摘要：氧化反應(yīng)不僅與許多慢性疾病相關(guān)，同時(shí)亦是食品酸敗的誘因之一，能夠降低食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值并縮短貨架期。近年來(lái)，具有抗氧化活性的肽氨基酸組成、排列順序及空間構(gòu)象已被廣泛報(bào)道。隨著相關(guān)研究的不斷深入，肽的構(gòu)效關(guān)系已逐步成為闡明其抗氧化機(jī)制的核心問(wèn)題。當(dāng)前研究中，從陸地動(dòng)物中分離的抗氧化肽，其抗氧化作用機(jī)制已基本明晰。然而，針對(duì)蛋白質(zhì)含量的更高的魚(yú)類(lèi)資源，其抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系研究甚少。因此，本文基于抗氧化肽電子轉(zhuǎn)移清除自由基、氫原子轉(zhuǎn)移清除自由基和螯合促氧化金屬離子的作用機(jī)制，對(duì)魚(yú)類(lèi)源抗氧化肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)活性產(chǎn)生的重要影響進(jìn)行綜述。重點(diǎn)分析含硫氨基酸、芳香族氨基酸、部分疏水性氨基酸和部分中性氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸對(duì)抗氧化活性的影響，以期指導(dǎo)抗氧化肽相關(guān)食品的研發(fā)，深度拓展抗氧化肽產(chǎn)品的消費(fèi)市場(chǎng)。
活性氧（reactive oxygen species，ROS）在有氧生物的新陳代謝和呼吸過(guò)程中自然產(chǎn)生[1]，當(dāng)自由基產(chǎn)生過(guò)多或產(chǎn)生后沒(méi)有被完全清除時(shí)，它們可以攻擊附近的分子，使其失去電子，缺少電子的分子會(huì)攻擊其他分子，造成氧化損傷[2]。目前，天然或合成抗氧化肽[3-5]可以作為外源性抗氧化劑維持體內(nèi)或油脂的氧化還原平衡、預(yù)防和治療疾病。因它們比酶類(lèi)抗氧化劑結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，更穩(wěn)定，不會(huì)產(chǎn)生危險(xiǎn)的免疫反應(yīng)，從而備受青睞[6]。
利用自然資源篩選和獲得具有明確結(jié)構(gòu)的抗氧化效用的肽產(chǎn)品正在成為食品和醫(yī)療行業(yè)的動(dòng)力。2021年我國(guó)魚(yú)類(lèi)總產(chǎn)量超過(guò)3561萬(wàn)噸，占水產(chǎn)品總產(chǎn)量的1/2以上[7]，魚(yú)類(lèi)加工過(guò)程中產(chǎn)生了約占魚(yú)體50%~70%的副產(chǎn)物[8]，包括：頭、皮膚、骨骼、鱗片、鰭和內(nèi)臟等[9]。魚(yú)蛋白是一種極佳的抗氧化肽來(lái)源，與微藻、雞蛋、大豆等原料蛋白相比，魚(yú)類(lèi)蛋白富含Arg、Lys和Gly，從魚(yú)的不同部位制備的水解液可以作為必需氨基酸的良好來(lái)源，且其容易被人體吸收[10]。因此，與其他蛋白資源相比，魚(yú)蛋白具有不同的氨基酸的種類(lèi)和水平[10]，這為制備出不同結(jié)構(gòu)的抗氧化肽帶來(lái)更多的可能性。
近年來(lái)，針對(duì)抗氧化肽制備、分離純化和鑒定序列方面的研究較多，當(dāng)前研究人員主要通過(guò)酶解或發(fā)酵[11]生產(chǎn)，并且可以與超聲波[12]、微波[13]、高壓脈沖電場(chǎng)[14]和超臨界水萃取[14]等預(yù)處理技術(shù)結(jié)合，以獲得更高的產(chǎn)量和投入更低的成本。當(dāng)前關(guān)于抗氧化肽活性位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)特征與功能方面有一定的顯示報(bào)道，但其構(gòu)效關(guān)系與作用機(jī)制仍處于探索階段。一直以來(lái)，氨基酸類(lèi)型和序列被認(rèn)為是決定肽的抗氧化性能的重要因素[15]。蛋白質(zhì)中存在的20種氨基酸可以與自由基反應(yīng)，表1羅列了近年來(lái)的魚(yú)類(lèi)抗氧化肽的作用機(jī)制，說(shuō)明了氨基酸的結(jié)構(gòu)特性與抗氧化能力的關(guān)系。此外，抗氧化肽的相互作用和二級(jí)結(jié)構(gòu)影響抗氧化肽活性的高低，協(xié)同作用能增強(qiáng)整體抗氧化肽的活性，拮抗作用會(huì)減弱整體抗氧化肽的作用[16]。不論是一級(jí)結(jié)構(gòu)的相互作用[17]，還是混合肽之間的相互作用，都會(huì)影響肽作為抗氧化劑的能力強(qiáng)弱[16]。水解及預(yù)處理手段會(huì)使有序結(jié)構(gòu)和無(wú)序結(jié)構(gòu)二者發(fā)生轉(zhuǎn)換，結(jié)果是造成了肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量與肽的活性成正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。
1 一級(jí)結(jié)構(gòu)與清除自由基能力的關(guān)系
Phe、Tyr和Trp能通過(guò)其芳香環(huán)、酚羥基或吲哚基團(tuán)賦予肽抗氧化活性，它們的作用機(jī)制是圖1中的b途徑，利用單電子轉(zhuǎn)移去除自由基[25]，而Tyr的作用機(jī)制還包括a途徑。Phe的結(jié)構(gòu)中含有芳香環(huán)和酚羥基，它可以通過(guò)電子的共振或離域來(lái)穩(wěn)定各種形式的ROS，將其轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的苯氧基，抑制自由基介導(dǎo)的過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的傳播[27-28]。鮭魚(yú)胸鰭蛋白肽FLNEFLHV（Phe-Leu-Asn-Glu-Phe-Leu-His-Val）具有較好的DRSA、ABTS（ABTS radicals scavenging activity，ABTS）自由基清除活性和還原力，肽序列中的Phe作為抗氧化活性位點(diǎn)使肽產(chǎn)生抗氧化效果[29]。Tyr在結(jié)構(gòu)上與p-香豆酸相似，p-香豆酸是一種芳香環(huán)上存在一個(gè)羥基且具有強(qiáng)抗氧化活性的酚類(lèi)化合物[30]。肽鏈中Tyr的抗氧化機(jī)制是其酚羥基能作為氫供體清除自由基，而且Tyr也對(duì)目標(biāo)疏水蛋白有很強(qiáng)親和力[31]。尼羅羅非魚(yú)皮肽YGDEY（Tyr-Gly-Asp-Glu-Tyr）具有較強(qiáng)HRSA活性，序列中的活性位點(diǎn)是因?yàn)镃端和N端存在的Tyr[32]。從鯉魚(yú)皮膚蛋白中提取得到的肽AY（Ala-Tyr）具有較好的亞鐵離子螯合能力（ferrous ion chelating capacity，F(xiàn)ICP）、還原力和DRSA，經(jīng)過(guò)體外消化后具有強(qiáng)穩(wěn)定性，C端Tyr的存在增強(qiáng)了自由基的清除活性[33]。草魚(yú)皮蛋白肽有PYSFK（Pro-Tyr-Ser-Phe-Lys）、GFGPEL（Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Leu）和VGRP（Val-Gly-Arg-Pro），其中PYSFK具有最強(qiáng)的DRSA和ABTS自由基清除能力，這歸功于肽序列的芳香族氨基酸Tyr的酚羥基發(fā)揮作用，而肽序列中不含芳香族氨基酸的VGRP的抗氧化能力最弱[34]。Trp是一種側(cè)鏈有吲哚基團(tuán)的非極性芳香族氨基酸[35]，吲哚基比過(guò)氧自由基更穩(wěn)定，壽命更長(zhǎng)，因此任何逆反應(yīng)或自由基介導(dǎo)的過(guò)氧連鎖反應(yīng)的傳播都會(huì)受到抑制[36]。Trp將吲哚基團(tuán)中的質(zhì)子捐贈(zèng)給缺電子的自由基，從而保持自由基穩(wěn)定，提高肽的自由基清除活性[36]。古氏魟蛋白肽WAFAPA（Trp-Ala-Phe-Ala-Pro-Ala）比GSH有更強(qiáng)的抗氧化活性，其中Trp發(fā)揮了重要作用[16]。
疏水性氨基酸包括Leu、Val、Gly、Pro、Met、Phe、Trp、Ala和Ile，疏水性氨基酸有利于提升肽在水油介質(zhì)中的溶解度[16]，增加對(duì)脂溶性自由基或多不飽和脂肪酸的可及性和相互作用[37-38]，促進(jìn)質(zhì)子向脂質(zhì)衍生的自由基的遞送過(guò)程，抑制氧化損傷的產(chǎn)生[36]。如圖1的作用機(jī)制d所示，含有Leu和Ala的肽的抗氧化能力歸因于它的長(zhǎng)脂族側(cè)鏈[35]，能夠與易感脂肪酸的�；湴l(fā)生相互作用，馬鯖魚(yú)內(nèi)臟肽ACFL（Ala-Cys-Phe-Leu）含有Leu和Ala，其抑制多不飽和脂肪酸的能力高于天然抗氧化劑α-生育酚[4]。此外，Leu和Val的側(cè)鏈烯丙基氫含有豐富且活性高的氫原子，容易與自由基反應(yīng)[39]，因此，Leu和Val符合圖1中a和b抗氧化機(jī)制。大黃魚(yú)魚(yú)鱗肽QRPPEPR（Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Pro-Arg）、EKVWKYCD（Glu-Lys-Val-Trp-Lys-Tyr-Cys-Asp）和VGLPGLSGPVG（Val-Gly-Leu-Pro-Gly-Leu-Ser-Gly-Pro-Val-Gly），它們的DRSA清除率分別為55.1%、55.1%和59.1%，肽序列中含有兩個(gè)Val的VGLPGLSGPVG對(duì)DPPH自由基的清除效果最好[40]。
Gly和Pro通過(guò)其特殊結(jié)構(gòu)賦予肽抗氧化活性，而且Gly和Pro能影響肽的二級(jí)構(gòu)象[40-41]，進(jìn)而影響功能活性。Gly的抗氧化機(jī)制是圖1中的a途徑，氨基酸作為供氫體，通過(guò)轉(zhuǎn)移氫原子清除自由基。Gly側(cè)鏈由一個(gè)氫原子組成，為肽的主鏈提供高度靈活性，因而改變肽的空間結(jié)構(gòu)。Wu等[41]發(fā)現(xiàn)隨著合成肽序列PMRGGGGYHY（Pro-Met-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Tyr-His-Tyr）中Gly的減少，肽鍵形成的分子內(nèi)氫鍵的數(shù)量越少，抗氧化肽更多的活性位點(diǎn)暴露出來(lái)，ORAC逐漸增強(qiáng)。帶魚(yú)肌肉蛋白肽IYG（Ile-Tyr-Gly）之所以具有較高的自由基清除能力、還原能力和亞油酸模型體系中的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力，是因?yàn)镚ly側(cè)鏈上的單個(gè)氫原子可以充當(dāng)質(zhì)子供體，中和活性自由基，而且其肽鏈短的優(yōu)勢(shì)更容易讓肽的活性位點(diǎn)接觸到靶點(diǎn)，有助于肽發(fā)揮生物活性[42]。Pro可以誘導(dǎo)二級(jí)結(jié)構(gòu)彎曲，增加氨基酸發(fā)揮作用的可用性[40]。Pro的作用機(jī)制是圖1中的b途徑，利用單電子轉(zhuǎn)移去除自由基。扁舵鰹蛋白肽GAGGP（Gly-Ala-Gly-Gly-Pro）具有較好的DRSA活性[43]，序列中的Pro有一個(gè)富含電子的吡咯烷酮環(huán)，由于其較低的電離勢(shì)，可以增加肽鏈的靈活性，也可以淬滅單線態(tài)氧[43-44]，從路氏雙髻鯊軟骨蛋白中提取得到含有Pro的肽GPE（Gly-Pro-Glu）在亞油酸模型體系中表現(xiàn)出類(lèi)似于抗氧化劑BHT的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性，其芳香側(cè)鏈在抗氧化反應(yīng)中充當(dāng)電子給體[45]。
如圖1的a途徑所示，Asn、Gln、Thr和Ser可以作為氫供體，通過(guò)提供氫原子阻礙抗氧化反應(yīng)。在中性pH環(huán)境下，Asn和Gln可以提供氫原子，進(jìn)而吸引帶有正電荷的自由基來(lái)增加肽的抗氧化活性[20]。Thr和Ser都可以作為氫供體來(lái)中和自由基。黑鯊魚(yú)皮中鑒定得到的含有Thr的五肽PGGTM（Pro-Gly-Gly-Thr-Met）被報(bào)道具有強(qiáng)DRSA和ORAC[46]。在圓鱘蛋白中鑒定得到的所有肽中，肽序列中Thr使肽ILGATIDNSK（Ile-Leu-Gly-Ala-Thr-Ile-Asp-Asn-Ser-Lys）具有最強(qiáng)的DRSA和ABTS自由基清除能力[47]。印度魷魚(yú)寡肽WCTSVS（Trp-Cys-Thr-Ser-Val-Ser）Ser的羥基參與了該肽的抗氧化活性，防止DNA損傷和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化[48]。而且，一同分離出的寡肽SVNVPLY（Ser-Val-Asn-Val-Pro-Leu-Tyr）被報(bào)道其還原力顯著高于YRIVPL（Tyr-Arg-Ile-Val-Pro-Leu）的原因是前者的N端存在Ser[30]。
His、Lys和Arg是抗氧化肽序列中常見(jiàn)的堿性氨基酸。His的作用機(jī)制包括圖1中的a、b和c途徑[25]。His的咪唑基團(tuán)和Arg的側(cè)鏈能提供氫原子與自由基反應(yīng)，使肽發(fā)揮抗氧化作用。His的咪唑基團(tuán)是抗氧化肽的重要活性位點(diǎn)[28]，因?yàn)樗梢宰鳛闅涔w和脂質(zhì)過(guò)氧自由基陷阱[49]。同時(shí)His可以通過(guò)給電子將自由基轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定分子，同時(shí)通過(guò)共振結(jié)構(gòu)保持自身的穩(wěn)定性[50]。而且咪唑的氧化產(chǎn)物是咪唑啉酮，咪唑啉酮也具有抗氧化活性[51]。Chen等[52]發(fā)現(xiàn)，采用D-His取代抗氧化肽PHH（Pro-His-His）中的L-His會(huì)導(dǎo)致其活性下降，推測(cè)這與咪唑環(huán)的位置、方向和其供電子能力有關(guān)。沙魚(yú)肌肉蛋白肽ATSHH（Ala-Thr-Ser-His-His）序列中含有兩個(gè)His，在1 mg/mL的濃度下，寡肽對(duì)DPPH自由基的清除能力高達(dá)90%以上，這歸因于His咪唑基團(tuán)的供質(zhì)子能力[53]。鯪魚(yú)皮蛋白肽TAGHPGTH（Thr-Ala-Gly-His-Pro-Gly-Thr-His）具有ORAC活性，序列中His的咪唑環(huán)提供氫原子，以電子共軛的方式穩(wěn)定自身結(jié)構(gòu)，從而阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[54]。Lys的抗氧化機(jī)制如圖1中的c途徑所示，帶正電荷的堿性氨基酸與帶相反電荷的金屬離子結(jié)合，阻礙氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)行。Arg的抗氧化機(jī)制包括圖1中的a和c途徑。Arg的側(cè)鏈能提供氫原子與ABTS自由基發(fā)生反應(yīng)，海鱸魚(yú)皮肽GLFGPR（Gly-Leu-Phe-Gly-Pro-Arg）和GATGPQGPLGPR（Gly-Ala-Thr-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg）具有較強(qiáng)的抗氧化能力，兩個(gè)肽的C末端包含的Arg賦予肽抗氧化能力[55]。鯛魚(yú)魚(yú)糜肽FLGSFL（Phe-Leu-Gly-Ser-Phe-Leu）和YEYSR（Tyr-Glu-Tyr-Ser-Arg）具有較強(qiáng)的ABTS自由基清除能力和FICP，這是因?yàn)樾蛄兄械腁rg能通過(guò)其帶電殘基與金屬離子相互作用，并使金屬離子失去氧化活性[56]。鱘魚(yú)皮蛋白肽GDRGEESGPA（Gly-Asp-Arg-Gly-Glu-Glu-Ser-Gly-Pro-Ala）是鑒定中獲得的所有肽中具有最強(qiáng)的DRSA活性的肽[57]，Arg在肽序列中的存在和位置決定了肽的抗氧化活性，當(dāng)Arg位于靠近N末端的第三個(gè)位置時(shí)具有較好抗氧化活性[3]，而其他肽具有較低DRSA活性的原因是序列中缺乏Arg。除了圖1中的抗氧化機(jī)制外，His、Lys和Arg也具有細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力，董麗莎等[58]采用分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)黑線鱈魚(yú)皮中鑒定的肽VIFFVTMGTPR（Val-Ile-Phe-Phe-Val-Thr-Met-Gly-Thr-Pro-Arg）與Keap1蛋白結(jié)合最穩(wěn)定，序列中的His、Lys和Arg所提供的電荷吸引力、氫鍵、碳?xì)滏I、烷基鍵和π烷基鍵有助于二者緊密結(jié)合，阻斷核轉(zhuǎn)錄因子（NF-E2-related factor 2,Nrf2）信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）的抗氧化保護(hù)效應(yīng)。
酸性氨基酸包括Glu和Asp，其抗氧化機(jī)制如圖1的a和c途徑所示，Glu和Asp既能清除自由基，還能螯合金屬離子，減弱金屬離子的促氧化作用，抵抗脂質(zhì)氧化[20]。Glu的側(cè)鏈還可以提供一個(gè)氫原子作為還原劑，猝滅自由基[59]。赤魟軟骨蛋白肽VPR（Val-Pro-Arg）、IEPH（Ile-Glu-Pro-His）、LEEEE（Leu-Glu-Glu-Glu-Glu）和IEEEQ（Ile-Glu-Glu-Glu-Gln）具有強(qiáng)自由基清除能力，序列中的Glu是肽的主要活性位點(diǎn)[60]。甲鯰魚(yú)水解液的ORAC值與藍(lán)莓、蘋(píng)果和橙子等水果的ORAC值相似，從中鑒定的多個(gè)肽序列都存在IEE（Ile-Glu-Glu）或IEEE（Ile-Glu-Glu-Glu）序列，IEE重復(fù)序列是高抗氧化活性的部分原因[61]。扁舵鰹蛋白肽VE（Val-Glu），在去除H2O2過(guò)程中，序列中的Glu通過(guò)產(chǎn)生氧化型谷胱甘肽（glutathione，GSH）來(lái)提供抗氧化活性[43]。鰹魚(yú)魚(yú)頭蛋白肽WMFDW（Trp-Met-Phe-Asp-Trp）和EMGPA（Glu-Met-Gly-Pro-Ala），肽序列的Asp和Glu在清除羥基自由基的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[62]。鰱魚(yú)肌肉蛋白肽MYPGIGDR（Met-Tyr-Pro-Gly-Ile-Gly-Asp-Arg）和ADLVHVQ（Ala-Asp-Leu-Val-His-Val-Gln）都具有較強(qiáng)DRSA，C末端旁邊第二個(gè)氨基酸位置是Glu或Asp能更有效地對(duì)中斷氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，減少有害ROS的產(chǎn)生，有助于增強(qiáng)肽的自由基清除活性和還原能力[63]。
2 一級(jí)結(jié)構(gòu)與金屬離子螯合能力的關(guān)系
氨基酸側(cè)鏈的基團(tuán)與金屬離子螯合活性有關(guān)，帶正電的堿性氨基酸側(cè)鏈上的羧基失去氧原子與金屬離子形成絡(luò)合物[60]，帶負(fù)電的酸性氨基酸側(cè)鏈上的氨基失去氮原子，氮原子未共享的電子對(duì)與金屬離子結(jié)合，酸性氨基酸螯合Fe2+的還原方式與抗壞血酸類(lèi)似[61]，生成具有三齒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定鐵螯合物[73]。堿性氨基酸的羧基、Asp的游離γ-羧基和Glu的游離δ-羧基與金屬離子結(jié)合[73]，His的咪唑環(huán)、Cys的巰基、Trp的吲哚基和Thr的羥基[1]以及Ser的羥基[74]可以提供額外的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。
3 二級(jí)結(jié)構(gòu)與抗氧化活性的關(guān)系
肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲。來(lái)源于β-乳球蛋白的多肽WYSLAMAASDI（Trp-Tyr-Ser-Leu-Ala-Met-Ala-Ala-Ser-Asp-Ile）的ORAC活性比抗氧化劑BHA強(qiáng)，而且相對(duì)應(yīng)的等摩爾游離氨基酸的混合物具有更高活性，而寡肽YVEEL（Tyr-Val-Glu-Glu-Leu）卻正好相反，其氨基酸混合物的ORAC比寡肽低2倍[75]。這說(shuō)明肽鍵或者肽鏈的空間結(jié)構(gòu)既可能降低也可能提高多肽的抗氧化活性。
α-螺旋主要通過(guò)羰基氧（-CO）和氨基氫（NH-）兩種基團(tuán)之間的分子內(nèi)氫鍵形成，氨基酸越多的肽更容易形成α-螺旋結(jié)構(gòu)[28]。α-螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域具有較高的兩親性，有助于肽在界面發(fā)揮抗氧化作用[76]。α-螺旋在肽的抗氧化能力中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，鮭魚(yú)皮水解液具有較好的自由基清除能力，采用紅外光譜分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋含量占比最高，無(wú)規(guī)卷曲含量占比最低，水解液的ABTS、HRSA和超氧自由基清除活性（superoxide anion radical scavenging capacity，SRSA）分別為1.86、1.65和2.72 mg/mL[77]。也有研究結(jié)果表現(xiàn)出α-螺旋比例越低，肽具有的抗氧化能力更強(qiáng)。由拉普光譜測(cè)定金線鯛肌肉水解物的二級(jí)結(jié)構(gòu)，α-螺旋占比最大，為47.88%，無(wú)規(guī)卷曲占比最小，為10.3%。經(jīng)200 W超聲波處理后，α-螺旋比例降低至0.78%，無(wú)規(guī)卷曲含量增加至12.33%，酶解產(chǎn)物的DRSA的IC50值降低，說(shuō)明抗氧化活性增加[12]。
β-折疊通過(guò)多肽鏈之間維持穩(wěn)定性的鏈間氫鍵形成，有序結(jié)構(gòu)α-螺旋和β-折疊主要位于蛋白質(zhì)內(nèi)部位置，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)由弱氫鍵結(jié)構(gòu)產(chǎn)生[12]。肽的抗氧化活性與三維結(jié)構(gòu)特征β-轉(zhuǎn)角的貢獻(xiàn)有關(guān)，黑魚(yú)消化液中分離出的四個(gè)肽具有的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的占總多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的75%，其中鑒定出的肽PGMLGGSPPGLLGGSPP的DRSA活性與GSH相當(dāng)，肽SDGSNIHFPN的FICP活性與EDTA相當(dāng)[78]。東方鲀魚(yú)皮和市售魚(yú)皮肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以β-折疊為主，兩種肽再經(jīng)消化酶水解后，β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲含量降低，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量增加，其中市售魚(yú)皮肽的DRSA清除率由7.89%增加到28.77%，而東方鲀魚(yú)皮肽的DRSA清除率減弱，東方鲀魚(yú)皮經(jīng)過(guò)消化，α-螺旋含量的增加造成了其DRSA清除率和總還原能力降低[79]。此外，Yang等[80]認(rèn)為較高的β-折疊含量和較低的α-螺旋可能與肽的抗氧化活性有一定的相關(guān)性。
無(wú)規(guī)線圈由未折疊構(gòu)象產(chǎn)生，它與肽鏈的靈活度有關(guān)[12]。關(guān)于無(wú)規(guī)線圈的含量與二級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)系不成正比或反比關(guān)系，比例高的無(wú)規(guī)卷曲能使肽的結(jié)構(gòu)更加松散，暴露更多的活性位點(diǎn)，有利于和自由基結(jié)合[81]。有序結(jié)構(gòu)向無(wú)序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變能使肽抗氧化活性增強(qiáng)[82]，從三文魚(yú)骨中提取的低聚肽粉具有較強(qiáng)ABTS和還原力，使用紫外光譜和圓二色譜分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，α-螺旋和平行式β-折疊含量?jī)深?lèi)結(jié)構(gòu)占比最小，無(wú)規(guī)卷曲含量占比最大。經(jīng)過(guò)高壓脈沖電場(chǎng)處理后的松仁蛋白肽Ac-QWFCT（Ac表示N端乙�；疓ln），其無(wú)規(guī)線圈含量與抗氧化活性成相反趨勢(shì)[83]。當(dāng)肽的無(wú)規(guī)卷曲含量為32.5%時(shí)，其具有最佳的抗氧化活性。王瑩等[84]利用紅外光譜、核磁共振光譜、Zeta電位和圓二色譜分析高壓脈沖電場(chǎng)處理的寡肽KWFH（Lys-Trp-Phe-His），發(fā)現(xiàn)KWFH的羧酸羰基的C=O和苯環(huán)的氫質(zhì)子發(fā)生變化，電位改變使二級(jí)結(jié)構(gòu)變得更加無(wú)序，DRSA清除率較PEF處理前增強(qiáng)了13.92%。
4 一級(jí)結(jié)構(gòu)與肽的相互作用
氨基酸或序列的增加或缺失可以增強(qiáng)肽的抗氧化活性，也可以削弱肽的抗氧化活性，這與抗氧化肽的分子量、肽鍵和氫鍵有關(guān)[85]。Gopinatth等[17]從金槍魚(yú)骨干蛋白中提取出肽APTBP，將其任意一端替換Trp使肽的ABTS活性提高63.1%，而肽的兩端都替換Trp后，ABTS活性降低10.3%。肽序列中氨基酸之間的協(xié)同效應(yīng)在其抗氧化活性中發(fā)揮重要作用。通過(guò)自由基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，被氧化的氨基酸可以將自由基損傷交換到鄰近的氨基酸，使反應(yīng)產(chǎn)物更穩(wěn)定[86]。Liu等[87]認(rèn)為肽鏈中Tyr的酚羥基的活性影響整體的抗氧化性能，當(dāng)Tyr處于DD（Asp-Asp）或DQ（Gln-Asp）之間時(shí)抗氧化活性會(huì)增加，因?yàn)镈D或DQ中的氨基酸側(cè)鏈的羧酸基團(tuán)的親電性削弱了酚羥基的氧電子云密度，還增強(qiáng)了供應(yīng)和釋放氫質(zhì)子的能力。同樣，Bamdad等[86]認(rèn)為五肽QPYPQ中的P和Y的交替序列對(duì)穩(wěn)定自由基有積極作用。Najafian等[88]在羅馬魚(yú)（L. plantarum）水解液中鑒定了與之有相同結(jié)構(gòu)基序PYP（Pro-Tyr-Pro）的肽AIPPHPYP（Ala-Ile-Pro-Pro-His-Pro-Tyr-Pro），此肽的DRSA、ABTS和還原力的IC50分別為1.38、0.873和0.456 mg/mL。因此，肽序列中的氨基酸存在的相互作用對(duì)肽的活性有一定影響，其影響程度還有待進(jìn)一步研究。
單個(gè)肽與混合肽的抗氧化活性不同，古氏魟蛋白肽WAFAPA（Trp-Ala-Phe-Ala-Pro-Ala）和MYPGLA（Met-Tyr-Pro-Gly-Leu-Ala）清除ABTS自由基的實(shí)驗(yàn)值大于計(jì)算的理論值，兩個(gè)肽之間潛在的協(xié)同作用能幫助它們?cè)诠δ苄允称分邪l(fā)揮更好的抗氧化作用[16]。同樣，在半鰭鳀魚(yú)肽NKVKGELD、EMSAGLHE和WRKKDPLND中，盡管單個(gè)肽NKVKGELD的DRSA活性很弱，但它與其他兩個(gè)肽分別組合后的抗氧化活性增強(qiáng)[89]。金線魚(yú)魚(yú)糜多肽FLGSFLYEYSR的ABTS自由基清除率為2.448 mmol/L Trolox，與一同分離出的其他肽組合后，混合物的抗氧化能力降至1.962 mmol/L Trolox[56]。Halim等[90]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，10000 Da的鰻魚(yú)蛋白超濾液的DRSA活性超過(guò)了3000和5000 Da超濾液，盡管許多研究人員認(rèn)為超濾液的分子量與其抗氧化活性成負(fù)相關(guān)[91]，但多個(gè)肽的相互作用說(shuō)明分子量不是唯一影響混合肽抗氧化活性的因素。
5 結(jié)論
抗氧化肽的活性歸因于其立體空間結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸基團(tuán)、酸堿性、親疏水性、相互作用和二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)抗氧化肽活性產(chǎn)生重要影響。His、Arg、Lys、Glu和Asp作為極性帶電氨基酸可以吸引帶有異性電荷的自由基和金屬離子，賦予肽抗氧化能力。含硫氨基酸的巰基，芳香族氨基酸的苯環(huán)、酚羥基、吲哚基團(tuán)，部分疏水性氨基酸的長(zhǎng)脂肪族側(cè)鏈，部分中性氨基酸的羥基，酸性氨基酸和堿性氨基酸的羧基這些官能團(tuán)都對(duì)抗氧化肽的活性有顯著影響。具體來(lái)說(shuō)，Gly，Asp、Glu、Leu、Val、Cys、Ser、Thr、Arg、Tyr和Glu清除自由基的作用機(jī)制是提供氫原子。Ile、Leu、Ala、Lys、Val和Met等疏水性氨基酸的抗氧化作用機(jī)制主要是清除脂類(lèi)自由基和增強(qiáng)水油界面的溶解度，延緩脂質(zhì)氧化。Met、Tyr、Trp、His、Phe、Pro和Trp的作用機(jī)制是通過(guò)提供電子穩(wěn)定自由基。
魚(yú)類(lèi)抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定不僅局限于鑒定氨基酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)，還應(yīng)深入開(kāi)發(fā)新型鑒定結(jié)構(gòu)的方法。闡明肽與其抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系，能夠降低成本和增加經(jīng)濟(jì)效益。此外，未來(lái)探究多肽鏈的氨基酸增加、減少、替換等修飾處理，以及探究氨基酸序列、位置、組成和側(cè)鏈糖基化程度對(duì)抗氧化活性的影響，有助于為抗氧化肽的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，指導(dǎo)新型抗氧化肽開(kāi)發(fā)市場(chǎng)。此外，利用生物信息學(xué)技術(shù)和同源建模方法對(duì)肽的氨基酸序列進(jìn)行分析，能夠更好地了解其構(gòu)效關(guān)系。研發(fā)表征抗氧化肽在細(xì)胞中構(gòu)效關(guān)系的相應(yīng)工具，有助于進(jìn)一步剖析肽的抗氧化機(jī)制，指導(dǎo)抗氧化肽的定制化設(shè)計(jì)。
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