摘要 備受關(guān)注的腫瘤免疫治療其核心在于能夠激發(fā)免疫應(yīng)答的抗原表位。該文以納米金顆粒作為篩選載體, 偶聯(lián)腫瘤抗原, 體外與人外周血單個核細胞相互作用, 以酶聯(lián)免疫斑點法精確檢測免疫原性來篩選具有免疫原性的抗原多肽。光譜分析證明了納米金顆粒與合成多肽的偶聯(lián),熒光顯微鏡和電子顯微鏡直接證明細胞攝取偶聯(lián)復(fù)合物, 通過檢測T細胞γ-干擾素分泌水平證實了不同多肽的免疫原性。該文優(yōu)化了實驗參數(shù)(如pH、緩沖液體系以及孵育時間等), 顯著地減少了從多肽合成到免疫原性分析的實驗過程所需的時間, 同時, 實驗規(guī)模也成功地縮小到了96孔板, 達到簡單快速篩選免疫原性多肽的最終目的。
腫瘤的免疫療法利用T細胞對腫瘤特異性抗原的應(yīng)答反應(yīng)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)對腫瘤造成殺傷作用, 避免藥物帶來的常見不良反應(yīng), 改善患者的生活品質(zhì)[1], 給腫瘤治療帶來了希望, 成為腫瘤治療研究的熱點。免疫治療藥物, 尤其是免疫檢查點抑制抗體[如細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原-4(cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)和 程 序 性死亡受體-1[2](programmed death receptor-1, PD-1)已在某些腫瘤中具有顯著療效。由于其高度特異性、顯著的有效性以及相對可控的副作用[3], 腫瘤免疫治療已成為越來越多腫瘤的標準治療方式[4], 對延長存活率有很大的幫助[5]。腫瘤的免疫治療包括多細胞免疫療法[6]和特異性抗腫瘤療法[7]。殺傷性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL), 是T細胞的其中一小類, 在腫瘤細胞識別和殺傷過程中起重要作用[8]�？傮w而言, 特異性免疫治療的基礎(chǔ)在于腫瘤特異性抗原的識別與處理[9], 無論采用腫瘤抗原疫苗和嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)方法,其核心都是要支持免疫系統(tǒng)正確識別腫瘤細胞[10]。然而, 很多情況下, 能引起免疫的抗原性質(zhì)是不明確的[11]�？乖禺愋訲細胞群在體外培養(yǎng)后也可能發(fā)生顯著改變, 比如刺激后體外優(yōu)勢克隆型及次優(yōu)勢克隆型的減少[12]。因此, 確立一定數(shù)量的抗原表位(epitope)不僅是免疫治療的基礎(chǔ), 也是持續(xù)療效的保障。
雖然T細胞抗原在臨床藥物應(yīng)用和研究中非常有應(yīng)用前景, 但是一方面由于效應(yīng)T細胞和抗原遞呈細胞之間相互作用的復(fù)雜性, 另一方面是由于龐大的T細胞群和大量潛在T細胞表位的存在[13], 使得其發(fā)現(xiàn)和鑒定速度過慢, 導(dǎo)致無法滿足高效篩選的要求。在免疫干預(yù)實驗中, 免疫原性的綜合研究或者T細胞表位的整體性研究非常困難, 因此通常利用混合多肽來監(jiān)測T細胞的應(yīng)答[14]。相比過程復(fù)雜的表達克隆[14-18]和高度儀器依賴的肽洗脫[19-22]方法,肽疫苗(peptide vaccine)能更大程度地縮短篩選潛在表位所需要的時間[23]及對大型儀器的依賴性, 提高效率及拓寬應(yīng)用廣度。此外, 新興的基于分子模型計算的T細胞表位預(yù)測已取得部分成果但仍需改進[24]。多肽結(jié)合主要組織相容性復(fù)合體分子(majorhistocompatibility complex, MHC)的計算機預(yù)測在基于表位的疫苗發(fā)展中具有重要的實際意義, 然而該預(yù)測方法基于具免疫原性的多肽, 現(xiàn)有的大部分MHC等位基因?qū)?yīng)的抗原表位之間存在明顯的差異[25]。因此, 可能需要較長時期的算法改進和實驗數(shù)據(jù)支持。
在發(fā)現(xiàn)抗原表位的實驗方法中, 除了前述較為直接的肽洗脫法, 其他方法均采用間接的T細胞應(yīng)答觀察, 如熒光信號[26]、四聚體流式檢測[27]及細胞因子分泌檢測[28]等, 抗原信息導(dǎo)入也同樣有著各類方法[13]。納米金顆粒(gold nanoparticle, AuNP)能有效傳遞免疫原性物質(zhì)并且具有低生物毒性[29-30], 是一種潛在的腫瘤免疫治療的優(yōu)良載體。目前, TNF-α(tumor necrosis factor-α)偶聯(lián)的納米金顆粒(CYT-6091)在I期臨床實驗階段中發(fā)現(xiàn), 其可以通過肝臟緩慢清除[31]。納米金顆粒被細胞攝取與清除的機制取決于尺寸,形狀和表面修飾特性。納米金顆粒大小在13 nm到100 nm之間, 能被淋巴引流及細胞攝取, 其中, 直徑在50 nm左右的顆粒顯示了最高的細胞攝取率, 小于15 nm的顆粒能通過核孔[32-34]。通過核定位信號肽(nuclear localization signal peptides, NLSs)、 細 胞 穿膜肽(cell penetrating peptides, CPPs)或者受體靶向型多肽的作用, 納米金顆�？梢赃M入細胞或細胞核。在實際應(yīng)用中還發(fā)現(xiàn), 經(jīng)過紫杉醇修飾的納米金顆粒在腫瘤治療中顯示對正常細胞無細胞毒性[35]。這種穩(wěn)定安全的特性也使納米金顆粒能夠成為表位篩選的理想載體。以納米金顆粒為載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法與傳統(tǒng)的電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法[36-37]、腺病毒轉(zhuǎn)染法等相比, 在安全和穩(wěn)定方面均擁有更大的優(yōu)勢。
1 材料與方法
室溫下, 硫醇可以與納米金顆粒在溶液環(huán)境中形成共價鍵[27]。首先, 將20 μmol/L的PEG(methoxy PEGThiol, 5 kDa)和20 μmol/L的多肽在離心管中等體積混合, 形成多肽與含巰基聚乙二醇(PEG)摩爾比為1׃1。然后, 將混合物加入到15 nm檸檬酸鹽包被的納米金(1.16 nmol/L)膠體中, 形成巰基與納米金顆粒的摩爾比(以下簡稱為硫金摩爾比)為2 500׃1。室溫攪拌金/PEG/多肽混合物1 h, 使硫醇與檸檬酸在納米金顆粒中完全置換。然后, 12 000 r/min離心30 min富集偶聯(lián)復(fù)合物。棄上清, 并用合適體積的緩沖液重懸偶聯(lián)復(fù)合物。為了提高偶聯(lián)效率, 需調(diào)整實驗過程中的pH及緩沖液, 偶聯(lián)結(jié)果通過納米金顆粒與偶聯(lián)復(fù)合物在380~610 nm波長之間吸收峰檢測得到。
用血細胞分離機 (Fresenius Kabi公司 )分離收集病人外周血單個核細胞(pe riphe r a l bloodmononuclear cell, PBMC)。每個病人收集約2×109個PBMC, 用AIM-V培養(yǎng)基(Gibco公司)洗2遍后, 稀釋至4×106/mL。然后, 將PBMC按每孔約1×106/mL接種到96孔板中培養(yǎng)2 h。貼壁細胞加入樹突狀細胞(dendritic cell, DC)培 養(yǎng) 基(含100 ng/mL GM-CSF、1 000 U/mL IL-4和50 ng/mL FLT3-L)誘導(dǎo)培養(yǎng)未成熟DC細胞。所有細胞因子均購買自Novoprotein公司。
除DC細胞外, 本研究中還應(yīng)用到了293A細胞和巨噬細胞。用DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s ModifiedEagle Medium)培養(yǎng)293A細胞, 1.0 mmol/L丙酮酸鈉,100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素, 加10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS), 在37 °C、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng), 每3 d傳代, 取對數(shù)生長期細胞用于實驗。小鼠腹腔注射500 μL液體石蠟, 饑餓處理72 h刺激巨噬細胞生成, 收集腹腔液, 于1 000 r/min離心3 min, PBS洗3次, 加RPMI 1640, 在37 °C、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng), 每3d更換培養(yǎng)基。
如前所述, 通過熒光顯微鏡檢測DC細胞攝取FITC標記的納米金顆粒–多肽復(fù)合物情況。簡單地說, 將50 μL(多肽含量為60 nmol)按上述方法配制的納米金顆粒–多肽復(fù)合物加入到150 μL含有5×105個未成熟DC細胞的培養(yǎng)體系中, 培養(yǎng)2 h(37 °C、5%CO2及飽和濕度)。處理后細胞用生理鹽水洗2次, 保存在生理鹽水溶液中用于熒光顯微鏡檢測。用透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)直接觀察細胞攝取納米金顆粒能力時, 由于DC細胞樣本量的限制, 無法滿足切片要求以完成TEM觀察,因此改用293A細胞檢測細胞攝取納米金顆粒的情況。方法如下, 培養(yǎng)約1×108個293A細胞, 用15 mL納米金顆粒處理。處理后細胞收集并用多聚甲醛固定。使用HITACHI H-7650透射電子顯微鏡完成電鏡實驗。
抗原特異性T細胞應(yīng)答反應(yīng)是通過酶聯(lián)免疫斑點 試 驗(enzyme-linked immunospot, ELISPOT)檢 測IFN-γ的釋放水平來實現(xiàn)的, 實驗設(shè)置3個對照組(分別為空白對照組、陰性對照組和陽性對照組)及不同濃度的實驗組, 使用人IFN-γ預(yù)包被ELISPOT試劑盒(達科為生物技術(shù)股份有限公司)進行檢測。首先用200 μL培養(yǎng)基預(yù)包被每孔, 然后將100 μL含1×105個細胞的液體加入到除空白對照組外的各實驗孔,空白對照組加對應(yīng)體積培養(yǎng)基。實驗所用細胞為PBMC, 在陽性對照組孔加入陽性刺激劑10 μL/孔,等體積培養(yǎng)基加入到陰性對照組孔, 濃度梯度的納米金顆粒–多肽復(fù)合物加入到各實驗孔。37 °C、5%CO2孵育20 h后, 在4 °C用去離子水裂解10 min。用試劑盒提供的洗液洗5遍后, 每孔加100 μL生物素偶聯(lián)的IFN-γ單抗孵育1 h。重復(fù)上述清洗步驟后, 每孔加100 μL的鏈霉親和素-HRP后孵育1 h。再重復(fù)清洗步驟后, 每孔加100 μL新鮮配置AEC顯色液, 并將實驗板避光20 min顯色。顯色完成后棄溶液, 用去離子水洗若干遍后, 自然晾干實驗板, 用Bioreader4000-PRO-X(Bio-Sys, Germany)讀板儀進行斑點讀取, 單次實驗設(shè)置3個復(fù)孔進行均值統(tǒng)計, 3次獨立重復(fù)實驗后, 采用Origin 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析。
2 結(jié)果
為 了 減 小 偶 聯(lián) 體 系 的 規(guī) 模, 使 用9號 多 肽[SIINFEK(FITC)L, H-2 KB restricted]在最佳pH5.8時, 與納米金顆粒偶聯(lián)。在同一離心管中, 混合20 μmol/L等體積7.2 μL多肽和PEG, 形成摩爾比為1׃1。將混合物加到粒徑為15 nm的檸檬酸鹽包被的100 μL納米金顆粒中, 室溫攪拌金/PEG/多肽混合物1 h, 使硫醇和檸檬酸在納米金顆粒表面完全交換�；旌贤耆�, 將偶聯(lián)復(fù)合物轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中, 12 000 r/min離心30 min純化偶聯(lián)復(fù)合物并去除上清。用100 μL含0.2% Tween 20的乙醇溶液重懸偶聯(lián)復(fù)合物。圖5顯示了380~610 nm的光譜吸收以證實偶聯(lián)成功。
3 討論
隨著基因測序的應(yīng)用推廣, 針對腫瘤的治療勢必將趨于精準化和個性化, 其應(yīng)用主要包括兩個方面, 即精準診斷和精準治療。其中, 精準診斷深入基因水平對腫瘤發(fā)生原因進行定位; 治療上的精準化則指的是針對病因的靶向用藥。精準醫(yī)療作為一種新型的醫(yī)學概念及醫(yī)療模式, 目前正受到國家的大力支持, 基因測序政策的放開也打開了精準醫(yī)療產(chǎn)業(yè)化的大門。免疫治療作為繼手術(shù)、放療和化療之后的第四大腫瘤治療技術(shù), 其核心要素抗原表位的篩選必將成為腫瘤免疫療法中的重要一環(huán)和常規(guī)技術(shù)。腫瘤相關(guān)免疫原性多肽來源于腫瘤, 作為識別腫瘤抗擊腫瘤最直接的武器, 其免疫原性強弱直接關(guān)系到腫瘤治療的效果。
本研究從納米金顆粒良好的理化性質(zhì)及廣泛的生物學應(yīng)用入手, 將其與抗原多肽進行偶聯(lián)實現(xiàn)快速且簡便的篩選。在實驗過程中, 不斷優(yōu)化各種參數(shù), 如納米金顆粒與多肽偶聯(lián)時的pH、緩沖液體系、稀釋劑成分、硫金摩爾比、細胞攝取偶聯(lián)復(fù)合物的時間等參數(shù), 實現(xiàn)最優(yōu)的偶聯(lián)條件、最少的偶聯(lián)損耗以及最短的實驗時間。在多肽免疫原性實驗中成功驗證不同多肽的免疫原性。此外, 研究還成功實現(xiàn)了反應(yīng)體系的縮小, 以適應(yīng)高通量篩選的需求�，F(xiàn)今, 納米科技在生物學、醫(yī)學等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用, 納米材料的優(yōu)良特性使其擁有廣泛的應(yīng)用前景。生化藥品的研發(fā)如抗癌藥、抗心血管病藥、抗艾滋病和糖尿病藥, 特別是DNA藥物都可引入納米材料。因此, 本研究所涉及的實驗成果在抗病毒感染、腫瘤治療、疫苗開發(fā)等方面都具有重要的理論和實際意義。已有研究表明, 粒徑小于50 nm的微粒, 能穿過肝臟內(nèi)皮或通過淋巴傳遞到達脾和骨髓, 或者攜帶小分子多肽或藥物跨越血–腦屏障。因此, 針對納米金顆粒的研究必將極大地推動腫瘤的免疫治療。此外, 本研究后期可致力于尋找和設(shè)計DC細胞靶向型多肽, 可以直接利用人外周血單核細胞, 無需分離DC及T細胞, 減少細胞分離與共培養(yǎng)步驟。
抗原表位篩選結(jié)果最終可通過合適的方式, 轉(zhuǎn)換為醫(yī)療數(shù)據(jù)呈現(xiàn)給研究人員、醫(yī)務(wù)工作者及患者。隨著數(shù)據(jù)量的逐漸豐富, 腫瘤的新的基因標志或特異/共有的分子特征可能被發(fā)現(xiàn), 其治療方法也將隨著現(xiàn)有經(jīng)驗的積累而得到簡化與快速采用。本研究所涉及的實驗方法可與計算機模擬及預(yù)測相結(jié)合,利用現(xiàn)有的MHC分子三維結(jié)構(gòu)與實驗篩選出的免疫原性差異明顯的幾種多肽進行演算, 從抗原親和力微觀角度解釋其免疫原性的區(qū)別。隨著MHC分子的空間結(jié)構(gòu)越來越清晰化和準確化, 多種MHC分子–抗原復(fù)合物的數(shù)學模型已被建立, 通過計算機模擬運算能預(yù)估出每種抗原與MHC分子的親和力數(shù)值。但鑒于MHC分子亞型的多樣性, 新抗原前后氨基酸序列以不同組合、不同長度形成表位的多樣性,數(shù)據(jù)龐大。目前, 該預(yù)測方法仍不夠成熟, 假陽性或假陰性仍普遍存在, 需要后續(xù)耗時耗力的驗證工作。因而, MHC分子與抗原的親和力的準確預(yù)估, 仍有待于通過數(shù)據(jù)的不斷積累、預(yù)測模型的不斷優(yōu)化來完成。此外, 研究也可覆蓋MHC-I類分子及MHC-II類分子對抗原多肽的遞呈能力, 這兩類分子均可在免疫應(yīng)答過程中受細胞因子的誘導(dǎo)而表達, 在腫瘤治療中可通過提高抗原遞呈細胞表面表達量達到更好的治療效果。當多肽能穩(wěn)定均勻的分散在納米金顆粒上的時候, 進行多肽與MHC-I類及II類分子的親和力模擬及預(yù)測, 通過計算機模擬找到這兩類分子中起結(jié)合作用的關(guān)鍵氨基酸, 可為預(yù)測抗原遞呈能力提供理論基礎(chǔ)。
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