菌肽和人工合成抗菌肽兩類。內(nèi)源性抗菌肽是從有機體中直接提取的, 具有廣譜抗菌能力[5]。人工合成的抗菌肽主要是為了解決內(nèi)源性抗菌肽產(chǎn)量小、技術(shù)難度高、新陳代謝穩(wěn)定率和生物藥效率低等問題而設(shè)計和改造的[6]。我們根據(jù)糞腸球菌產(chǎn)生的腸毒素中的一段氨基酸序列[7], 在保證有較好抗菌活性的基礎(chǔ)上, 盡可能減小分子量, 設(shè)計出3條具有9~12個氨基酸的多肽, 經(jīng)前期實驗比較發(fā)現(xiàn)含有12個氨基酸殘基的抗菌肽ET12對革蘭陽性菌、特別是表皮葡萄球菌抗菌效果較好。因此, 本研究擬通過調(diào)查其抗菌活性、抗生物膜形成能力、細(xì)胞毒性、溶血性, 從而確定ET12是一種可應(yīng)用的、效果良好的抗革蘭陽性菌活性肽; 并在此基礎(chǔ)上, 通過透射電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察抗菌肽處理前后細(xì)菌形態(tài)和細(xì)胞膜通透性的變化, 初步探究抗菌肽ET12的抗菌機制, 以期為開發(fā)新抗菌藥物提供實驗研究依據(jù)。
1 材料與方法
小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW264.7)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。試劑：DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(HyClone, SH30243.01);胎牛血清(HyClone, SV30087.03);哥倫比亞血瓊脂平板(龐通醫(yī)療, PB1101);M-H肉湯(北京路橋, CM901);TSB培養(yǎng)基(索萊寶, LA0110);異硫氰酸熒光標(biāo)記的伴刀豆球蛋白A(FITC-ConA; Sigma, C7642);碘化丙啶(PI; Simga, P4170);脫纖維綿羊血(索萊寶, TX0030);增強型CCK-8試劑盒(碧云天, C0017);Triton X-100(碧云天, ST795);二甲亞砜(DMSO; 碧云天, ST038);戊二醛溶液(阿拉丁, G105907)。儀器：玻底培養(yǎng)皿(NEST, 801002);3111型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司); Muhiskan Spectrum型酶標(biāo)儀(美國Thermo公司); MAXQ 481R型搖床(美國Thermo公司); JEM-1400型透射電子顯微鏡(日本電子株式會社); LSM 780型激光共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)。
抗菌肽ET12含有12個氨基酸殘基, 序列為苯丙氨酸-賴氨酸-賴氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-精氨酸-精氨酸-色氨酸-苯丙氨酸-異亮氨酸。通過芴甲氧羰基(Fmoc)固相化學(xué)方法合成多肽ET12(批號：P15064-2-20171220), 利用高效液相色譜法進(jìn)行純化, 并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
采用微量肉湯稀釋法檢測抗菌肽ET12對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的MIC。各菌株分別接種至哥倫比亞血瓊脂平板上, 37 ℃培養(yǎng)20 h后, 取單菌落, 并用生理鹽水稀釋至0.5個麥?zhǔn)媳葷釂挝? 用M-H肉湯進(jìn)一步稀釋1 000倍備用。少量DMSO溶解抗菌肽ET12, 按倍比稀釋法用M-H肉湯將其稀釋成512~1 μg/mL的濃度梯度。取100 μL各濃度的抗菌肽ET12溶液分別與100 μL稀釋菌液一起加入96孔板中; 取100 μL稀釋菌液和100 μL M-H肉湯作為生長對照孔。37 ℃培養(yǎng)20 h后, 讀取MIC結(jié)果。
用TSB培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)的表皮葡萄球菌比濁稀釋至1.0×108 CFU/L; 無菌6孔板中放入無菌蓋玻片, 加入2.5 mL菌液和2.5 mL的抗菌肽ET12溶液, 使得抗菌肽ET12的最終濃度為1/4 MIC, 以TSB培養(yǎng)基為陰性對照。37 ℃培養(yǎng)24 h。取出蓋玻片, 用PBS溶液輕柔沖洗, 去除未粘附細(xì)菌, 并用吸水紙吸去多余水分, 加入2.5%的戊二醛溶液, 固定1.5 h。PBS溶液沖洗后, 加入50 mg/mL的FITC-ConA溶液, 4 ℃避光染色30 min。PBS溶液沖洗后, 加入5 mg/L的PI溶液, 4 ℃避光染色15 min。PBS再次清洗后, 晾半干, 50%甘油封片。激光共聚焦顯微鏡定性觀察標(biāo)記為綠色熒光的多糖和標(biāo)記為紅色熒光的細(xì)菌細(xì)胞核。
參照文獻(xiàn)[8]描述的方法利用透射電子顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。取對數(shù)生長期的表皮葡萄球菌與MIC濃度的ET12, 37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)30 min。菌液與PBS共培養(yǎng)作為空白對照。1 000 r/min離心10 min, 棄上清, 無菌生理鹽水洗滌3次后, 用2.5%戊二醛固定2 h后, 送至電鏡室進(jìn)行樣品固定、脫水、包埋、切片和染色, 最后用透射電子顯微鏡觀察。
通過PI染色觀察ET12對細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響[9]。取對數(shù)生長期的表皮葡萄球菌與MIC濃度的抗菌肽ET12(PBS作為空白對照)共培養(yǎng)30 min后, 用PBS清洗細(xì)菌3次。100 μg/mL的PI溶液染色15 min后, 加入玻底培養(yǎng)皿中。激光共聚焦顯微鏡定性觀察標(biāo)記為紅色熒光的膜破細(xì)菌。
取脫纖維綿羊血1 000 r/min離心10 min。棄上清, 用PBS反復(fù)多次洗滌紅細(xì)胞, 直至上清透亮。用10倍體積的PBS重懸紅細(xì)胞, 制備紅細(xì)胞懸液。用PBS按照倍比稀釋法將抗菌肽ET12稀釋為5 120、2 560、1 280、640、320、160、80、40 μg/mL的濃度, 分別取10 μL肽液加入96孔板中, 作為實驗組, 另取10 μL PBS和10%的Triton X-100分別作為陰性對照組和陽性對照組。每孔加入1×105個紅細(xì)胞懸液, 每組5個復(fù)孔。5% CO2、37 ℃孵育30 min, 1 500 r/min離心10 min, 取上清至新的96孔板中, 于450 nm處測光密度值[D(450)], 并計算溶血率。溶血率=[實驗組D(450)-陰性對照組D(450)]/[陽性對照組D(450)-陰性對照組D(450)]×100%。
小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW264.7)按照1×105個/孔接種至96孔板中, 在含5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。棄上清, 并用PBS清洗2次。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基按照倍比稀釋法將抗菌肽ET12稀釋為512、256、128、64、32、16、8、4 μg/mL, 分別取100 μL加入清洗好的96孔板細(xì)胞中, 作為實驗組, 并設(shè)置對照組(含有細(xì)胞和培養(yǎng)基)和空白組(只含有培養(yǎng)基), 每組3個復(fù)孔。37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液, 細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min后, 在450 nm處測光密度值[D(450)], 并計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率= [實驗組D(450)-空白組D(450)]/[對照組D(450)-空白組D(450)]×100%。
2 結(jié)果
抗菌肽ET12對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的MIC結(jié)果如表 1所示。抗菌肽ET12對革蘭陰性菌幾乎沒有抗菌效果, MIC值大部分均大于256 μg/mL。相對而言, ET12對革蘭陽性菌的抗菌活性良好, 其中對表皮葡萄球菌的抗菌活性最好, MIC值均在16 μg/mL及以下。由于ET12對表皮葡萄球菌臨床菌株50的抗菌活性最好, 因此將其作為后續(xù)生物膜、細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞膜通透性實驗的菌株。
抗菌肽ET12的細(xì)胞毒性如圖 6所示。隨著抗菌肽ET12濃度的增加, RAW264.7細(xì)胞的存活率呈下降趨勢。在512 μg/mL的濃度下, 細(xì)胞存活率最低, 為47.82%。在抗菌肽ET12對革蘭陽性菌的MIC范圍內(nèi)(MIC≤64 μg/mL), RAW264.7細(xì)胞的存活率都大于80%。結(jié)果表明, 抗菌肽ET12的細(xì)胞毒性較小。
3 討論
由于抗菌藥物的大量及不合理使用, 多重耐藥菌不斷增加, 給臨床治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。目前抗菌藥物的研發(fā)速度遠(yuǎn)低于耐藥菌的出現(xiàn), 因此尋找新的抗菌藥物成為亟待解決的問題。近年來, 越來越多的人工抗菌肽被設(shè)計合成并發(fā)現(xiàn)具有廣譜的抗菌活性[10-12]。本研究設(shè)計合成了一種抗菌肽ET12, 通過MIC測定發(fā)現(xiàn)其對革蘭陽性菌, 特別是表皮葡萄球菌具有較強的抗菌效果。ET12對表皮葡萄球菌的MIC均≤16 μg/mL, 與臨床常用抗菌藥物的MIC值相當(dāng)�？咕腅T12由12個氨基酸殘基組成, 含有4個正電荷氨基酸和66.67%的疏水氨基酸, 是一種分子量小的陽離子疏水肽�？咕腅T12較好的抗革蘭陽性菌活性效果可能是由于革蘭陽性菌細(xì)胞壁表面存在的大量磷壁酸和糖醛酸磷壁酸使其對帶正電的抗菌肽ET12更加敏感[1, 13]。然而, ET12對革蘭陰性菌幾乎沒有抗菌活性。導(dǎo)致這種差異的原因可能是由于革蘭陰性菌細(xì)胞壁外具有額外的一層外膜, 比革蘭陽性菌更能抵抗外來抗菌藥物的入侵[14]。本研究中ET12對表皮葡萄球菌具有最強的抗菌活性, 因此以表皮葡萄球菌為研究對象進(jìn)行后續(xù)的生物膜、細(xì)菌形態(tài)及細(xì)胞膜通透性實驗。
臨床上80%的感染都與生物膜相關(guān)。表皮葡萄球菌是生物膜相關(guān)感染的重要病原菌之一。表皮葡萄球菌能夠粘附到外科植入材料上形成生物膜, 生物膜中的細(xì)菌能夠抵抗抗菌藥物和宿主免疫系統(tǒng)的攻擊, 比浮游菌的耐藥性高1 000倍[15]。本研究通過激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜, 結(jié)果顯示亞-MIC ET12能夠有效抑制表皮葡萄球菌的生物膜形成, 提示抗菌肽ET12可能作為一種預(yù)防生物膜相關(guān)感染的治療藥物。
為了探討ET12的抗菌作用機制, 我們首先通過透射電鏡觀察表皮葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)變化, 結(jié)果顯示ET12會導(dǎo)致表皮葡萄球菌的細(xì)胞破裂, 細(xì)胞質(zhì)向外滲漏。由于PI只穿透受損的膜, 將DNA染成紅色, 因此通過測定細(xì)菌對PI的攝取量研究ET12對細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性。實驗結(jié)果顯示ET12會造成表皮葡萄球菌細(xì)胞膜破裂, 通透性增加。據(jù)此我們推測, 陽離子抗菌肽ET12可能在穿過細(xì)胞壁后, 通過作用于細(xì)胞膜, 造成細(xì)胞膜破裂而表現(xiàn)出抗菌活性[16-18]。然而具體的作用方式, 仍需更加深入的研究。
溶血活性和細(xì)胞毒性是衡量抗菌肽安全性的重要評價指標(biāo)。本研究中, 抗菌肽ET12雖然在高濃度中具有一定的溶血活性和細(xì)胞毒性, 但在≤128 μg/mL濃度范圍內(nèi)溶血性和細(xì)胞毒性較低。研究結(jié)果表明抗菌肽ET12在保證對革蘭陽性菌具有良好的抗菌活性和抗生物膜形成活性的同時, 還具有溶血率低, 對正常細(xì)胞無毒性的特征, 有作為抗生素替代藥物的潛力。
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