摘要：細(xì)菌生物膜導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性增加受到了廣泛關(guān)注�？股锬る氖且活惥哂幸种坪蜌缂�(xì)菌生物膜獨(dú)特優(yōu)勢的抗微生物肽,有望成為理想的抗細(xì)菌生物膜的新型抗菌藥物。就抗生物膜肽與生物膜各組分間的相互作用、抗生物膜肽對生物膜形成的干預(yù)作用及其調(diào)控、抗生物膜肽目前存在的問題及其解決思路以及抗生物膜肽未來的應(yīng)用領(lǐng)域等展開綜述。
1 抗生物膜肽與生物膜各組分間的相互作用
生物膜的胞外基質(zhì)中包含大量蛋白質(zhì),包括菌毛、IV型菌毛以及多種由細(xì)菌分泌的酶（如蛋白酶）等。以銅綠假單胞菌為例,其菌毛和IV型菌毛具有多種生物學(xué)功能,并且通過多種動(dòng)物研究證明了以鞭毛為靶抗原能夠預(yù)防銅綠假單胞菌導(dǎo)致的感染。除此之外,IV型菌毛還能與生物膜中其他成分相互結(jié)合使得生物膜更加穩(wěn)定[4]。Gowrishankar等[5]發(fā)現(xiàn)環(huán)二肽CLP能夠使表皮葡萄球菌的生物膜多糖、蛋白質(zhì)、eDNA顯著降低,但具體機(jī)制尚不明確。Duperthuy 等[6]發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌能增強(qiáng)OMVs蛋白表達(dá)來增強(qiáng)胞外基質(zhì)中的Bap1蛋白。Bap1蛋白可以連接LL-37和OMVs表面的OmpT蛋白,使得生物膜內(nèi)游離的LL-37濃度降低到有效濃度以下,使得生物膜細(xì)菌免受LL-37的作用。多種細(xì)胞外酶既是生物膜的組成成分,也是細(xì)菌的毒力因子組成成分之一。Akeel等[7]發(fā)現(xiàn)富含丙氨酸的抗生物膜肽PT13能夠減少金黃色葡萄球菌毒力因子的產(chǎn)生。而其他具有殺滅生物膜細(xì)菌作用的抗生物膜肽也能通過殺滅細(xì)菌的方式減少毒力因子的產(chǎn)生。
生物膜中的多糖結(jié)構(gòu)可以是單糖或者是大分子聚合物,主要用于維持生物膜的骨架結(jié)構(gòu)。多糖還可以通過物理或化學(xué)截留抗生素穿透、抑制中性粒細(xì)胞的趨化作用、抑制抗微生物肽活性、以及清除活性氧,有助于細(xì)菌在嚴(yán)苛的環(huán)境中生存[8]。
不同的致病菌產(chǎn)生的胞外多糖也有差異。大多數(shù)的致病菌產(chǎn)生陰離子胞外多糖,如銅綠假單胞菌的藻多糖（Alg）,少數(shù)致病菌也會(huì)產(chǎn)生陽離子胞外多糖,如表皮葡萄球菌的細(xì)胞間多糖黏附素（PIA）。此外,同種細(xì)菌產(chǎn)生的胞外多糖也可能有差異。例如,肺炎克雷伯菌KpTs101產(chǎn)生中性胞外多糖,而KpTs113產(chǎn)生陰離子胞外多糖[9]。一些抗生物膜肽能夠直接滲透進(jìn)入生物膜內(nèi)或?qū)е掳舛嗵菙嗔�。如Pulido等[10]合成設(shè)計(jì)了RNase3氮端衍生肽,并通過研究證實(shí)了活性位點(diǎn)缺陷突變體具有與親本蛋白相同的抗生物膜活性,并且具有比親本蛋白更加優(yōu)越的EPS穿透性。另外,破壞胞外多糖結(jié)構(gòu)也是抗生物膜肽作用的另一方面,在EPS與環(huán)二肽CLP相互作用后發(fā)現(xiàn),CLP能使表皮葡萄球菌EPS脫水,并使糖基乙�；柚功撂擒真I連接[5]。值得注意的是,胞外多糖與抗生物膜肽間的靜電相互作用會(huì)導(dǎo)致生物膜內(nèi)細(xì)菌對于抗生物膜肽的抵抗性增強(qiáng)。如陽離子抗微生物肽LL-37和hBD3與PIA的靜電排斥作用能夠減少其與細(xì)菌接觸[11]。而KpTs113帶負(fù)電荷的胞外多糖能促使陽離子抗生物膜肽BMAP-27由線型螺旋化,并且KpTs101中性胞外多糖表現(xiàn)出更強(qiáng)的誘導(dǎo)抗生物膜肽螺旋化的能力[9]。
細(xì)胞外DNA（eDNA）是細(xì)菌主動(dòng)釋放、分泌或是在細(xì)菌溶解后釋放在胞外基質(zhì)中的DNA,在細(xì)菌活動(dòng)中起著十分重要的作用。（1）構(gòu)成生物膜：是維持生物膜細(xì)菌黏附、聚積和生物膜穩(wěn)定性的重要組成成分[12];（2）營養(yǎng)作用：可以作為大腸桿菌唯一的磷、氮和碳的營養(yǎng)來源[13];（3）螯合作用：可以螯合金屬離子（如Mg2+）及抗生素（如氨基糖苷類藥物）[14];（4）降低pH;eDNA在生物膜中的累積會(huì)使生物膜局部環(huán)境酸化,酸性pH值會(huì)促進(jìn)銅綠假單胞菌的耐藥表型產(chǎn)生[12]。一些抗微生物肽能夠?qū)е律锬ぶ衑DNA含量下降或者直接與之結(jié)合,使得eDNA無法發(fā)揮其功能。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌肽（nisin）在高濃度條件下能夠減少生物膜中eDNA的含量,且呈濃度依賴性變化。Jones等[14]發(fā)現(xiàn)人源抗微生物肽（hBD-3）能夠直接與eDNA結(jié)合,但同時(shí)破壞了抗微生物肽hBD-3的生物活性。不能忽視的是,Lewenza等[16]報(bào)道了eDNA結(jié)合金屬陽離子（如Mg2+）后,能夠激活PhoPQ和PmrAB雙組分系統(tǒng)。導(dǎo)致細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化、負(fù)電荷被掩蓋（表型結(jié)構(gòu)特化細(xì)菌）,使得陽離子抗生物膜肽正電荷無法作用于細(xì)胞膜。
生物膜是一個(gè)具有“蘑菇樣”或“飄帶樣”的3D結(jié)構(gòu)實(shí)體,里面的生物膜細(xì)菌也各司其職[4]。部分是負(fù)責(zé)生物膜的累積并不斷分泌EPS的生物膜建設(shè)者,其與浮游態(tài)細(xì)菌并無兩樣。另一部分是如前文所述經(jīng)歷了細(xì)胞表面表型變化的表型結(jié)構(gòu)特化細(xì)菌,能夠產(chǎn)生高度的抗生素耐藥。最后是一些底層生物膜細(xì)菌,由于其不斷的受到低營養(yǎng)、低氧、低pH的極端環(huán)境挑戰(zhàn)[17],因此一些細(xì)菌為了生存由此轉(zhuǎn)入了一種“低代謝活動(dòng)狀態(tài)”甚至是“休眠狀態(tài)”。使其對一些作用于基因復(fù)制位點(diǎn)、mRNA、核糖體等代謝活動(dòng)相關(guān)抗生素高度耐藥,并且該生物膜細(xì)菌是在不經(jīng)歷基因遺傳變化的情況下產(chǎn)生對抗生素的耐藥[18]。
隨著生物膜試驗(yàn)研究不斷深入,一些能夠針對不同階段生物膜細(xì)菌的抗生物膜肽相繼被發(fā)現(xiàn)。LL-37是研究最廣泛的人源抗生物膜肽,LL-37自身及其片段、衍生物都被證實(shí)具有抗生物膜活性（包括抑制生物膜形成和破壞成熟生物膜）并能殺滅生物膜細(xì)菌[19]。De Brucker等[20]發(fā)現(xiàn)了鼠源抗生物膜肽CRAMP在亞抑菌濃度下,能夠抑制白色念珠菌生物膜的形成。Chen等[21]發(fā)現(xiàn)雞源抗生物膜肽Cath-2能夠穿透銅綠假單胞菌成熟生物膜并殺滅生物膜細(xì)菌,而CRAMP對整個(gè)生物膜有明顯的清除作用。Mwangi等[22]發(fā)現(xiàn)抗生物膜肽ZY4能夠殺滅鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜中的持留菌。Paulone等[23]發(fā)現(xiàn)了一種合成抗生物膜肽KP,能夠通過抑制生物膜細(xì)菌生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá)來破壞白色念珠菌成熟生物膜。
2 抗生物膜肽對生物膜形成的干預(yù)作用及其調(diào)控
生物膜的形成是一個(gè)連續(xù)、動(dòng)態(tài)的過程,主要分為黏附階段、形成階段、成熟階段和釋放階段[24]。其形成的具體過程常常受到基因調(diào)控與環(huán)境的共同作用。
致病菌形成生物膜的一個(gè)很重要環(huán)節(jié)就是細(xì)菌必須黏附于一個(gè)生物或者非生物表面。當(dāng)細(xì)菌未黏附時(shí)甚至黏附不牢固時(shí)生物膜形成時(shí)間和質(zhì)量都會(huì)受到影響。因此,利用抗微生物肽改變細(xì)菌的黏附能力或黏附的材料表面就能夠減少生物膜的形成。Scarsini等[25]利用抗生物膜肽LL-37減少了念珠菌對聚苯乙烯和硅酮表面的黏附從而阻止了念珠菌生物膜的形成。還有一些抗生物膜肽涂層研究將在本文應(yīng)用及展望中描述。
通過直接調(diào)控生物膜組分基因的表達(dá)也能影響生物膜的形成過程。Yu等[26]發(fā)現(xiàn)抗生物膜肽MC1可以通過下調(diào)銅綠假單胞菌pelA、AlgD和PslA基因的相對表達(dá)量減少胞外多糖合成來抑制生物膜的形成。Akeel等[7]發(fā)現(xiàn)富含丙氨酸的抗生物膜肽PT13能夠抑制細(xì)菌黏附和細(xì)菌黏附蛋白編碼基因、減少EPS的產(chǎn)生,抑制生物膜的形成。
密度感應(yīng)（Quorum sensing,QS）系統(tǒng)存在于多種細(xì)菌之中,調(diào)控著細(xì)菌多種毒力因子及生物膜的形成相關(guān)基因[27]。銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)主要由2組高絲氨酸（AHL）驅(qū)動(dòng)LasI/R和RhlI/R系統(tǒng)、2組非AHL驅(qū)動(dòng)的PQS和IQS系統(tǒng)組成,與生物膜相關(guān)的多為前者[27]。Taha等[28]合成了2種抗生物膜肽,結(jié)果顯示,其能減少銅綠假單胞菌PAO1生物膜的形成和毒力因子產(chǎn)生,并通過熒光定量PCR測定QS相關(guān)基因變化,并發(fā)現(xiàn)lasI、lasR、rhlI和rhlR的基因表達(dá)水平顯著降低。Ciulla等[29]報(bào)道了金黃色葡萄球菌的生物膜QS系統(tǒng)是由RNAIII活性肽（RAP）及其靶蛋白（TRAP）介導(dǎo)的,RNAIII抑制肽（RIP）能夠與RAP競爭從而抑制TRAP的磷酸化,來減少細(xì)菌黏附和生物膜形成。但此類抗生物膜肽并不具有殺菌活性,因此可作為藥物的增效劑。優(yōu)勢是直接作用于生物膜的形成,可以恢復(fù)抗生素和免疫系統(tǒng)對生物膜細(xì)菌的殺傷活性。
3,5-環(huán)二聚鳥苷單磷酸（c-di-GMP）是廣泛存在于細(xì)菌內(nèi)的第二信使,與多種生物學(xué)過程相關(guān),同時(shí)也與生物膜的形成直接相關(guān)。c-di-GMP含量增加可以促進(jìn)細(xì)菌表面黏附、聚集和EPS的分泌來誘導(dǎo)生物膜形成,降低則導(dǎo)致生物膜分散,因此可以通過減少細(xì)胞內(nèi)的c-di-GMP水平來促進(jìn)已經(jīng)形成的生物膜分解擴(kuò)散[30]。這一現(xiàn)象的機(jī)制可能與藻多糖的形成過程相關(guān),Whitney等[31]證實(shí)了Alg44具有一個(gè)具有二聚模式的PilZ折疊區(qū)域,能夠與c-di-GMP結(jié)合,控制藻酸鹽的分泌。隨后Foletti等[32]發(fā)現(xiàn)富含脯氨酸的四肽Gup-Gup-Nap-Arg在水中結(jié)合c-di-GMP比其他核苷酸擁有更高的選擇性,并且能抑制銅綠假單胞菌生物膜的生長。這一現(xiàn)象為抗生物膜肽的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了參考。
3 抗生物膜肽目前存在的問題及解決思路
由于抗生物膜肽具有抑制生物膜形成或清除已經(jīng)成熟的生物膜的特點(diǎn),越來越多的研究者認(rèn)為,它是是防治細(xì)菌生物膜感染的潛在新型藥物,但目前其自身還存在諸多缺陷使其很難應(yīng)用于臨床。
天然多肽在體內(nèi)很容易被蛋白酶水解以及血漿半衰期短。因此,如何提高抗生物膜肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性至關(guān)重要�？刮⑸镫慕Y(jié)構(gòu)修飾是重要的一步,目前可以通過將直鏈肽環(huán)化、將L-型氨基酸更換為D-型氨基酸、改變多肽鏈中單個(gè)或者多個(gè)氨基酸、改變多肽鏈的親/疏水性、利用藥劑學(xué)方法將多肽進(jìn)行包被等手段可提高抗生物膜肽的穩(wěn)定性和延長血漿半衰期[33]。
抗生物膜肽往往容易對真核細(xì)胞表現(xiàn)出一定的溶血性或細(xì)胞毒性。為此,如何對抗生物膜肽進(jìn)行修飾顯得至關(guān)重要。一方面是降低原有肽的細(xì)胞毒性,如Kang等[34]通過對Pseudin-2進(jìn)行一系列修飾,通過取代色氨酸和絲氨酸來增加疏水性,獲得的Pse-Anal6和Pse-Anal7可以顯著減少細(xì)胞毒性和溶血性。此外,其被賴氨酸取代類似物的截?cái)辔颬se-T3和Pse-T4也能減少細(xì)胞毒性和溶血性。另一方面是在較低細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)上,增加抗生物膜肽的抗生物膜性能,如Yu等[35]對SPLUNC1-α4螺旋結(jié)構(gòu)域增加陽離子數(shù)量和色氨酸的含量合成SPLUNC1-α4M1,這一改變顯著增加了肽的抗生物膜能力,但并沒有增加肽的溶血性和細(xì)胞毒性。除此之外,Kłodzińska等[36]利用改性透明質(zhì)酸組成的納米凝膠包被抗生物膜肽DJK-5后,納米凝膠中的DJK-5比未包被的肽的毒性降低了4倍,而不影響肽的抗菌性能。說明通過新型藥劑學(xué)的手段也可以降低抗生物膜肽的毒副作用。
抗微生物肽雖然種類繁多,但是來源卻十分有限。研究表明外源性添加活性成分可以上調(diào)機(jī)體內(nèi)源性抗生物膜肽的表達(dá)[37],但是分離純化難度大、產(chǎn)率低,難以直接滿足使用需要。雖然化學(xué)合成的方法可以解決抗生物膜肽產(chǎn)量低的問題,但生產(chǎn)成本高。利用基因工程的方法來表達(dá)抗生物膜肽似乎是個(gè)不錯(cuò)的選擇。目前,抗微生物肽主要的表達(dá)系統(tǒng)包括原核表達(dá)系統(tǒng)（大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、病毒表達(dá)系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)）、真核表達(dá)系統(tǒng)和動(dòng)植物表達(dá)系統(tǒng)等,但仍然存在在表達(dá)過程中對蛋白酶較為敏感,回收率低導(dǎo)致成本高等問題�？梢酝ㄟ^修飾增強(qiáng)酶穩(wěn)定性,提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)準(zhǔn)確性,采取適當(dāng)工藝提高產(chǎn)品回收率等辦法,最終提高抗生物膜肽的生產(chǎn)效率、降低成本,真正實(shí)現(xiàn)規(guī)�；彤a(chǎn)業(yè)化[38]。
由于抗生物膜肽自身的不足、生產(chǎn)成本昂貴以及專門針對生物膜的藥物開發(fā)周期較長等缺陷。因此,在現(xiàn)有抗生素的基礎(chǔ)上開展與抗生物膜肽的聯(lián)合用藥具有重大意義。Dosler等[39]通過研究3種抗生物膜肽和5種抗生素聯(lián)合用藥,提出抗生物膜肽與抗生素聯(lián)合使用有助于預(yù)防或者延緩耐藥性的出現(xiàn)。隨后Dosler等[40]又發(fā)現(xiàn)抗生物膜肽即使在1/10MIC濃度條件下,也能顯著增強(qiáng)抗生素的殺菌活性,甚至某些抗生素的最小生物膜根除濃度（MBEC）降低了8倍。Lashua等[41]報(bào)道了WLBU2陽離子抗菌肽,與妥布霉素、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、美羅培南聯(lián)用時(shí)顯著增強(qiáng)了抗生素對生物膜細(xì)菌的殺傷活性。但其具體機(jī)制尚不明確,推測如下：（1）抗生物膜肽增加了EPS的通透性。如Martinez等[42]利用共聚焦激光掃描顯微鏡發(fā)現(xiàn),P5抗生物膜肽可以破壞銅綠假單胞菌生物膜原有結(jié)構(gòu)。若此時(shí)聯(lián)合本身具有抑殺該類細(xì)菌活性的抗生素,可使其在生物膜內(nèi)局部濃度升高而起到協(xié)同作用;（2）抗生物膜肽恢復(fù)生物膜細(xì)菌代謝活性。生物膜細(xì)菌常常處于活性較低甚至是可逆的休眠狀態(tài),而通常抗生素對低代謝活性的細(xì)菌作用較弱,從而導(dǎo)致高度的抗生素耐藥[18],抗生物膜肽可能促使生物膜細(xì)菌由休眠態(tài)重新復(fù)蘇,聯(lián)合用藥之后可使生物膜細(xì)菌對抗生素更加敏感;（3）抗生物膜肽影響生物膜成熟程度,有利于抗生素發(fā)揮殺菌作用。如前文所述,某些抗生物膜肽直接參與生物膜形成的調(diào)控過程,雖本身并不具有殺菌活性,但可降低生物膜的高度結(jié)構(gòu)化,聯(lián)合使用抗生素后更有利于后者發(fā)揮殺菌作用。
4 應(yīng)用及展望
隨著由生物膜引起的致病菌耐藥性不斷加劇,抗生物膜肽由于其種類豐富、作用機(jī)制獨(dú)特及不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)而受到廣泛的關(guān)注。近年來已有一些抗微生物肽被應(yīng)用于臨床實(shí)踐。例如,由Xoma公司合成的Neuprex被應(yīng)用于腦膜炎雙球菌血癥患兒。EntoMed SA 公司合成的Thanatin 衍生肽被應(yīng)用于免疫低下患者全身性真菌感染和多重耐藥菌感染。Micrologix 生物技術(shù)公司合成的MBI-肽被應(yīng)用于尿道相關(guān)的血流感染、鼻腔感染。Demgen和Dow制藥公司合成的Histatin 衍生肽被應(yīng)用于牙跟炎、口腔感染和口腔念珠菌感染[37]。
未來將不斷探索和拓展抗生物膜肽的種類和功能�？股锬る膶�(huì)以多種形式應(yīng)用于生活中的各個(gè)領(lǐng)域,由細(xì)菌生物膜引起的感染和困擾將被逐一解決。
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