摘要: 目的 觀察P3肽對RAW264.7巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響，并探討其作用機制。方法 采用MTT法篩選P3肽及氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)的作用濃度，并用80 mg·L-1的ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞；分別采用油紅O染色和總膽固醇含量測定試劑盒，檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及總膽固醇含量；實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)及Western blot檢測三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1(ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1)的mRNA和蛋白表達變化；分別應(yīng)用肝X受體(liver X receptor，LXR)的激動劑T0901317、GW3965，以及LXR抑制劑GSK2033進一步驗證P3肽調(diào)控ABCA1、ABCG1表達的作用機制。結(jié)果 P3肽明顯減少RAW264.7細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，降低細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量，上調(diào)ABCA1、ABCG1mRNA和蛋白表達；P3肽上調(diào)ABCA1、ABCG1的作用與LXR激動劑T0901317、GW3965相似；加入抑制LXR基因轉(zhuǎn)錄的抑制劑GSK2033后，P3肽對ABCA1、ABCG1的基因表達無上調(diào)作用。結(jié)論 P3肽可減少RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚，抑制泡沫細(xì)胞的形成，其作用機制可能與激活LXR-ABCA1/ABCG1通路有關(guān)。
動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種血管慢性炎癥性疾病，是心腦血管疾病和外周血管疾病的病理基礎(chǔ)。AS病理斑塊主要由脂質(zhì)、纖維和細(xì)胞組成。巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞是參與動脈硬化斑塊形成與發(fā)展的主要細(xì)胞類型[1]。AS的起因是血漿中含有載脂蛋白B(apolipoprotein B，apoB)的脂蛋白被吸收并沉積在動脈內(nèi)膜上，脂蛋白中的低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)可被氧化或通過其他修飾而誘導(dǎo)動脈內(nèi)膜上的內(nèi)皮細(xì)胞活化，活化的內(nèi)皮細(xì)胞募集單核細(xì)胞。一方面，單核細(xì)胞分化成促炎巨噬細(xì)胞，局部放大炎癥反應(yīng)；另一方面，巨噬細(xì)胞吞噬修飾的LDL，形成泡沫細(xì)胞。動脈內(nèi)膜泡沫細(xì)胞的出現(xiàn)是AS斑塊形成中不可缺少的一步，通常被認(rèn)為是AS的早期表現(xiàn)之一。泡沫細(xì)胞的形成主要是巨噬細(xì)胞攝取過量修飾的LDL或巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出障礙所致，因此，抑制巨噬細(xì)胞對膽固醇的攝取、促進巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出，可減少巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的沉積，防止泡沫細(xì)胞的形成，對于干預(yù)早期AS具有重要意義[2]。在巨噬細(xì)胞中，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1(ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1)負(fù)責(zé)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出。ABCA1和ABCG1基因表達上調(diào)可促進巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，抑制泡沫細(xì)胞的形成[3]。
苦蕎是蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)的一年生草本植物，分布于亞洲、歐洲及美洲，在中國主要種植在高寒的西北和西南山區(qū)。苦蕎營養(yǎng)價值豐富，中國一直有將苦蕎粉作為功能性食品或常規(guī)飲食，用于治療心血管疾病和糖尿病的傳統(tǒng)�？嗍w中的苦蕎蛋白，也具有預(yù)防高脂血癥的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎蛋白可明顯降低倉鼠血漿總膽固醇水平，其效果優(yōu)于大米蛋白和小麥蛋白[4]。P3肽來源于苦蕎清蛋白，是課題組前期采用堿性蛋白酶酶解苦蕎清蛋白，分離鑒定出的生物活性肽，具有抗氧化及調(diào)節(jié)炎癥的作用，其氨基酸序列為Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp，分子量為741.8 u[5-6]。本研究以巨噬細(xì)胞RAW264.7為研究對象，采用氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成，觀察P3肽對巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)沉積的影響，并探討其潛在作用機制，從而為尋找P3肽的作用靶點及其應(yīng)用開發(fā)提供實驗依據(jù)。
1 材料
RAW264.7巨噬細(xì)胞，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA USA)。
P3肽(純度≥98%)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶，均購自美國HyClone公司；MTT、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、油紅O染料、BCA蛋白濃度測定試劑盒，均購自索萊寶公司；肝X受體(liver X receptor，LXR)激動劑T0901317、GW3965，LXR抑制劑GSK2033，均購自MedChemExpress公司；ox-LDL購自廣州奕源生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素雙抗購自Sigma公司；總膽固醇(total cholesterol，TC)測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒，購自TaKaRa公司；抗ABCA1兔多克隆抗體，購自Bioworld公司；抗ABCG1兔多克隆抗體、抗β-actin小鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗，均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光液，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。
JJ-CJ-1FD潔凈工作臺(江蘇市金凈凈化設(shè)備科技有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本松下公司)；H4多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；TGL-16B臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；TS100F熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)；CFX96 PCR擴增儀、Gel Doc XR凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；ND2000超微量紫外分光光度計(Thermo公司)；H1650R臺式高速冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)。
2 方法
RAW264.7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗)中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天換液1次，待細(xì)胞融合度約為80%時，使用胰酶消化、傳代。
采用MTT法測定細(xì)胞活力。先觀察P3肽、ox-LDL對細(xì)胞增殖的影響，根據(jù)MTT結(jié)果篩選出P3肽和ox-LDL的最佳作用濃度，而后在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，檢測P3肽對ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活力的影響。將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞傳代，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107·L-1，將細(xì)胞接種于96孔板。確定P3肽和ox-LDL作用濃度后，分組如下：空白組不接種細(xì)胞，不加ox-LDL和P3肽；對照組接種細(xì)胞，不加ox-LDL和P3肽處理；模型組接種細(xì)胞，并加入80 mg·L-1的ox-LDL；P3肽組接種細(xì)胞，加入濃度分別為10、20、50、80、100 mg·L-1的P3肽，以及80 mg·L-1的ox-LDL。于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入5 g·L-1 MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h后，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，培養(yǎng)箱中孵育10 min后，使用酶標(biāo)儀在波長490 nm測定各孔的吸光度(absorbance，A)值，計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。
取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×107L-1濃度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，參照文獻[7]將細(xì)胞分為4組：對照組、模型組、P3肽低濃度組、P3肽高濃度組。對照組加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，24 h后換成無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；模型組加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，在無血清DMEM培養(yǎng)基中加入80 mg·L-1 ox-LDL刺激24 h；P3肽低濃度組和P3肽高濃度組在含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中分別加入50、100 mg·L-1的P3肽干預(yù)24 h后，在無血清DMEM培養(yǎng)基中加入80 mg·L-1 ox-LDL刺激24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗3次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定20 min后，棄多聚甲醛，每孔加入1 mL PBS洗3次。然后每孔加入約1.5 mL油紅O染色工作液(油紅O基液∶ddH2O＝3 ∶2)染色30 min，PBS洗3次，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞脂質(zhì)被油紅O染色情況。
按照“2.3”對細(xì)胞進行分組處理后，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS洗2次，每孔加入1 mL PBS吹打細(xì)胞，使細(xì)胞充分脫落，并將細(xì)胞懸液收集于預(yù)先做好標(biāo)記的1.5 mL EP管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清并留沉淀待用。細(xì)胞沉淀按照試劑盒說明書操作，測定各組TC含量。
取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×108·L-1的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，分為7組：對照組、模型組、P3肽低濃度組、P3肽高濃度組、LXR激動劑T0901317組、LXR激動劑GW3965組、LXR抑制劑GSK2033組。對照組、模型組、P3肽低濃度組、P3肽高濃度組的處理方式同“2.3”。LXR激動劑T0901317組與LXR激動劑GW3965組在含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中分別加入1 μmol·L-1 T0901317和GW3965作用24 h；LXR抑制劑GSK2033組在含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入10 μmol·L-1 GSK2033和100 mg·L-1P3肽作用24 h，然后3組在無血清DMEM培養(yǎng)基中加入80 mg·L-1ox-LDL作用24 h，收集細(xì)胞。LXR激動劑和抑制劑的濃度參考文獻[8-9]。各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)200 μL，冰上裂解30 min，4 ℃、9 710×g離心20 min，取上清液備用。BCA蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒檢測各組蛋白濃度，制備8%的分離膠和5%濃縮膠，20 μg總蛋白95 ℃煮沸10 min后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，ECL試劑盒顯影。ImageJ軟件分析各條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參蛋白，目標(biāo)蛋白的相對表達量=目標(biāo)蛋白的灰度值/β-actin的灰度值。
所有實驗均重復(fù)3次，各組實驗數(shù)據(jù)以x±s表示。采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，通過單因素方差分析對多組數(shù)據(jù)之間的差異進行顯著性檢驗，P < 0.05為差異具有顯著性。利用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行繪圖。
3 結(jié)果
4 討論
由于高脂飲食和不健康的生活方式，以血漿膽固醇增高為特點的高膽固醇血癥的發(fā)生率在全世界內(nèi)持續(xù)上升。血漿膽固醇，特別是LDL的增高是AS發(fā)生的主要原因。食物膽固醇的攝取吸收、膽固醇的體內(nèi)合成，以及膽固醇的分泌都會影響血漿膽固醇的水平。目前，已報道的降膽固醇肽的作用機制主要是減少外源性膽固醇的吸收、抑制體內(nèi)膽固醇的生物合成及促進膽固醇轉(zhuǎn)變成膽汁酸等[10]。在AS形成的早期階段，活化的內(nèi)皮細(xì)胞募集單核細(xì)胞到內(nèi)膜下，分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成。泡沫細(xì)胞形成的過程與巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝密切相關(guān)，其中，膽固醇從巨噬細(xì)胞內(nèi)流出是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞膽固醇動態(tài)平衡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，對減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇沉積、防止泡沫細(xì)胞形成、預(yù)防AS具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，減少巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積可在早期干預(yù)AS的發(fā)生[11]。本研究通過ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)P3肽可以減少巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的沉積，降低細(xì)胞內(nèi)的TC含量，說明P3肽具有抑制泡沫細(xì)胞形成的作用。
泡沫細(xì)胞的形成主要是由于細(xì)胞攝取膽固醇異常，或巨噬細(xì)胞膽固醇流出受損所致[12]。ABCA1和ABCG1是一類膜蛋白，是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體(ATP binding cassette transporter，ABC)超家族中一員，可利用ATP水解釋放的能量來轉(zhuǎn)運底物，兩者相互配合，共同完成巨噬細(xì)胞膽固醇的流出。ABCA1的作用是將膽固醇和磷脂酰膽堿從巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)出，流向貧脂的載脂蛋白Apo A1，生成新生高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)，而ABCG1則介導(dǎo)膽固醇、磷脂酰膽堿和鞘磷脂流向新生和成熟HDL[13]。ABCA1和ABCG1表達減少或功能喪失，促進泡沫細(xì)胞形成和AS發(fā)生，而一些黃酮類物質(zhì)，如二氫楊梅素可通過誘導(dǎo)ABCA1、ABCG1的表達抑制泡沫細(xì)胞的形成[14]。本研究中，P3肽可明顯上調(diào)ABCA1和ABCG1的基因表達，提示P3肽降低ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中膽固醇含量，可能是通過誘導(dǎo)ABCA1和ABCG1的表達，進而促進膽固醇從巨噬細(xì)胞流出。
LXR有LXRα和LXRβ兩種亞型，是類固醇激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于類固醇/甲狀腺激素核受體超家族成員。LXR調(diào)控一系列涉及膽固醇吸收、轉(zhuǎn)運和轉(zhuǎn)化的基因轉(zhuǎn)錄，被稱為膽固醇感受器。LXR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能需要與類視黃醇X受體(retinoid X receptor，RXR)結(jié)合，形成LXR/RXR異二聚體才能發(fā)揮。無配體時，該異二聚體與核受體阻遏因子結(jié)合，抑制基因表達；當(dāng)配體與之結(jié)合后，會導(dǎo)致異二聚體構(gòu)象發(fā)生改變，釋放出阻遏因子，并募集輔激活因子，LXR/RXR與靶基因啟動子區(qū)域內(nèi)的特定DNA序列，即LXR反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[15]。LXRα在巨噬細(xì)胞中高表達，ABCA1和ABCG1是LXRα在巨噬細(xì)胞中的靶基因，調(diào)節(jié)膽固醇從巨噬細(xì)胞流出[16]。研究認(rèn)為，激活LXR可增加外周膽固醇流出、促進膽固醇向肝轉(zhuǎn)運及轉(zhuǎn)變成膽汁酸、促進膽汁酸分泌等，從而降低血漿膽固醇水平，發(fā)揮抗AS作用[17]。LXR激活劑T0901317通過氫鍵與LXR結(jié)合，募集LXR和輔激活因子結(jié)合，進而激活LXR，對LXRα和LXRβ均有激活作用；GW3965選擇性與LXRα結(jié)合，進而激活LXRα[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P3肽單獨與巨噬細(xì)胞作用時，與T0901317、GW3965一樣，可明顯上調(diào)ABCA1和ABCG1的表達，但先用GSK2033抑制LXR基因轉(zhuǎn)錄后，再與P3肽作用，發(fā)現(xiàn)P3肽對ABCA1、ABCG1的上調(diào)作用消失，提示P3肽可能是LXR的潛在激活劑，但其與LXR的具體作用機制還需要進一步研究。
綜上，P3肽可減少ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)積聚，減少細(xì)胞內(nèi)的TC含量，抑制泡沫細(xì)胞的形成，其機制可能是通過激活LXR，上調(diào)ABCA1和ABCG1的表達介導(dǎo)的。本研究結(jié)果可為P3肽的應(yīng)用開發(fā)提供實驗依據(jù)。
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