摘要 外泌體(exosomes)是一種由活細(xì)胞分泌并釋放到胞外環(huán)境中、大小在60~100 nm的運(yùn)輸膜泡。外泌體以其天然的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)特性、相對較小的分子結(jié)構(gòu)和優(yōu)良的生物相容性, 可遞送化學(xué)藥物、蛋白質(zhì)及肽配基和基因藥物等多種藥物, 在藥物載體的領(lǐng)域具有巨大的潛力。該文重點(diǎn)介紹了外泌體運(yùn)載多種藥物的不同應(yīng)用及靶向給藥中三種主要策略和應(yīng)用以及其他靶向給藥的方向及應(yīng)用, 闡述了外泌體作為藥物載體的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)。
1981年, Trams等[1]在透射電鏡下發(fā)現(xiàn)了一組比多泡體還要小的、直徑在40~1 000 nm的囊泡樣物質(zhì)。1987年, Johnstone等[2]命名這種膜泡為外泌體(exosomes), 同時(shí)在網(wǎng)織紅細(xì)胞的成熟過程中, 觀測到了外泌體的形成并通過離心(100 000 ×g, 90 min)首次從網(wǎng)織紅細(xì)胞中成功分離純化了外泌體。1996年 , Skokos等[3]和 Bu等[4]發(fā)現(xiàn) , 在人 B淋巴細(xì)胞中分離出來的一些膜泡具有呈遞抗原的能力, 其膜表面含有豐富的主要組織相容性復(fù)合體 II(majorhistocompatibility complex II, MHCII), 可向T細(xì)胞呈遞抗原并刺激T細(xì)胞激活。外泌體廣泛存在于所有的體液中, 包括精液[5]、唾液[6]、血液[7]、尿液[8]、乳汁[9]等, 行使著多種功能。
1 外泌體的成分及功能
外泌體來源于細(xì)胞內(nèi)源途徑, 是由內(nèi)含多個(gè)囊泡的多泡體(multivesicular body, MVB)向外出芽和胞膜融合后釋放到胞外環(huán)境中、大小在60~100 nm之間的運(yùn)輸膜泡。外泌體膜由膜脂和膜蛋白組成, 膜脂中含有膽固醇、鞘磷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside,GM)[10], 可構(gòu)成脂閥結(jié)構(gòu)等, 這賦予了外泌體對非離子型去污劑的抵抗性, 具有抗去污劑膜(detergentresistant membranes, DRM)的特性[11]。而膜蛋白主要有四分子交聯(lián)體家族[CD9(cluster of differentiation9)、CD63、CD81、CD82]、熱休克蛋白[Hsp70(heatshock protein 70)、Hsp90]、跨膜運(yùn)輸和整合相關(guān)蛋白(如G蛋白、膜聯(lián)蛋白、脂閥結(jié)構(gòu)蛋白等), 尤其是CD9和CD63, 通常是外泌體的分子標(biāo)志[12]。不同來源的外泌體也有著其特異的表面分子, 在細(xì)胞通訊、信息傳遞中起著重要的作用。例如, 人淋巴B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)來源的外泌體表面高表達(dá)MHC, 以呈遞抗原刺激T細(xì)胞激活[11], 網(wǎng)織紅細(xì)胞來源的外泌體高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等[13]。外泌體內(nèi)含物包括可溶性蛋白質(zhì)、核酸(mRNA、miRNA、microRNA)和脂質(zhì)等。通常作為藥物載體的HEK293T細(xì)胞來源的外泌體成分已被探明, 包括蛋白質(zhì)、mRNA和microRNA[14]。外泌體可以通過表面分子與受體細(xì)胞表面受體結(jié)合, 將其內(nèi)含物遞送至受體細(xì)胞內(nèi), 進(jìn)行胞間的信息傳遞, 從而改變受體細(xì)胞的生理狀態(tài)。近年來, 許多研究表明, 外泌體參與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移, 在免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)方面有著重要地位[12]。也有研究表明, 和正常細(xì)胞來源的外泌體相比, 腫瘤細(xì)胞來源的外泌體在蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA等內(nèi)含物的豐度和種類等都有差別,且外泌體在體液中分布非常廣泛且易得, 因而成為早期腫瘤診斷的分子標(biāo)志物[14]。此外, 近年來外泌體被廣泛用作藥物載體, 在生物治療領(lǐng)域有著極大的潛力, 本文重點(diǎn)介紹外泌體作為藥物載體的應(yīng)用以及用作靶向藥載體的策略。
2 外泌體作為藥物載體的優(yōu)勢
近年來, 作為天然的胞間信息載體的外泌體,以其相對較小的分子結(jié)構(gòu)、天然的分子轉(zhuǎn)運(yùn)特性和良好的生物相容性, 在藥物載體領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力[15]。對于藥物載體的選擇, 有兩個(gè)基本原則:保護(hù)內(nèi)含藥物在體內(nèi)環(huán)境中不失活; 在不引發(fā)機(jī)體對藥物載體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的情況下釋放內(nèi)含物[16]。較之現(xiàn)有的藥物載體(如人工制造的脂質(zhì)體), 外泌體有其顯著的優(yōu)越性。首先, 外泌體有自身天然的內(nèi)含物, 可以轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并功能性改變受體細(xì)胞, 且不同來源的外泌體表面分子不一樣, 對受體細(xì)胞有一定選擇性, 在治療上更有利[17]。其次, 相對于脂質(zhì)體對親水性物質(zhì)較低的包裝效率, 其在遞送核酸方面受到限制, 而外泌體可以更好地親和核酸分子, 顯著提高包裝效率[18]。再則, 較之人工制造的藥物載體, 特殊細(xì)胞[如未成熟的DC細(xì)胞或者是充間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)]來源的外泌體,由于它們特殊的表面分子能夠避免與調(diào)理素蛋白、抗體、凝血因子等產(chǎn)生相互作用, 從而避免了體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)[19]。有研究表明, 經(jīng)過人工設(shè)計(jì)的外泌體可以通過小鼠的血腦屏障發(fā)揮作用[20]。
3 外泌體作為藥物載體的應(yīng)用
利用外泌體裝載藥物的方式有多種, 可分為間接裝載和直接裝載兩大類。間接裝載指通過操作外泌體來源細(xì)胞來使外泌體裝載藥物, 該方式較為成熟、應(yīng)用較多, 又分為以下兩種方法。(1)將藥物與外泌體來源細(xì)胞共培養(yǎng), 使細(xì)胞分泌出的外泌體內(nèi)自然包含有藥物, 但轉(zhuǎn)染效率不高, 主要應(yīng)用于細(xì)胞毒性較低的小分子化學(xué)藥物[21]。(2)通過化學(xué)方法(如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法)轉(zhuǎn)染外泌體來源細(xì)胞, 使其攜帶藥物,但轉(zhuǎn)染效率較低, 主要應(yīng)用于基因藥物[20]。直接裝載法指通過操作外泌體, 直接將藥物裝入外泌體中,該方式轉(zhuǎn)染效率較高, 但目前尚不夠成熟, 主要分為以下三種方法。(1)將藥物與提取出的外泌體共培養(yǎng),主要應(yīng)用于小分子化學(xué)藥物[22]。(2)通過化學(xué)轉(zhuǎn)染法如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將藥物直接轉(zhuǎn)入外泌體中, 主要應(yīng)用于基因藥物, 已有用于此種裝載方法的商業(yè)化試劑盒。(3)通過電穿孔技術(shù)將藥物轉(zhuǎn)入外泌體中, 該方法通過電解質(zhì)溶液施加弱電流脈沖于外泌體上,將磷脂雙分子層擊穿出一個(gè)可恢復(fù)的小孔, 便于藥物的負(fù)載。該方法可應(yīng)用于多種藥物類型, 且參數(shù)易于控制, 有著廣闊的應(yīng)用前景。有研究表明, 在應(yīng)用電穿孔技術(shù)裝載基因藥物時(shí), 核酸分子的大小和外泌體的直徑都對轉(zhuǎn)染效率有著決定性作用[23]。
Pascucci等[24]通過將高劑量的紫杉醇和MSC混合培養(yǎng), 使MSC來源的外泌體裝載紫杉醇, 以胰腺癌細(xì)胞作為受體細(xì)胞, 有效地抑制了胰腺癌細(xì)胞的增殖, 證實(shí)了MSC來源的外泌體具有包裹和運(yùn)送物質(zhì)的能力。同時(shí), 也證明不同細(xì)胞來源的外泌體具有特異性標(biāo)記, 該標(biāo)記有作為疾病診斷的潛能。Jang等[25]以單核細(xì)胞U937細(xì)胞為供體細(xì)胞, 將其與400 μg/mL的阿霉素混合培養(yǎng), 通過超速離心獲得了裝載有阿霉素的U937細(xì)胞來源外泌體, 對癌細(xì)胞有明顯的抑制作用, 但其安全性以及外泌體遞送藥物的效率都需要進(jìn)一步研究。Tian等[26]將未成熟的DC細(xì)胞來源的外泌體分離出來, 以電轉(zhuǎn)的方式使DC來源的外泌體裝載阿霉素, 靶向治療乳腺癌細(xì)胞。該研究首次將外泌體運(yùn)用于遞送阿霉素至小鼠實(shí)體瘤中, 為疏水性化學(xué)藥物的遞送提供新途徑。Sun等[19]通過分別將多種細(xì)胞與姜黃素共培養(yǎng), 成功獲得了裝載姜黃素的多種細(xì)胞來源的外泌體, 并以激活的髓樣細(xì)胞為受體細(xì)胞, 成功地干預(yù)了免疫紊亂。外泌體天然的分子結(jié)構(gòu)為小分子化學(xué)藥物的攝取和運(yùn)輸都提供了基礎(chǔ), 降低了藥物的毒副作用, 提高了藥物的利用效率, 較之傳統(tǒng)的化學(xué)藥物遞送系統(tǒng)有著天然的優(yōu)越性。
外泌體可以裝載內(nèi)源蛋白質(zhì), 自體靶向受體細(xì)胞治療或致病。Shimoda等[27]發(fā)現(xiàn), CagA(cytotoxinassociated gene A)表達(dá)細(xì)胞來源的外泌體, 內(nèi)含有毒性因子CagA, 可遞送其至胃上皮細(xì)胞導(dǎo)致胃腸疾病。Altan-Bonnet等[28]發(fā)現(xiàn), 病毒宿主細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可以通過包裹病毒基因組和病毒顆粒運(yùn)送至新的易染的宿主細(xì)胞這一過程, 成為病毒擴(kuò)散的新途徑。外泌體包裹蛋白質(zhì)類藥物作為治療途徑主要是參與免疫治療, 使用的外泌體往往是成熟的DC細(xì)胞來源的外泌體, 因其表面含有高豐度的MHC分子、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、四分子交聯(lián)體蛋白家族和NK細(xì)胞的激活配體, 因此比未成熟的DC細(xì)胞來源的外泌體更具免疫刺激性[19]。在腫瘤的免疫治療方向, 特殊細(xì)胞來源外泌體因其表面分子的特殊性有著很大優(yōu)勢。例如, 成熟的DC細(xì)胞來源的外泌體具有誘導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤免疫的能力, 外泌體作為腫瘤疫苗具有良好的發(fā)展前景。
外泌體裝載的基因藥物主要有mRNA、miRNA、siRNA三類, 其中以能夠執(zhí)行RNAi的siRNA居多。接下來將介紹外泌體在遞送幾種基因藥物中的應(yīng)用。外泌體可以通過自體攜帶的miRNA進(jìn)行胞間信息交流, 如Chen等[29]發(fā)現(xiàn)外泌體可以通過攜帶能夠沉默結(jié)締組織生長因子2(connective tissue growthfactor 2, CCN2)mRNA的miRNA-214在人或鼠肝星狀 細(xì) 胞(hepatic stellate cells, HSC)間 進(jìn) 行miRNA-214的傳遞, 抑制了肝星狀細(xì)胞的纖維化, 此外, 外泌體也可以通過裝載外源的miRNA對受體細(xì)胞起作用。Munoz等[30]通過MSC來源的外泌體裝載antimiR-9賦予惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞化學(xué)敏感性。miR-9和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)相關(guān), 敲除miR-9有助于惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞提高對化學(xué)藥物TMZ(tribuzone)的敏感性。Momen-Heravi等[31]通過電轉(zhuǎn)使B細(xì)胞來源的外泌體裝載miRNA-155抑制劑, 作用于巨噬細(xì)胞, 降低了脂多糖誘導(dǎo)的TNF-α(tumor necrosis factor-α)產(chǎn)生,減輕了體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。該研究為B細(xì)胞來源外泌體作為藥物載體的應(yīng)用提供了證據(jù), 但對于外泌體在體內(nèi)是否可以長時(shí)間地發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步的研究。Didiot等[32]將疏水修飾的siRNA(hsiRNA)和惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞來源的外泌體進(jìn)行混合培養(yǎng), 裝載hsiRNA遞送到原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層細(xì)胞中,通過沉默亨廷頓mRNA起到治療亨廷頓舞蹈癥的作用。該研究認(rèn)為, 共培養(yǎng)是外泌體遞送基因藥物的一種可行、高效、高重復(fù)性的裝載方法, 證明了外泌體遞送基因藥物的可行性。Shtam等[33]通過電轉(zhuǎn)使HeLa細(xì)胞來源的外泌體裝載RAD51和RAD52的siRNA, 誘導(dǎo)纖維素肉瘤細(xì)胞中兩個(gè)基因沉默,RAD51是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白, 與正常細(xì)胞非正常增殖為癌細(xì)胞相關(guān), 是癌細(xì)胞的潛在靶點(diǎn)。
外泌體的靶向策略多樣, 主要有修飾外泌體表面蛋白質(zhì)以增強(qiáng)靶向作用, 導(dǎo)入在特定細(xì)胞發(fā)揮功能的mRNA, 選用自身趨向性強(qiáng)的外泌體種類等三類。Tian等[23]通過構(gòu)建融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入未成熟的DC細(xì)胞, 將可與腫瘤表面整合蛋白αv特異結(jié)合的肽iRGD(CRGDK\GPDC)融合在未成熟DC細(xì)胞來源的外泌體表面膜蛋白lamp2b(lysosomalassociatedmembrane protein 2b)上, 通過超速離心提取囊泡后, 通過電轉(zhuǎn)將阿霉素轉(zhuǎn)入帶有iRGD的外泌體中, 達(dá)到靶向殺傷整合蛋白αv陽性癌細(xì)胞的目的。Alvarez-Erviti等[20]將未成熟DC細(xì)胞來源的外泌體膜蛋白lamp2b融合能夠特異與乙酰膽堿受體結(jié)合的狂犬病毒糖蛋白配體RVG, 從而實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)細(xì)胞的靶向作用。同時(shí), 還構(gòu)建了lamp2b-MSP融合載體, 多肽MSP可以特異性靶向肌肉細(xì)胞。通過將lamp2b-RVG、lamp2b-MSP融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入未成熟的DC細(xì)胞, 超速離心提取囊泡后, 通過電轉(zhuǎn)使多種siRNA轉(zhuǎn)入帶有靶向肽的外泌體中, 實(shí)現(xiàn)了對靶細(xì)胞靶基因的沉默。該研究表明, 外泌體可以通過血腦屏障對神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮作用。Ohno等[34]將可與EGFR(epidermal growth factor receptor)特異結(jié)合的多肽EGF和GE11分別克隆至pDisplay載體中, 轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞后通過pDisplay載體中的血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)跨膜區(qū)域, 將EGF和GE11表達(dá)在293T細(xì)胞來源的外泌體膜表面, 收集外泌體后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將腫瘤抑制劑miRNAlet-7轉(zhuǎn)入外泌體中, 靶向EGFR高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞。該研究使用了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染而非先前常用的電轉(zhuǎn)將微RNA裝載入外泌體中, 是因?yàn)楹椭把芯繄F(tuán)隊(duì)使用的細(xì)胞種類不同, 其獲得的外泌體不適合電轉(zhuǎn)。
Mizrak等[35]在HEK293T細(xì)胞里轉(zhuǎn)入含有胞嘧啶脫氨酶CD(產(chǎn)物為mRNA或蛋白質(zhì))和尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(uracil phosphoribosyl transferase, UPRT)融合基因的質(zhì)粒。CD可以將前體藥物5-氟胞嘧啶(5-FC)轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶(5-FU), 而5-氟尿嘧啶會特異對表達(dá)UPRT的細(xì)胞產(chǎn)生毒性, 收集的293T細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)會含有高豐度的治療性mRNA/蛋白質(zhì), 然后將該外泌體作用于神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞。在施加前體藥物5-FC的情況下, 會特異性地殺傷同時(shí)表達(dá)CD和UPRT的腫瘤細(xì)胞, 實(shí)現(xiàn)靶向作用。該研究首次將pCD-UPRT-EGFP質(zhì)粒和外泌體聯(lián)系起來, 為外泌體在癌癥及其他疾病的治療領(lǐng)域提供了證據(jù)。
外泌體自身表達(dá)的配體與受體細(xì)胞受體相互作用賦予了特殊種類的外泌體自體趨向作用。Morelli等[36]發(fā) 現(xiàn), DC細(xì) 胞 作 為 專 職APC(antigenpresenting cell), 其來源的外泌體表面表達(dá)的各種配體, 如抗體介導(dǎo)的CD11a、CD54、CD81、CD9的封閉, 或是受體細(xì)胞BMDC(bone marrow-deriveddendritic cell)表面αv和β3的同時(shí)封閉, 都會指導(dǎo)外泌體靶向到受體細(xì)胞BMDC或胞外基質(zhì)蛋白。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中起著重要的作用, 不同腫瘤細(xì)胞來源的外泌體對各自的作用部位或靶細(xì)胞都有著趨向性[37]。Hood等[38]將熒光標(biāo)記的黑色素瘤細(xì)胞來源的外泌體注射入小鼠的腳墊中, 發(fā)現(xiàn)外泌體集中存在于注射位點(diǎn)附近的淋巴結(jié)中, 而相同處理的脂質(zhì)體則平均分布在組織中且遠(yuǎn)離淋巴結(jié), 并且黑色素瘤細(xì)胞來源的外泌體可以靶向造血基質(zhì)細(xì)胞, 促進(jìn)新生血管形成。外泌體的這種趨向性與外泌體膜成分相關(guān), 原發(fā)性腫瘤中高表達(dá)整合蛋白α6β4和α6β1的外泌體會轉(zhuǎn)移到肺組織中, 但是表達(dá)整合蛋白αvβ5的外泌體會轉(zhuǎn)移到肝中。
此外, 一種新興的利用磁納米顆粒的外泌體靶向方法也正在興起。Qi等[39]利用轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的特異性結(jié)合, 將多個(gè)超順磁性粒子和小鼠血清共同孵育。血清中的網(wǎng)織紅細(xì)胞來源的外泌體表面有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體, 磁性粒子會結(jié)合在外泌體表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體上, 再通過外加磁場進(jìn)行攜帶磁性粒子外泌體的收集, 將阿霉素裝載至外泌體內(nèi)后注射到荷癌小鼠體內(nèi), 在腫瘤部位外加磁場即可起到特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。在靶向給藥領(lǐng)域中外泌體有巨大潛力, 靶向方法是關(guān)鍵, 現(xiàn)有最大問題是靶向效率較低, 且臨床應(yīng)用時(shí)易被自身免疫系統(tǒng)吞噬, 成為外泌體靶向給藥領(lǐng)域一個(gè)亟待解決的問題。
4 存在的問題與展望
作為一種新興的藥物載體, 外泌體在應(yīng)用方面還面臨著許多挑戰(zhàn)。外泌體無法實(shí)現(xiàn)臨床廣泛應(yīng)用的最主要原因是傳統(tǒng)培養(yǎng)的外泌體的產(chǎn)量較低, 且靶向給藥時(shí), 外泌體表面蛋白質(zhì)修飾在體內(nèi)也不穩(wěn)定, 外泌體易被體內(nèi)的巨噬細(xì)胞或者網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬, 在體內(nèi)存在時(shí)間短。Watson等[40]使用中空纖維反應(yīng)器高效生產(chǎn)具生物活性的胞外囊泡(extracellular vesicles, EV)較之傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng), 反應(yīng)器培養(yǎng)的每mL培養(yǎng)基可以產(chǎn)生的EV量是后者的40倍。有研究表明, 單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞通過SRA(scavenger receptor class-A family)受體攝取表面含有SR-A的外泌體, 如果使用硫酸葡聚糖封閉小鼠體內(nèi)的SR-A, 能顯著減少肝對外泌體的攝取。Kundra等[41]通過在外泌體修飾常用膜蛋白lamp1、lamp2上進(jìn)行N-糖基化(N-glycosylation)修飾, 有效地保護(hù)了lamp1、lamp2在體內(nèi)不被水解, 增強(qiáng)了外泌體的穩(wěn)定性。
在癌癥及免疫治療中, 往往需要靶向給藥, 減少對正常細(xì)胞的毒害。外泌體作為一種有靶向潛力且可遞送藥物的天然載體, 具有內(nèi)源的治療機(jī)制、很好的免疫相容性及遞送多種藥物的能力, 在臨床上有著巨大的應(yīng)用潛力。外泌體的分離純化方式有著局限性, 現(xiàn)有的分離純化方式主要有超速離心, 蔗糖密度梯度離心, 利用試劑盒進(jìn)行分離及免疫分離[42],在臨床應(yīng)用上均費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。此外, 不同細(xì)胞來源的外泌體有著不同的組成, 即使是一種來源的外泌體對于受體細(xì)胞也會有多種功能, 在臨床上不能普適或可控[15], 對外泌體的進(jìn)一步研究和改造將有助于這些問題的解決并推動(dòng)外泌體在臨床上作為藥物載體的應(yīng)用。
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