摘要：環(huán)二肽是兩個氨基酸通過肽鍵縮合而成的化合物。環(huán)二肽具有獨特的結構賦予其兩個氫供體與氫受體的特征，它與不同靶標物質結合后能產生諸多效應，從而表現出多種生物活性。環(huán)二肽來源廣泛，隨著現代科技的發(fā)展，可以從真菌和細菌中提取分離出環(huán)二肽，也可以通過生物或化學方法合成環(huán)二肽。除了在抗生素、抗腫瘤藥物研發(fā)、抗氧化、降血糖等方面具有巨大的潛力外，在調節(jié)能量代謝、調控食欲、改善神經系統(tǒng)和降低心臟傳導速率等方面也有很廣闊的前景。因此，本文對近5年來發(fā)現的環(huán)二肽進行綜述，主要介紹了環(huán)二肽的來源、結構與理化性質，并對其生物活性展開重點闡述，并提出了建議和展望。
環(huán)二肽是由2個氨基酸首尾相連形成的、具有優(yōu)異剛性結構和生物活性的哌嗪二酮類化合物(diketopiperazines，DKPs)。Curtius等[1]在1888年首次合成出第一種環(huán)二肽cyclo(Gly-Gly)。環(huán)二肽來源廣泛，隨著現代科技的發(fā)展，可以從真菌和細菌中提取分離出環(huán)二肽，也可以通過生物或化學方法合成環(huán)二肽。環(huán)二肽的結構種類豐富，僅僅是常規(guī)天然氨基酸進行環(huán)化所形成的環(huán)二肽種類就多達210種，其結構的多樣性使得環(huán)二肽具有多種生物活性。在過去的幾年中，越來越多的研究報道了環(huán)二肽的生物活性，包括參與細胞間信息傳遞、抑菌和抗腫瘤等，其中研究最為廣泛的是其抗菌和抗腫瘤的功效。例如cyclo(D-Ala-D-Trp)能有效抑制人宮頸癌細胞的生長[2]，以及cyclo(Tyr-Gly)抑制大腸埃希菌的繁殖[3]。后又陸續(xù)報道證實了環(huán)二肽的抗氧化和降血糖等作用。如今病原菌的耐藥性越來越普遍，濫用抗生素等問題也未受到重視，這些現象都促使對環(huán)二肽生物活性進行深入研究。本文主要對環(huán)二肽的生物活性進行綜述，同時對其藥物生產及臨床應用等方面做出展望。
1 環(huán)二肽的來源
環(huán)二肽來源廣泛，迄今為止，絕大多數環(huán)二肽來自革蘭陰性菌[4]，少部分來自于植物、動物、革蘭陽性菌以及真菌[5]。例如2017年，Gowrishankar等[6]從解淀粉芽胞桿菌(MMS-50)提取的cyclo(L-LeuL-Pro)(CLP)能抑制細菌生物膜，但這并非殺菌作用。2020年，郭慶豐等[3]在大黃魚共生菌(Bacillus coagulans LL1103)的代謝產物中發(fā)現的cyclo(TyrGly)、cyclo(Pro-Gly)和cyclo(Pro-Val)對大腸埃希菌具有抑制作用。
目前環(huán)二肽的合成方法主要分為以下2種。
而合成環(huán)二肽的經典方法是溶液合成法。即將線性肽放置于溶液中，并使用縮合劑使其連接成環(huán)，也可以將線性肽的C端通過硫酯法等活化然后再進行成環(huán)。優(yōu)點在于避免氨基酸的異構化[8]。
2 環(huán)二肽的結構與理化性質
大多數的環(huán)二肽呈弱堿性，常常微溶于水，易溶于甲醇等有機溶劑中，形態(tài)一般為結晶或粉末，熔點一般高于200 ℃[19]。通常采用強氧化劑去檢測環(huán)二肽的存在，環(huán)二肽與不同試劑反應會呈現出不同顏色的斑點[20]，例如熒光指示劑、碘化鉍鉀試劑。
3 環(huán)二肽的生物活性
近年來的研究表明：群體感應(quorum sensing，QS)是細菌通過自誘導物質(auto-inducer，AI)監(jiān)測其種群密度，用于調節(jié)生物的群體行為的一種信息傳遞機制。如生物膜形成、助細菌感染、分泌毒力因子等[21]。目前，最常見的是高絲氨酸內酯(acylhomoserine lactones，AHL)信號傳遞途徑，在群體感應通路中，信號分子AHLs與LuxR型蛋白結合，產生反應，調節(jié)相關基因的表達，從而使細菌進行一定的生理活動。由AHLs介導的群體感應系統(tǒng)的物質被認定為群體感應抑制劑。據報道，DKPs能夠調節(jié)LuxR型受體活性。如，創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)產生的cyclo(L-Phe-L-Pro)可以誘導費氏弧菌V. fischerilux基因的表達[22]。DKPs還可以有效提高相關基因的轉錄水平。例如，在氣味沙雷菌(Serratia odorifera)中新發(fā)現了一種QS系統(tǒng)，其中cyclo(ProPhe)等AI可以提高真姬菇(H. marmoreus)木質素降解酶基因的轉錄水平[23]。具體的相關信號分子及機制還待進一步研究。
近年來，為了解決病原菌的耐藥性日益嚴重的問題，人們越來越關注通過抑制生物膜的形成和毒力因子的合成等途徑阻礙其進化為耐藥菌株的方法。2019年，Shanmugaraj等[25]研究了cyclo(LLeu-L-Pro)(CLP)對黏質沙雷菌(Serratia marcescens)的抗QS效果。他們進行了體內、體外的多種實驗研究，其中包括最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)試驗、蛋白酶試驗、游動和群集運動試驗，秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)模型等。并通過qPCR技術證實了CLP確實能有效抑制黏質沙雷菌中QS控制的靈桿菌素的產生。在分子水平上，通過下調fimA和fimC的表達，減少菌毛蛋白的合成，進而抑制黏質沙雷菌的附著，阻礙生物膜的組裝。此外，CLP還下調了FlhD、FlhC和bsmB基因的表達，發(fā)揮抑制黏質沙雷菌的游泳和群集運動以及妨礙黏質沙雷菌的體內復制和移植的功效。其結果表明CLP對生物膜的抑制作用是開發(fā)生物膜劑的基礎。2020年，從米曲霉(Aspergillus oryzae)的代謝產物中分離得到的環(huán)二肽對熒光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens)的群體感應表型具有很好的抑制作用，由此推測環(huán)二肽可能是一種新群體感應抑制劑[26]。2021年，從海洋真菌DXY-1粗提物中分離鑒定出的cyclo(L-Tyr-L-Pro)對紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum CV026)和銅綠假單胞菌(P. Aeruginosa PA01)表現出顯著的QS調控的毒力抑制作用[27]。環(huán)二肽有望成為一個抗菌藥物開發(fā)的新的潛在靶點。
據統(tǒng)計，在我國盡管食管癌、肝癌等癌癥的腫瘤死亡率逐年降低，肺癌、乳腺癌、結直腸癌、宮頸癌和前列腺癌的發(fā)病率仍然呈現上升的趨勢。研發(fā)針對性的靶向藥物的腳步刻不容緩[28]。
通過實驗數據可以發(fā)現兩個影響毒性作用的因素。首先是癌細胞的類型，Ye等[33]從紅樹林鏈霉菌(Mangrove Streptomyces sp. Q24)中分離出來的cyclo(L-Phel-L-Hyp)在人膠質瘤U87-MG和U251細胞的增殖抑制實驗中，分別當IC50為5.8 和18.6 μmol/L時表現出一定效力，而在HCT-116、OVCAR-8和SF-295細胞系上測試時發(fā)現在25 µg/mL[34]上也無法顯示出明確的細胞毒性作用。除了靶向癌細胞的類別造成的差異外，環(huán)二肽本身的結構對毒性作用的產生也有影響，例如cyclo(L-Leu-L-Hyp)及其結構類似物cyclo(L-Leu-L-Pro)對U251和U87-MG細胞系的毒性實驗中，二者分別在IC50為29.4與14.5 μmol/L以及IC50為19.8與1.3 μmol/L[33]時對該細胞系表現出毒性作用。以上表明，環(huán)二肽雖然具有抗腫瘤的生理特性，但是環(huán)二肽類(CDPs)化合物不能對所有的腫瘤細胞都具有較強的抑制作用，其更強的毒性作用體現在細胞特異性方面[35]。
近年來，關于含硫DKPs的研究報道了一些環(huán)二肽對癌細胞的毒性作用，這些DKPs大多來自于真菌[36]。冠毛桿菌(C. cristatum)中發(fā)現的Cristazine通過死亡受體途徑誘導細胞凋亡，對HeLa和A451具有細胞毒作用[32-37]。葉催產素是一種含二聚硫的DKPs，對實體腫瘤和血液腫瘤都表現出廣泛的細胞毒性作用[38-39]，在Lai等[40]的研究中，其在急性髓系白血病細胞HL-60、U937和KG-1a中誘導分化，并與其他表觀遺傳藥物顯示協(xié)同細胞毒性。除了細胞毒性作用，部分DKPs還能抑制一些腫瘤相關物質的合成[36]。BRD4蛋白經常在各種類型的腫瘤中表達，在Yu等[41]的報道中，基于脯氨酸的幾種五環(huán)、六環(huán)或二聚體DKPs可能是BRD4蛋白(含溴域蛋白4)的有效抑制劑。
Song等[42]在2018年分離并鑒定了3株對茄科雷爾氏菌(Ralstonia Solanacearum GMI1000)具有高抗菌活性的新菌株。在前期工作中發(fā)現大腸埃希菌(Escherichia coli GZ-34)對茄科雷爾菌相對防治效果最佳，達到82.27%，且疾病指數降低至最小，達到16.67。研究人員對大腸埃希菌GZ-34的抗青枯病活性做進一步研究。在活性研究中發(fā)現cyclo(L-Pro-DIle)和cyclo(L-Pro-L-Phe)是大腸埃希菌GZ-34產生的主要抗青枯病活性物質。且后者是該菌株對稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)孢子形成的抑制活性的關鍵成分。這些發(fā)現提示，大腸埃希菌中的環(huán)二肽可能被開發(fā)為新的潛在抗菌劑，用于農業(yè)防治。
2020年郭慶豐等[3]在研究抑菌活性中發(fā)現：化合物cyclo(Tyr-Gly)、cyclo(Pro-Gly)和cyclo(Pro-Val)對大腸埃希菌有較強的抑制作用，MIC分別為16.0、4.0和8.0 µg/mL。2022年，Youssef 等[43]在對曲菌屬中新發(fā)現的兩種化合物進行的圓盤擴散實驗結果表明：cyclo(L-NMe-Leu-L-NAc-Phe)和cyclo(D-6-OH-Pro-D-Phe)對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌作用高于白念珠菌(Candida albicans)。目前已知的比較有效的是cyclo(Phe-Pro)(CFP)和為cyclo(His-Pro)(CHP)。其中CFP主要是通過刺激外膜孔蛋白OmpU的表達進而發(fā)揮作用；CHP主要通過增加抗促凋亡蛋白Bcl-2的表達，降低由氧化應激所引起的細胞凋亡進而發(fā)揮作用[44]。
迄今為止，已有3種可能的機制來解釋CHP的降血糖作用[48]。①腸促胰島素樣機制，促進胰島素分泌。Mori等[49]在測定大鼠胰腺提取物中的CHP時推論cyclo(His-Pro)可能通過參與兒茶酚胺代謝、促進胰島素及胃腸激素的分泌來參與糖代謝。②促進腸道對鋅的吸收以及刺激肌肉細胞對葡萄糖的吸收的機制。已知Goto-Kakizaki大鼠模型是研究與肥胖無關的糖尿病的最佳模型。Song等[50]利用此模型研究鋅加CHP在遺傳性糖尿病中的抗高血糖活性時發(fā)現，CHP能通過刺激葡萄糖利用來改善血糖代謝。其過程可能是通過影響胰島素受體亞基的自磷酸化來刺激大鼠肌肉組織中的葡萄糖攝取。③基于對活性羰基物種(reactive carbonyl species，RCS)具有顯著的解毒作用的特性，促進高級脂質氧化終產物(advanced lipoxi-dation end-products，ALEs)的生成減少。已知持續(xù)的高血糖水平會促進自由基的生成，而自由基會催化RCS的生成，最后造成β細胞的功能障礙[51]。這些生物效應對抗氧化、降血糖等肽類藥物的研發(fā)具有提示意義。
環(huán)二肽可以通過抑制酶的活性來改善中樞神經系統(tǒng)。申麗等[52]在研究裙帶菜內生菌(Bacillus sp.QD4)發(fā)酵液的化學成分時發(fā)現，在400 µg/mL濃度時，cyclo(L-Pro-D-Tyr)和cyclo(L-Pro-L-Tyr)對AChE的抑制率分別為5.62％±1.63％和11.62％±2.29％。據研究表明，部分阿爾茨海默病 (alzheimerdisease，AD)患者的海馬和新皮質的乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)會顯著減少。上述2種環(huán)二肽抑制AChE活性，導致AChE的減少，達到明顯改善和緩解AD患者的癥狀的成果。這為研發(fā)AChE抑制劑提供了新方向。
此外，環(huán)二肽還可以發(fā)揮神經保護和神經調節(jié)功能。已知cyclo(Gly-Pro)(CGP)對中樞神經系統(tǒng)有良好作用，包括抗健忘、促進記憶作用[53]，神經保護作用[54]。Kaneko等[55]對口服CGP促進大鼠中風模型的任務學習展開研究。已知達到學習標準所需天數的主要影響因素可能是病變區(qū)的大小。而且腦室下區(qū)(subventricular zone，SVZ)神經干細胞數量的增加被認為是皮質損傷后新神經元的來源。在該實驗中，他們監(jiān)測到大鼠在口服CGP后損傷體積減小，干細胞數量增加。低CGP組大鼠學會任務的所需時間更短。據研究表明[56]：大多數內源性IGF-1與IGFBP-3結合，少部分游離的IGF-1通過與IGF-1R結合，影響神經元生長、存活和生長。CGP可以通過與內源性IGF-1競爭結合IGFBP-3來調節(jié)游離的IGF-1。他們認為是因為外源性CGP的添加調節(jié)了IGF-1的量。損傷區(qū)域附近的IGF-1濃度增加，促進了學習。該報道首次闡述了口服最佳劑量的CGP可通過神經可塑性和網絡重構的方式，促進局灶性缺血性梗死大鼠的感覺-運動聯想學習，而非通過神經保護作用。該研究結果提示CGP給藥有望成為加速腦損傷修復的策略[55]。
4 總結和展望
綜上所述，環(huán)二肽的生物活性不僅限于抗菌、抗腫瘤，還包括影響抗氧化、降血糖、加速腦損傷修復等作用�，F在的科學技術越來越發(fā)達，我們能夠更容易地提取出環(huán)二肽類化合物，也能更容易合成環(huán)二肽類化合物，環(huán)二肽是環(huán)肽類化合物里最小，最簡單的環(huán)肽化合物，也是最有特點的化合物。本課題組在對20余種化學合成的環(huán)二肽樣品進行細胞毒性實驗時，發(fā)現幾種對NIH-3T3細胞生長具有促進作用的活性結構。由此可見，通過合理設計與化學合成有望開發(fā)出新型功能環(huán)二肽。
根據最新的文獻及數據總結了多種環(huán)二肽的生理活性，它們可以作為信息分子參與細胞間信息傳遞，也可以抗腫瘤、抑菌、抗氧化、降血糖和提高心血管系統(tǒng)能力等，如表1所示等。綜上所述，希望加強環(huán)二肽的生物學活性和藥理價值方面的研究，更加充分地了解它的特性，發(fā)掘它在抗菌、抗腫瘤藥物研發(fā)、農業(yè)應用等方面更大的潛力，創(chuàng)造出更大的應用價值。
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