摘要：氧化反應不僅與許多慢性疾病相關(guān)，同時亦是食品酸敗的誘因之一，能夠降低食品營養(yǎng)價值并縮短貨架期。近年來，具有抗氧化活性的肽氨基酸組成、排列順序及空間構(gòu)象已被廣泛報道。隨著相關(guān)研究的不斷深入，肽的構(gòu)效關(guān)系已逐步成為闡明其抗氧化機制的核心問題。當前研究中，從陸地動物中分離的抗氧化肽，其抗氧化作用機制已基本明晰。然而，針對蛋白質(zhì)含量的更高的魚類資源，其抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系研究甚少。因此，本文基于抗氧化肽電子轉(zhuǎn)移清除自由基、氫原子轉(zhuǎn)移清除自由基和螯合促氧化金屬離子的作用機制，對魚類源抗氧化肽的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)對活性產(chǎn)生的重要影響進行綜述。重點分析含硫氨基酸、芳香族氨基酸、部分疏水性氨基酸和部分中性氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸對抗氧化活性的影響，以期指導抗氧化肽相關(guān)食品的研發(fā)，深度拓展抗氧化肽產(chǎn)品的消費市場。
活性氧（reactive oxygen species，ROS）在有氧生物的新陳代謝和呼吸過程中自然產(chǎn)生[1]，當自由基產(chǎn)生過多或產(chǎn)生后沒有被完全清除時，它們可以攻擊附近的分子，使其失去電子，缺少電子的分子會攻擊其他分子，造成氧化損傷[2]。目前，天然或合成抗氧化肽[3-5]可以作為外源性抗氧化劑維持體內(nèi)或油脂的氧化還原平衡、預防和治療疾病。因它們比酶類抗氧化劑結(jié)構(gòu)簡單，更穩(wěn)定，不會產(chǎn)生危險的免疫反應，從而備受青睞[6]。
利用自然資源篩選和獲得具有明確結(jié)構(gòu)的抗氧化效用的肽產(chǎn)品正在成為食品和醫(yī)療行業(yè)的動力。2021年我國魚類總產(chǎn)量超過3561萬噸，占水產(chǎn)品總產(chǎn)量的1/2以上[7]，魚類加工過程中產(chǎn)生了約占魚體50%~70%的副產(chǎn)物[8]，包括：頭、皮膚、骨骼、鱗片、鰭和內(nèi)臟等[9]。魚蛋白是一種極佳的抗氧化肽來源，與微藻、雞蛋、大豆等原料蛋白相比，魚類蛋白富含Arg、Lys和Gly，從魚的不同部位制備的水解液可以作為必需氨基酸的良好來源，且其容易被人體吸收[10]。因此，與其他蛋白資源相比，魚蛋白具有不同的氨基酸的種類和水平[10]，這為制備出不同結(jié)構(gòu)的抗氧化肽帶來更多的可能性。
近年來，針對抗氧化肽制備、分離純化和鑒定序列方面的研究較多，當前研究人員主要通過酶解或發(fā)酵[11]生產(chǎn)，并且可以與超聲波[12]、微波[13]、高壓脈沖電場[14]和超臨界水萃取[14]等預處理技術(shù)結(jié)合，以獲得更高的產(chǎn)量和投入更低的成本。當前關(guān)于抗氧化肽活性位點、結(jié)構(gòu)特征與功能方面有一定的顯示報道，但其構(gòu)效關(guān)系與作用機制仍處于探索階段。一直以來，氨基酸類型和序列被認為是決定肽的抗氧化性能的重要因素[15]。蛋白質(zhì)中存在的20種氨基酸可以與自由基反應，表1羅列了近年來的魚類抗氧化肽的作用機制，說明了氨基酸的結(jié)構(gòu)特性與抗氧化能力的關(guān)系。此外，抗氧化肽的相互作用和二級結(jié)構(gòu)影響抗氧化肽活性的高低，協(xié)同作用能增強整體抗氧化肽的活性，拮抗作用會減弱整體抗氧化肽的作用[16]。不論是一級結(jié)構(gòu)的相互作用[17]，還是混合肽之間的相互作用，都會影響肽作為抗氧化劑的能力強弱[16]。水解及預處理手段會使有序結(jié)構(gòu)和無序結(jié)構(gòu)二者發(fā)生轉(zhuǎn)換，結(jié)果是造成了肽的二級結(jié)構(gòu)含量與肽的活性成正相關(guān)或負相關(guān)。
1 一級結(jié)構(gòu)與清除自由基能力的關(guān)系
Phe、Tyr和Trp能通過其芳香環(huán)、酚羥基或吲哚基團賦予肽抗氧化活性，它們的作用機制是圖1中的b途徑，利用單電子轉(zhuǎn)移去除自由基[25]，而Tyr的作用機制還包括a途徑。Phe的結(jié)構(gòu)中含有芳香環(huán)和酚羥基，它可以通過電子的共振或離域來穩(wěn)定各種形式的ROS，將其轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的苯氧基，抑制自由基介導的過氧化鏈式反應的傳播[27-28]。鮭魚胸鰭蛋白肽FLNEFLHV（Phe-Leu-Asn-Glu-Phe-Leu-His-Val）具有較好的DRSA、ABTS（ABTS radicals scavenging activity，ABTS）自由基清除活性和還原力，肽序列中的Phe作為抗氧化活性位點使肽產(chǎn)生抗氧化效果[29]。Tyr在結(jié)構(gòu)上與p-香豆酸相似，p-香豆酸是一種芳香環(huán)上存在一個羥基且具有強抗氧化活性的酚類化合物[30]。肽鏈中Tyr的抗氧化機制是其酚羥基能作為氫供體清除自由基，而且Tyr也對目標疏水蛋白有很強親和力[31]。尼羅羅非魚皮肽YGDEY（Tyr-Gly-Asp-Glu-Tyr）具有較強HRSA活性，序列中的活性位點是因為C端和N端存在的Tyr[32]。從鯉魚皮膚蛋白中提取得到的肽AY（Ala-Tyr）具有較好的亞鐵離子螯合能力（ferrous ion chelating capacity，F(xiàn)ICP）、還原力和DRSA，經(jīng)過體外消化后具有強穩(wěn)定性，C端Tyr的存在增強了自由基的清除活性[33]。草魚皮蛋白肽有PYSFK（Pro-Tyr-Ser-Phe-Lys）、GFGPEL（Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Leu）和VGRP（Val-Gly-Arg-Pro），其中PYSFK具有最強的DRSA和ABTS自由基清除能力，這歸功于肽序列的芳香族氨基酸Tyr的酚羥基發(fā)揮作用，而肽序列中不含芳香族氨基酸的VGRP的抗氧化能力最弱[34]。Trp是一種側(cè)鏈有吲哚基團的非極性芳香族氨基酸[35]，吲哚基比過氧自由基更穩(wěn)定，壽命更長，因此任何逆反應或自由基介導的過氧連鎖反應的傳播都會受到抑制[36]。Trp將吲哚基團中的質(zhì)子捐贈給缺電子的自由基，從而保持自由基穩(wěn)定，提高肽的自由基清除活性[36]。古氏魟蛋白肽WAFAPA（Trp-Ala-Phe-Ala-Pro-Ala）比GSH有更強的抗氧化活性，其中Trp發(fā)揮了重要作用[16]。
疏水性氨基酸包括Leu、Val、Gly、Pro、Met、Phe、Trp、Ala和Ile，疏水性氨基酸有利于提升肽在水油介質(zhì)中的溶解度[16]，增加對脂溶性自由基或多不飽和脂肪酸的可及性和相互作用[37-38]，促進質(zhì)子向脂質(zhì)衍生的自由基的遞送過程，抑制氧化損傷的產(chǎn)生[36]。如圖1的作用機制d所示，含有Leu和Ala的肽的抗氧化能力歸因于它的長脂族側(cè)鏈[35]，能夠與易感脂肪酸的�；湴l(fā)生相互作用，馬鯖魚內(nèi)臟肽ACFL（Ala-Cys-Phe-Leu）含有Leu和Ala，其抑制多不飽和脂肪酸的能力高于天然抗氧化劑α-生育酚[4]。此外，Leu和Val的側(cè)鏈烯丙基氫含有豐富且活性高的氫原子，容易與自由基反應[39]，因此，Leu和Val符合圖1中a和b抗氧化機制。大黃魚魚鱗肽QRPPEPR（Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Pro-Arg）、EKVWKYCD（Glu-Lys-Val-Trp-Lys-Tyr-Cys-Asp）和VGLPGLSGPVG（Val-Gly-Leu-Pro-Gly-Leu-Ser-Gly-Pro-Val-Gly），它們的DRSA清除率分別為55.1%、55.1%和59.1%，肽序列中含有兩個Val的VGLPGLSGPVG對DPPH自由基的清除效果最好[40]。
Gly和Pro通過其特殊結(jié)構(gòu)賦予肽抗氧化活性，而且Gly和Pro能影響肽的二級構(gòu)象[40-41]，進而影響功能活性。Gly的抗氧化機制是圖1中的a途徑，氨基酸作為供氫體，通過轉(zhuǎn)移氫原子清除自由基。Gly側(cè)鏈由一個氫原子組成，為肽的主鏈提供高度靈活性，因而改變肽的空間結(jié)構(gòu)。Wu等[41]發(fā)現(xiàn)隨著合成肽序列PMRGGGGYHY（Pro-Met-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Tyr-His-Tyr）中Gly的減少，肽鍵形成的分子內(nèi)氫鍵的數(shù)量越少，抗氧化肽更多的活性位點暴露出來，ORAC逐漸增強。帶魚肌肉蛋白肽IYG（Ile-Tyr-Gly）之所以具有較高的自由基清除能力、還原能力和亞油酸模型體系中的抑制脂質(zhì)過氧化能力，是因為Gly側(cè)鏈上的單個氫原子可以充當質(zhì)子供體，中和活性自由基，而且其肽鏈短的優(yōu)勢更容易讓肽的活性位點接觸到靶點，有助于肽發(fā)揮生物活性[42]。Pro可以誘導二級結(jié)構(gòu)彎曲，增加氨基酸發(fā)揮作用的可用性[40]。Pro的作用機制是圖1中的b途徑，利用單電子轉(zhuǎn)移去除自由基。扁舵鰹蛋白肽GAGGP（Gly-Ala-Gly-Gly-Pro）具有較好的DRSA活性[43]，序列中的Pro有一個富含電子的吡咯烷酮環(huán)，由于其較低的電離勢，可以增加肽鏈的靈活性，也可以淬滅單線態(tài)氧[43-44]，從路氏雙髻鯊軟骨蛋白中提取得到含有Pro的肽GPE（Gly-Pro-Glu）在亞油酸模型體系中表現(xiàn)出類似于抗氧化劑BHT的脂質(zhì)過氧化抑制活性，其芳香側(cè)鏈在抗氧化反應中充當電子給體[45]。
如圖1的a途徑所示，Asn、Gln、Thr和Ser可以作為氫供體，通過提供氫原子阻礙抗氧化反應。在中性pH環(huán)境下，Asn和Gln可以提供氫原子，進而吸引帶有正電荷的自由基來增加肽的抗氧化活性[20]。Thr和Ser都可以作為氫供體來中和自由基。黑鯊魚皮中鑒定得到的含有Thr的五肽PGGTM（Pro-Gly-Gly-Thr-Met）被報道具有強DRSA和ORAC[46]。在圓鱘蛋白中鑒定得到的所有肽中，肽序列中Thr使肽ILGATIDNSK（Ile-Leu-Gly-Ala-Thr-Ile-Asp-Asn-Ser-Lys）具有最強的DRSA和ABTS自由基清除能力[47]。印度魷魚寡肽WCTSVS（Trp-Cys-Thr-Ser-Val-Ser）Ser的羥基參與了該肽的抗氧化活性，防止DNA損傷和抑制脂質(zhì)過氧化[48]。而且，一同分離出的寡肽SVNVPLY（Ser-Val-Asn-Val-Pro-Leu-Tyr）被報道其還原力顯著高于YRIVPL（Tyr-Arg-Ile-Val-Pro-Leu）的原因是前者的N端存在Ser[30]。
His、Lys和Arg是抗氧化肽序列中常見的堿性氨基酸。His的作用機制包括圖1中的a、b和c途徑[25]。His的咪唑基團和Arg的側(cè)鏈能提供氫原子與自由基反應，使肽發(fā)揮抗氧化作用。His的咪唑基團是抗氧化肽的重要活性位點[28]，因為它可以作為氫供體和脂質(zhì)過氧自由基陷阱[49]。同時His可以通過給電子將自由基轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定分子，同時通過共振結(jié)構(gòu)保持自身的穩(wěn)定性[50]。而且咪唑的氧化產(chǎn)物是咪唑啉酮，咪唑啉酮也具有抗氧化活性[51]。Chen等[52]發(fā)現(xiàn)，采用D-His取代抗氧化肽PHH（Pro-His-His）中的L-His會導致其活性下降，推測這與咪唑環(huán)的位置、方向和其供電子能力有關(guān)。沙魚肌肉蛋白肽ATSHH（Ala-Thr-Ser-His-His）序列中含有兩個His，在1 mg/mL的濃度下，寡肽對DPPH自由基的清除能力高達90%以上，這歸因于His咪唑基團的供質(zhì)子能力[53]。鯪魚皮蛋白肽TAGHPGTH（Thr-Ala-Gly-His-Pro-Gly-Thr-His）具有ORAC活性，序列中His的咪唑環(huán)提供氫原子，以電子共軛的方式穩(wěn)定自身結(jié)構(gòu)，從而阻斷自由基鏈式反應[54]。Lys的抗氧化機制如圖1中的c途徑所示，帶正電荷的堿性氨基酸與帶相反電荷的金屬離子結(jié)合，阻礙氧化鏈式反應的進行。Arg的抗氧化機制包括圖1中的a和c途徑。Arg的側(cè)鏈能提供氫原子與ABTS自由基發(fā)生反應，海鱸魚皮肽GLFGPR（Gly-Leu-Phe-Gly-Pro-Arg）和GATGPQGPLGPR（Gly-Ala-Thr-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg）具有較強的抗氧化能力，兩個肽的C末端包含的Arg賦予肽抗氧化能力[55]。鯛魚魚糜肽FLGSFL（Phe-Leu-Gly-Ser-Phe-Leu）和YEYSR（Tyr-Glu-Tyr-Ser-Arg）具有較強的ABTS自由基清除能力和FICP，這是因為序列中的Arg能通過其帶電殘基與金屬離子相互作用，并使金屬離子失去氧化活性[56]。鱘魚皮蛋白肽GDRGEESGPA（Gly-Asp-Arg-Gly-Glu-Glu-Ser-Gly-Pro-Ala）是鑒定中獲得的所有肽中具有最強的DRSA活性的肽[57]，Arg在肽序列中的存在和位置決定了肽的抗氧化活性，當Arg位于靠近N末端的第三個位置時具有較好抗氧化活性[3]，而其他肽具有較低DRSA活性的原因是序列中缺乏Arg。除了圖1中的抗氧化機制外，His、Lys和Arg也具有細胞內(nèi)抗氧化能力，董麗莎等[58]采用分子對接發(fā)現(xiàn)黑線鱈魚皮中鑒定的肽VIFFVTMGTPR（Val-Ile-Phe-Phe-Val-Thr-Met-Gly-Thr-Pro-Arg）與Keap1蛋白結(jié)合最穩(wěn)定，序列中的His、Lys和Arg所提供的電荷吸引力、氫鍵、碳氫鍵、烷基鍵和π烷基鍵有助于二者緊密結(jié)合，阻斷核轉(zhuǎn)錄因子（NF-E2-related factor 2,Nrf2）信號通路，實現(xiàn)對人表皮角質(zhì)形成細胞（HaCaT）的抗氧化保護效應。
酸性氨基酸包括Glu和Asp，其抗氧化機制如圖1的a和c途徑所示，Glu和Asp既能清除自由基，還能螯合金屬離子，減弱金屬離子的促氧化作用，抵抗脂質(zhì)氧化[20]。Glu的側(cè)鏈還可以提供一個氫原子作為還原劑，猝滅自由基[59]。赤魟軟骨蛋白肽VPR（Val-Pro-Arg）、IEPH（Ile-Glu-Pro-His）、LEEEE（Leu-Glu-Glu-Glu-Glu）和IEEEQ（Ile-Glu-Glu-Glu-Gln）具有強自由基清除能力，序列中的Glu是肽的主要活性位點[60]。甲鯰魚水解液的ORAC值與藍莓、蘋果和橙子等水果的ORAC值相似，從中鑒定的多個肽序列都存在IEE（Ile-Glu-Glu）或IEEE（Ile-Glu-Glu-Glu）序列，IEE重復序列是高抗氧化活性的部分原因[61]。扁舵鰹蛋白肽VE（Val-Glu），在去除H2O2過程中，序列中的Glu通過產(chǎn)生氧化型谷胱甘肽（glutathione，GSH）來提供抗氧化活性[43]。鰹魚魚頭蛋白肽WMFDW（Trp-Met-Phe-Asp-Trp）和EMGPA（Glu-Met-Gly-Pro-Ala），肽序列的Asp和Glu在清除羥基自由基的過程中起著關(guān)鍵作用[62]。鰱魚肌肉蛋白肽MYPGIGDR（Met-Tyr-Pro-Gly-Ile-Gly-Asp-Arg）和ADLVHVQ（Ala-Asp-Leu-Val-His-Val-Gln）都具有較強DRSA，C末端旁邊第二個氨基酸位置是Glu或Asp能更有效地對中斷氧化鏈式反應，減少有害ROS的產(chǎn)生，有助于增強肽的自由基清除活性和還原能力[63]。
2 一級結(jié)構(gòu)與金屬離子螯合能力的關(guān)系
氨基酸側(cè)鏈的基團與金屬離子螯合活性有關(guān)，帶正電的堿性氨基酸側(cè)鏈上的羧基失去氧原子與金屬離子形成絡(luò)合物[60]，帶負電的酸性氨基酸側(cè)鏈上的氨基失去氮原子，氮原子未共享的電子對與金屬離子結(jié)合，酸性氨基酸螯合Fe2+的還原方式與抗壞血酸類似[61]，生成具有三齒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定鐵螯合物[73]。堿性氨基酸的羧基、Asp的游離γ-羧基和Glu的游離δ-羧基與金屬離子結(jié)合[73]，His的咪唑環(huán)、Cys的巰基、Trp的吲哚基和Thr的羥基[1]以及Ser的羥基[74]可以提供額外的金屬離子結(jié)合位點。
3 二級結(jié)構(gòu)與抗氧化活性的關(guān)系
肽的二級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲。來源于β-乳球蛋白的多肽WYSLAMAASDI（Trp-Tyr-Ser-Leu-Ala-Met-Ala-Ala-Ser-Asp-Ile）的ORAC活性比抗氧化劑BHA強，而且相對應的等摩爾游離氨基酸的混合物具有更高活性，而寡肽YVEEL（Tyr-Val-Glu-Glu-Leu）卻正好相反，其氨基酸混合物的ORAC比寡肽低2倍[75]。這說明肽鍵或者肽鏈的空間結(jié)構(gòu)既可能降低也可能提高多肽的抗氧化活性。
α-螺旋主要通過羰基氧（-CO）和氨基氫（NH-）兩種基團之間的分子內(nèi)氫鍵形成，氨基酸越多的肽更容易形成α-螺旋結(jié)構(gòu)[28]。α-螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域具有較高的兩親性，有助于肽在界面發(fā)揮抗氧化作用[76]。α-螺旋在肽的抗氧化能力中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，鮭魚皮水解液具有較好的自由基清除能力，采用紅外光譜分析其二級結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋含量占比最高，無規(guī)卷曲含量占比最低，水解液的ABTS、HRSA和超氧自由基清除活性（superoxide anion radical scavenging capacity，SRSA）分別為1.86、1.65和2.72 mg/mL[77]。也有研究結(jié)果表現(xiàn)出α-螺旋比例越低，肽具有的抗氧化能力更強。由拉普光譜測定金線鯛肌肉水解物的二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋占比最大，為47.88%，無規(guī)卷曲占比最小，為10.3%。經(jīng)200 W超聲波處理后，α-螺旋比例降低至0.78%，無規(guī)卷曲含量增加至12.33%，酶解產(chǎn)物的DRSA的IC50值降低，說明抗氧化活性增加[12]。
β-折疊通過多肽鏈之間維持穩(wěn)定性的鏈間氫鍵形成，有序結(jié)構(gòu)α-螺旋和β-折疊主要位于蛋白質(zhì)內(nèi)部位置，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)由弱氫鍵結(jié)構(gòu)產(chǎn)生[12]。肽的抗氧化活性與三維結(jié)構(gòu)特征β-轉(zhuǎn)角的貢獻有關(guān)，黑魚消化液中分離出的四個肽具有的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的占總多肽二級結(jié)構(gòu)的75%，其中鑒定出的肽PGMLGGSPPGLLGGSPP的DRSA活性與GSH相當，肽SDGSNIHFPN的FICP活性與EDTA相當[78]。東方鲀魚皮和市售魚皮肽的二級結(jié)構(gòu)主要以β-折疊為主，兩種肽再經(jīng)消化酶水解后，β-折疊和無規(guī)卷曲含量降低，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量增加，其中市售魚皮肽的DRSA清除率由7.89%增加到28.77%，而東方鲀魚皮肽的DRSA清除率減弱，東方鲀魚皮經(jīng)過消化，α-螺旋含量的增加造成了其DRSA清除率和總還原能力降低[79]。此外，Yang等[80]認為較高的β-折疊含量和較低的α-螺旋可能與肽的抗氧化活性有一定的相關(guān)性。
無規(guī)線圈由未折疊構(gòu)象產(chǎn)生，它與肽鏈的靈活度有關(guān)[12]。關(guān)于無規(guī)線圈的含量與二級結(jié)構(gòu)的關(guān)系不成正比或反比關(guān)系，比例高的無規(guī)卷曲能使肽的結(jié)構(gòu)更加松散，暴露更多的活性位點，有利于和自由基結(jié)合[81]。有序結(jié)構(gòu)向無序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變能使肽抗氧化活性增強[82]，從三文魚骨中提取的低聚肽粉具有較強ABTS和還原力，使用紫外光譜和圓二色譜分析其二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋和平行式β-折疊含量兩類結(jié)構(gòu)占比最小，無規(guī)卷曲含量占比最大。經(jīng)過高壓脈沖電場處理后的松仁蛋白肽Ac-QWFCT（Ac表示N端乙�；疓ln），其無規(guī)線圈含量與抗氧化活性成相反趨勢[83]。當肽的無規(guī)卷曲含量為32.5%時，其具有最佳的抗氧化活性。王瑩等[84]利用紅外光譜、核磁共振光譜、Zeta電位和圓二色譜分析高壓脈沖電場處理的寡肽KWFH（Lys-Trp-Phe-His），發(fā)現(xiàn)KWFH的羧酸羰基的C=O和苯環(huán)的氫質(zhì)子發(fā)生變化，電位改變使二級結(jié)構(gòu)變得更加無序，DRSA清除率較PEF處理前增強了13.92%。
4 一級結(jié)構(gòu)與肽的相互作用
氨基酸或序列的增加或缺失可以增強肽的抗氧化活性，也可以削弱肽的抗氧化活性，這與抗氧化肽的分子量、肽鍵和氫鍵有關(guān)[85]。Gopinatth等[17]從金槍魚骨干蛋白中提取出肽APTBP，將其任意一端替換Trp使肽的ABTS活性提高63.1%，而肽的兩端都替換Trp后，ABTS活性降低10.3%。肽序列中氨基酸之間的協(xié)同效應在其抗氧化活性中發(fā)揮重要作用。通過自由基轉(zhuǎn)移反應，被氧化的氨基酸可以將自由基損傷交換到鄰近的氨基酸，使反應產(chǎn)物更穩(wěn)定[86]。Liu等[87]認為肽鏈中Tyr的酚羥基的活性影響整體的抗氧化性能，當Tyr處于DD（Asp-Asp）或DQ（Gln-Asp）之間時抗氧化活性會增加，因為DD或DQ中的氨基酸側(cè)鏈的羧酸基團的親電性削弱了酚羥基的氧電子云密度，還增強了供應和釋放氫質(zhì)子的能力。同樣，Bamdad等[86]認為五肽QPYPQ中的P和Y的交替序列對穩(wěn)定自由基有積極作用。Najafian等[88]在羅馬魚（L. plantarum）水解液中鑒定了與之有相同結(jié)構(gòu)基序PYP（Pro-Tyr-Pro）的肽AIPPHPYP（Ala-Ile-Pro-Pro-His-Pro-Tyr-Pro），此肽的DRSA、ABTS和還原力的IC50分別為1.38、0.873和0.456 mg/mL。因此，肽序列中的氨基酸存在的相互作用對肽的活性有一定影響，其影響程度還有待進一步研究。
單個肽與混合肽的抗氧化活性不同，古氏魟蛋白肽WAFAPA（Trp-Ala-Phe-Ala-Pro-Ala）和MYPGLA（Met-Tyr-Pro-Gly-Leu-Ala）清除ABTS自由基的實驗值大于計算的理論值，兩個肽之間潛在的協(xié)同作用能幫助它們在功能性食品中發(fā)揮更好的抗氧化作用[16]。同樣，在半鰭鳀魚肽NKVKGELD、EMSAGLHE和WRKKDPLND中，盡管單個肽NKVKGELD的DRSA活性很弱，但它與其他兩個肽分別組合后的抗氧化活性增強[89]。金線魚魚糜多肽FLGSFLYEYSR的ABTS自由基清除率為2.448 mmol/L Trolox，與一同分離出的其他肽組合后，混合物的抗氧化能力降至1.962 mmol/L Trolox[56]。Halim等[90]在實驗中發(fā)現(xiàn)，10000 Da的鰻魚蛋白超濾液的DRSA活性超過了3000和5000 Da超濾液，盡管許多研究人員認為超濾液的分子量與其抗氧化活性成負相關(guān)[91]，但多個肽的相互作用說明分子量不是唯一影響混合肽抗氧化活性的因素。
5 結(jié)論
抗氧化肽的活性歸因于其立體空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)中氨基酸基團、酸堿性、親疏水性、相互作用和二級結(jié)構(gòu)對抗氧化肽活性產(chǎn)生重要影響。His、Arg、Lys、Glu和Asp作為極性帶電氨基酸可以吸引帶有異性電荷的自由基和金屬離子，賦予肽抗氧化能力。含硫氨基酸的巰基，芳香族氨基酸的苯環(huán)、酚羥基、吲哚基團，部分疏水性氨基酸的長脂肪族側(cè)鏈，部分中性氨基酸的羥基，酸性氨基酸和堿性氨基酸的羧基這些官能團都對抗氧化肽的活性有顯著影響。具體來說，Gly，Asp、Glu、Leu、Val、Cys、Ser、Thr、Arg、Tyr和Glu清除自由基的作用機制是提供氫原子。Ile、Leu、Ala、Lys、Val和Met等疏水性氨基酸的抗氧化作用機制主要是清除脂類自由基和增強水油界面的溶解度，延緩脂質(zhì)氧化。Met、Tyr、Trp、His、Phe、Pro和Trp的作用機制是通過提供電子穩(wěn)定自由基。
魚類抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定不僅局限于鑒定氨基酸序列和二級結(jié)構(gòu)，還應深入開發(fā)新型鑒定結(jié)構(gòu)的方法。闡明肽與其抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系，能夠降低成本和增加經(jīng)濟效益。此外，未來探究多肽鏈的氨基酸增加、減少、替換等修飾處理，以及探究氨基酸序列、位置、組成和側(cè)鏈糖基化程度對抗氧化活性的影響，有助于為抗氧化肽的應用提供理論基礎(chǔ)，指導新型抗氧化肽開發(fā)市場。此外，利用生物信息學技術(shù)和同源建模方法對肽的氨基酸序列進行分析，能夠更好地了解其構(gòu)效關(guān)系。研發(fā)表征抗氧化肽在細胞中構(gòu)效關(guān)系的相應工具，有助于進一步剖析肽的抗氧化機制，指導抗氧化肽的定制化設(shè)計。
免責聲明：本文為行業(yè)交流學習，版權(quán)歸原作者及原雜志所有，如有侵權(quán)，可聯(lián)系刪除。文章標注有作者及文章出處，如需閱讀原文及參考文獻，可閱讀原雜志
