摘要: 目的 基于斑馬魚帕金森癥(Parkinson’s disease，PD)模型，研究一種抗氧化活性十肽YSQLENEFDR (Tyr-Ser-Gln-Leu-Glu-Asn-Glu-Phe-Asp-Arg)的抗帕金森癥活性。方法 實驗分為空白對照組，50 μmol·L-11-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-terahydropyridine，MPTP)誘導(dǎo)組以及50 μmol·L-1 MPTP和不同濃度(2、10、50 mg·L-1)的十肽共處理組。受精后4d(day post fertilization，dpf)，用熒光顯微鏡觀察并記錄各實驗組轉(zhuǎn)基因斑馬魚多巴胺神經(jīng)元和腦部血管的發(fā)育情況; 5dpf時，用Zebrabox斑馬魚行為分析儀分析野生型斑馬魚行為并通過qRT-PCR檢測帕金森相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果 與空白對照組相比，MPTP處理組斑馬魚出現(xiàn)多巴胺神經(jīng)元缺失、腦部血管損傷、帕金森狀行為和帕金森相關(guān)基因表達(dá)異常。與MPTP處理組比較，共處理組斑馬魚表現(xiàn)出多巴胺神經(jīng)元缺失減少、腦部血管損傷降低、帕金森狀行為緩解的表征，相關(guān)基因表達(dá)趨于正常。結(jié)論 抗氧化活性十肽YSQLENEFDR具有抗帕金森癥活性。
帕金森癥(Parkinson’s disease，PD)是中老年人常見的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，65歲以上人群中患病率高達(dá)1.7%，僅次于阿爾茲海默癥[1]。該病臨床癥狀主要為震顫、動作遲緩、肌強(qiáng)直等行為性障礙，還會伴隨有睡眠障礙、認(rèn)知功能下降、自主神經(jīng)功能紊亂等一系列非行為性障礙[1-2]。PD主要病理特征為黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)神經(jīng)元的減少和形成以α-syn為主要成分的路易小體(Lewy-body，LB)[3]。PD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多變，目前尚未明確。但有研究發(fā)現(xiàn)，PD與自噬系統(tǒng)有關(guān)，自噬系統(tǒng)的損傷會導(dǎo)致蛋白的積累和聚集，產(chǎn)生細(xì)胞毒性和神經(jīng)退行性病變。也有研究表明，氧化應(yīng)激、蛋白酶體損傷以及線粒體功能紊亂等是PD潛在的發(fā)病機(jī)制。近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與PD相關(guān)的基因包括α-syn、parkin、dj1等[4-5]。α-syn和parkin基因的突變使泛素蛋白酶體降解，從而導(dǎo)致毒性蛋白聚集沉積[3, 6]; parkin的基因突變會造成線粒體功能紊亂[7]; dj1具有抗氧化應(yīng)激的作用[8]等。
海洋生物體內(nèi)富含多種生物活性化合物，具有抗氧化的生物活性，因此在預(yù)防和治療慢性非傳染性疾病(如PD、阿爾茲海默癥等)具有潛在的價值[9]。諸多實驗證實，抗氧化劑或具有抗氧化活性的物質(zhì)能夠有效清除活性自由基，具有神經(jīng)保護(hù)作用[10]。在人體內(nèi)，線粒體呼吸通常會產(chǎn)生一些強(qiáng)氧化劑，Complex I的抑制作用會增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)超氧化物的產(chǎn)生，ROS超氧化物可形成有毒的羥自由基，或者形成過氧亞硝基，這些分子作用于核酸、蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì)而引起細(xì)胞損傷[7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，來源于海螺肉提取物中的一種十肽YSQLENEFDR具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可清除體外自由基及抑制斑馬魚體內(nèi)氧化損傷[11]，但海螺源抗氧化活性十肽YSQLENEFDR是否具有抗PD活性仍未可知。目前常見的PD治療藥物對于人體都有或多或少的副作用，如服用左旋多巴極易引發(fā)胃部不良反應(yīng)[12]; 多巴胺受體激動劑可有效改善患者的臨床癥狀，但會造成患者惡心、失眠等不良反應(yīng)[13]。并且這些藥物只能改善癥狀，并不能延緩PD進(jìn)程。天然來源的食源性十肽YSQLENEFDR除其自身所具有高抗氧化活性外[11]，相對更加安全，更適用于長期服用。
斑馬魚體型小且透明、發(fā)育繁殖快、飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)且具有無需解剖便可觀察各器官發(fā)育情況的優(yōu)勢[16]。最重要的是，斑馬魚的基因序列與人類的基因序列有著極高的相似度，所以被認(rèn)為是優(yōu)良的建立神經(jīng)退行性疾病模型的動物資源[14]。Vmat、Fli1分別特異性表達(dá)于斑馬魚DA神經(jīng)元與血管中，因此轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat:GFP、Fli1:GFP分別用于評價DA神經(jīng)元、腦部血管的發(fā)育狀況。1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-terahydropyridine，MPTP)是一種神經(jīng)毒性物質(zhì)，在斑馬魚中常被用來誘導(dǎo)PD模型。
1 材料與方法
斑馬魚培養(yǎng)及胚胎的準(zhǔn)備：成年雌雄斑馬魚分開培養(yǎng)于水溫26 ℃斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中，照明黑暗14 h :10 h交替進(jìn)行，每日定時喂食。實驗前一晚，選擇成熟斑馬魚按雌雄比例2 :2，放入產(chǎn)卵缸中。次日早上8：30抽取隔板，2 h后收取魚卵，將死卵剔除，養(yǎng)殖水反復(fù)沖洗3次，移入含2 mg·L-1亞甲基藍(lán)的養(yǎng)殖水中，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中控光培養(yǎng)，以備后續(xù)實驗使用。
斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)系統(tǒng)(北京愛生科技公司)、體視熒光顯微鏡(德國蔡司公司)、實時熒光定量PCR儀(羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)、超微量分光光度計(基因有限公司)、C1000 Touch梯度PCR儀(Bio-Rad公司)、Zebrabox斑馬魚行為分析儀(Viewpoint公司)等。
1.2 方法
基于課題組已建立的酸醇浸提法結(jié)合活性導(dǎo)向分離純化法[10]，制備海螺活性十肽，即取香螺組織，磨碎，勻漿，加入10倍量的酸性稀乙醇溶液(冰醋酸調(diào)整溶液pH值至5)，30 ℃攪拌提取6 h，離心，取上層清液，減壓濃縮至無醇味，正己烷萃取脫除脂溶性部分，下層溶液冷凍保存，即得粗多肽提取物。隨后，通過體外活性導(dǎo)向分離法，分離純化富集得到海螺十肽樣品，經(jīng)蛋白定性確定其氨基酸組成，采用固相合成技術(shù)，制備YSQLENEFDR (Tyr-Ser-Gln-Leu-Glu-Asn-Glu-Phe-Asp-Arg)樣品。
將受精后1 d的胚胎進(jìn)行脫膜處理，放于6孔板中，每孔放入20條斑馬魚，分為以下5組：空白對照組、50 μmol·L-1 MPTP處理組、50 μmol·L-1 MPTP與不同濃度(2、10、50 mg·L-1)抗氧化活性十肽YSQLENEFDR共處理組。另外需以0.003%(W/V)PTU處理轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat :GFP、Fli1 :GFP，目的在于抑制黑色素的形成，便于后期在顯微鏡下觀察記錄。加完藥后，將其放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每日換藥。
4 dpf時，在蔡司體視熒光顯微鏡下，選取不同實驗組的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat :GFP、Fli1 :GFP分別觀察DA神經(jīng)元與腦部血管發(fā)育情況。
5 dpf時，將野生型斑馬魚AB的不同組別放入48孔板中，1條/孔，加養(yǎng)魚水1 mL/孔，將48孔板放入Zebrabox斑馬魚行為分析儀暗箱中，先使其適應(yīng)環(huán)境。15 min后開始進(jìn)行行為學(xué)檢測，檢測時間設(shè)置為20 min。運(yùn)用Zeblab軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計算每條魚游動總距離和平均速度。
每組取5 dpf的野生型斑馬魚AB幼魚(n=20)進(jìn)行qRT-PCR檢測。RNA的提取參照試劑盒說明書，利用超微量分光光度計測定提取的RNA的濃度，A260/A280應(yīng)在2.0~2.5之間; RNA反轉(zhuǎn)為cDNA參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書; Real-time PCR參照實時熒光定量PCR說明書。Real-time PCR擴(kuò)增結(jié)束后輸出對照組和待測組目的基因CT及內(nèi)參基因rpl13a的CT值，以相對定量法用2-ΔΔCT計算各組基因的相對表達(dá)量。
用Graphpad prism 7.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行One-way ANOVA檢驗，并以x±s表示。
2 結(jié)果
3 討論
PD是僅次于阿爾茲海默癥的第二大神經(jīng)退行性疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，特別是老年人，所以研究如何治療和緩解PD勢在必行。
本實驗旨在探究海螺源的具有抗氧化活性十肽YSQLENEFDR的抗PD活性。實驗中用MPTP誘導(dǎo)的斑馬魚PD模型，出現(xiàn)了多巴胺神經(jīng)元及腦部血管缺失明顯，行為異常和PD相關(guān)基因表達(dá)異常等現(xiàn)象，說明斑馬魚PD模型建立成功。與MPTP處理的斑馬魚相比，MPTP與十肽YSQLENEFDR共處理組的斑馬魚多巴胺神經(jīng)元的缺失隨著十肽YSQLENEFDR濃度的增加有明顯的改善。十肽YSQLENEFDR對于斑馬魚PD模型腦部血管損傷也表現(xiàn)出一定的拯救作用。MPTP與十肽YSQLENEFDR共處理組的斑馬魚游動能力明顯恢復(fù)，游動總距離增加，平均游動速度變快。以上各檢測結(jié)果表明十肽YSQLENEFDR具有抗PD活性，且在濃度為50 mg·L-1時，其緩解PD的能力最佳。
蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)主要發(fā)揮功能的物質(zhì)，所以通過檢測蛋白質(zhì)表達(dá)變化從而研究藥物、化合物發(fā)揮作用的靶點、上下游通路關(guān)系是比較直觀的方法。但是市面上所售關(guān)于斑馬魚的抗體比較少，在沒有合適抗體的情況下，檢測基因表達(dá)變化是一個比較方便的方法，基因的上調(diào)和下調(diào)可以間接反映蛋白的變化過程。近年來的研究表明，參與PD發(fā)生發(fā)展的基因包括α-syn、parkin、dj1、uchl1、ulk1b、ulk2、pink1、LRRK2、ATP13A2。大量α-syn蛋白聚集形成LB，導(dǎo)致PD。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)MPTP處理后，α-syn的表達(dá)明顯上升，而十肽YSQLENEFDR處理后，α-syn的表達(dá)明顯下調(diào)，提示十肽YSQLENEFDR降低了α-syn蛋白聚集。parkin作為E3泛素連接酶，能從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體中，泛素化線粒體蛋白，形成自噬體，使損傷的線粒體通過自噬體被降解[6]。經(jīng)MPTP處理后，parkin的表達(dá)上調(diào)，提示MPTP可能對線粒體造成損傷，機(jī)體自我保護(hù)從而提高parkin的表達(dá)。而十肽YSQLENEDR處理后，parkin的表達(dá)明顯下調(diào)，提示十肽YSQLENEFDR能夠緩解線粒體損傷。dj1具有抗氧化應(yīng)激作用，在氧化應(yīng)激下，dj1會向線粒體遷移富集，在線粒體中的dj1具有更強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)作用[8]。經(jīng)MPTP處理后，dj1的表達(dá)上調(diào)，而十肽YSQLENEFDR處理后，dj1的表達(dá)明顯下調(diào)，提示十肽YSQLENEFDR可能具有抗氧化應(yīng)激的作用。uchl1參與調(diào)解細(xì)胞的增生、分化和凋亡[15]。經(jīng)MPTP處理后，uchl1的表達(dá)上升，提示MPTP可能對細(xì)胞造成損傷，機(jī)體自我保護(hù)從而提高uchl1的表達(dá)，而十肽YSQLENEFDR處理后，uchl1的表達(dá)明顯下調(diào)，提示十肽YSQLENEFDR能夠緩解MPTP所造成的細(xì)胞損傷，對細(xì)胞有保護(hù)作用。ulk1b的過表達(dá)會抑制自噬[15]，誘發(fā)PD。經(jīng)MPTP處理后，ulk1b的表達(dá)明顯上升，提示MPTP可能抑制自噬，十肽YSQLENEFDR處理后，ulk1b的表達(dá)明顯下調(diào)，提示十肽YSQLENEFDR能夠激活自噬。ulk2能阻止不溶性泛素化蛋白聚集物的積累[15]。經(jīng)MPTP處理后，ulk2的表達(dá)明顯下調(diào)，提示MPTP可能會導(dǎo)致不溶性泛素化蛋白無法降解而大量積累，使PD惡化，十肽YSQLENEFDR處理后，ulk2的表達(dá)無明顯變化，提示十肽YSQLENEFDR可能不是通過調(diào)節(jié)ulk2的表達(dá)來緩解PD。以往研究表明pink1功能異常造成線粒體損傷[7]。經(jīng)MPTP處理后，pink1的表達(dá)沒有明顯變化，十肽YSQLENEFDR處理后也并未對pink1的表達(dá)造成明顯的影響，提示pink1在MPTP誘導(dǎo)的斑馬魚PD模型中未發(fā)揮重要作用。調(diào)節(jié)PD的重要基因還包括LRRK2、ATP13A2等。LRRK2和ATP13A2均參與調(diào)節(jié)多巴胺神經(jīng)元損傷。LRRK2的突變能夠造成多巴胺神經(jīng)元的損傷[16]。ATP13A2的過表達(dá)能明顯減少多巴胺神經(jīng)元的變性丟失[17]。但十肽YSQLENEFDR是否能通過調(diào)節(jié)多巴胺神經(jīng)元相關(guān)基因從而緩解PD，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
本研究中MPTP誘導(dǎo)組的基因α-syn等表達(dá)下調(diào)，ulk1b等表達(dá)上調(diào)，與之前研究基因表達(dá)一致，同時也證明了斑馬魚PD模型建立的成功。不同濃度的十肽YSQLENEFDR能夠調(diào)節(jié)與PD相關(guān)基因的異常表達(dá)，使各基因的表達(dá)趨平于空白對照組，推測十肽能夠通過減少α-syn蛋白的聚集，緩解線粒體損傷，抗氧化應(yīng)激作用等，來緩解PD，但具體的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。
海螺來源的抗氧化活性十肽YSQLENEFDR能夠保護(hù)斑馬魚DA神經(jīng)元且對于腦部血管具有改善作用，能夠緩解帕金森癥行為，調(diào)控與帕金森癥相關(guān)基因的異常表達(dá)，具有抗帕金森癥活性。
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