摘要：環(huán)二肽是兩個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵縮合而成的化合物。環(huán)二肽具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予其兩個(gè)氫供體與氫受體的特征，它與不同靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)合后能產(chǎn)生諸多效應(yīng)，從而表現(xiàn)出多種生物活性。環(huán)二肽來(lái)源廣泛，隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，可以從真菌和細(xì)菌中提取分離出環(huán)二肽，也可以通過(guò)生物或化學(xué)方法合成環(huán)二肽。除了在抗生素、抗腫瘤藥物研發(fā)、抗氧化、降血糖等方面具有巨大的潛力外，在調(diào)節(jié)能量代謝、調(diào)控食欲、改善神經(jīng)系統(tǒng)和降低心臟傳導(dǎo)速率等方面也有很廣闊的前景。因此，本文對(duì)近5年來(lái)發(fā)現(xiàn)的環(huán)二肽進(jìn)行綜述，主要介紹了環(huán)二肽的來(lái)源、結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)，并對(duì)其生物活性展開(kāi)重點(diǎn)闡述，并提出了建議和展望。
環(huán)二肽是由2個(gè)氨基酸首尾相連形成的、具有優(yōu)異剛性結(jié)構(gòu)和生物活性的哌嗪二酮類化合物(diketopiperazines，DKPs)。Curtius等[1]在1888年首次合成出第一種環(huán)二肽cyclo(Gly-Gly)。環(huán)二肽來(lái)源廣泛，隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，可以從真菌和細(xì)菌中提取分離出環(huán)二肽，也可以通過(guò)生物或化學(xué)方法合成環(huán)二肽。環(huán)二肽的結(jié)構(gòu)種類豐富，僅僅是常規(guī)天然氨基酸進(jìn)行環(huán)化所形成的環(huán)二肽種類就多達(dá)210種，其結(jié)構(gòu)的多樣性使得環(huán)二肽具有多種生物活性。在過(guò)去的幾年中，越來(lái)越多的研究報(bào)道了環(huán)二肽的生物活性，包括參與細(xì)胞間信息傳遞、抑菌和抗腫瘤等，其中研究最為廣泛的是其抗菌和抗腫瘤的功效。例如cyclo(D-Ala-D-Trp)能有效抑制人宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[2]，以及cyclo(Tyr-Gly)抑制大腸埃希菌的繁殖[3]。后又陸續(xù)報(bào)道證實(shí)了環(huán)二肽的抗氧化和降血糖等作用。如今病原菌的耐藥性越來(lái)越普遍，濫用抗生素等問(wèn)題也未受到重視，這些現(xiàn)象都促使對(duì)環(huán)二肽生物活性進(jìn)行深入研究。本文主要對(duì)環(huán)二肽的生物活性進(jìn)行綜述，同時(shí)對(duì)其藥物生產(chǎn)及臨床應(yīng)用等方面做出展望。
1 環(huán)二肽的來(lái)源
環(huán)二肽來(lái)源廣泛，迄今為止，絕大多數(shù)環(huán)二肽來(lái)自革蘭陰性菌[4]，少部分來(lái)自于植物、動(dòng)物、革蘭陽(yáng)性菌以及真菌[5]。例如2017年，Gowrishankar等[6]從解淀粉芽胞桿菌(MMS-50)提取的cyclo(L-LeuL-Pro)(CLP)能抑制細(xì)菌生物膜，但這并非殺菌作用。2020年，郭慶豐等[3]在大黃魚(yú)共生菌(Bacillus coagulans LL1103)的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的cyclo(TyrGly)、cyclo(Pro-Gly)和cyclo(Pro-Val)對(duì)大腸埃希菌具有抑制作用。
目前環(huán)二肽的合成方法主要分為以下2種。
而合成環(huán)二肽的經(jīng)典方法是溶液合成法。即將線性肽放置于溶液中，并使用縮合劑使其連接成環(huán)，也可以將線性肽的C端通過(guò)硫酯法等活化然后再進(jìn)行成環(huán)。優(yōu)點(diǎn)在于避免氨基酸的異構(gòu)化[8]。
2 環(huán)二肽的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)
大多數(shù)的環(huán)二肽呈弱堿性，常常微溶于水，易溶于甲醇等有機(jī)溶劑中，形態(tài)一般為結(jié)晶或粉末，熔點(diǎn)一般高于200 ℃[19]。通常采用強(qiáng)氧化劑去檢測(cè)環(huán)二肽的存在，環(huán)二肽與不同試劑反應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)出不同顏色的斑點(diǎn)[20]，例如熒光指示劑、碘化鉍鉀試劑。
3 環(huán)二肽的生物活性
近年來(lái)的研究表明：群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)是細(xì)菌通過(guò)自誘導(dǎo)物質(zhì)(auto-inducer，AI)監(jiān)測(cè)其種群密度，用于調(diào)節(jié)生物的群體行為的一種信息傳遞機(jī)制。如生物膜形成、助細(xì)菌感染、分泌毒力因子等[21]。目前，最常見(jiàn)的是高絲氨酸內(nèi)酯(acylhomoserine lactones，AHL)信號(hào)傳遞途徑，在群體感應(yīng)通路中，信號(hào)分子AHLs與LuxR型蛋白結(jié)合，產(chǎn)生反應(yīng)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而使細(xì)菌進(jìn)行一定的生理活動(dòng)。由AHLs介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)的物質(zhì)被認(rèn)定為群體感應(yīng)抑制劑。據(jù)報(bào)道，DKPs能夠調(diào)節(jié)LuxR型受體活性。如，創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)產(chǎn)生的cyclo(L-Phe-L-Pro)可以誘導(dǎo)費(fèi)氏弧菌V. fischerilux基因的表達(dá)[22]。DKPs還可以有效提高相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。例如，在氣味沙雷菌(Serratia odorifera)中新發(fā)現(xiàn)了一種QS系統(tǒng)，其中cyclo(ProPhe)等AI可以提高真姬菇(H. marmoreus)木質(zhì)素降解酶基因的轉(zhuǎn)錄水平[23]。具體的相關(guān)信號(hào)分子及機(jī)制還待進(jìn)一步研究。
近年來(lái)，為了解決病原菌的耐藥性日益嚴(yán)重的問(wèn)題，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注通過(guò)抑制生物膜的形成和毒力因子的合成等途徑阻礙其進(jìn)化為耐藥菌株的方法。2019年，Shanmugaraj等[25]研究了cyclo(LLeu-L-Pro)(CLP)對(duì)黏質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescens)的抗QS效果。他們進(jìn)行了體內(nèi)、體外的多種實(shí)驗(yàn)研究，其中包括最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)試驗(yàn)、蛋白酶試驗(yàn)、游動(dòng)和群集運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)，秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)模型等。并通過(guò)qPCR技術(shù)證實(shí)了CLP確實(shí)能有效抑制黏質(zhì)沙雷菌中QS控制的靈桿菌素的產(chǎn)生。在分子水平上，通過(guò)下調(diào)fimA和fimC的表達(dá)，減少菌毛蛋白的合成，進(jìn)而抑制黏質(zhì)沙雷菌的附著，阻礙生物膜的組裝。此外，CLP還下調(diào)了FlhD、FlhC和bsmB基因的表達(dá)，發(fā)揮抑制黏質(zhì)沙雷菌的游泳和群集運(yùn)動(dòng)以及妨礙黏質(zhì)沙雷菌的體內(nèi)復(fù)制和移植的功效。其結(jié)果表明CLP對(duì)生物膜的抑制作用是開(kāi)發(fā)生物膜劑的基礎(chǔ)。2020年，從米曲霉(Aspergillus oryzae)的代謝產(chǎn)物中分離得到的環(huán)二肽對(duì)熒光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens)的群體感應(yīng)表型具有很好的抑制作用，由此推測(cè)環(huán)二肽可能是一種新群體感應(yīng)抑制劑[26]。2021年，從海洋真菌DXY-1粗提物中分離鑒定出的cyclo(L-Tyr-L-Pro)對(duì)紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum CV026)和銅綠假單胞菌(P. Aeruginosa PA01)表現(xiàn)出顯著的QS調(diào)控的毒力抑制作用[27]。環(huán)二肽有望成為一個(gè)抗菌藥物開(kāi)發(fā)的新的潛在靶點(diǎn)。
據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)盡管食管癌、肝癌等癌癥的腫瘤死亡率逐年降低，肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌和前列腺癌的發(fā)病率仍然呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。研發(fā)針對(duì)性的靶向藥物的腳步刻不容緩[28]。
通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)兩個(gè)影響毒性作用的因素。首先是癌細(xì)胞的類型，Ye等[33]從紅樹(shù)林鏈霉菌(Mangrove Streptomyces sp. Q24)中分離出來(lái)的cyclo(L-Phel-L-Hyp)在人膠質(zhì)瘤U87-MG和U251細(xì)胞的增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，分別當(dāng)IC50為5.8 和18.6 μmol/L時(shí)表現(xiàn)出一定效力，而在HCT-116、OVCAR-8和SF-295細(xì)胞系上測(cè)試時(shí)發(fā)現(xiàn)在25 µg/mL[34]上也無(wú)法顯示出明確的細(xì)胞毒性作用。除了靶向癌細(xì)胞的類別造成的差異外，環(huán)二肽本身的結(jié)構(gòu)對(duì)毒性作用的產(chǎn)生也有影響，例如cyclo(L-Leu-L-Hyp)及其結(jié)構(gòu)類似物cyclo(L-Leu-L-Pro)對(duì)U251和U87-MG細(xì)胞系的毒性實(shí)驗(yàn)中，二者分別在IC50為29.4與14.5 μmol/L以及IC50為19.8與1.3 μmol/L[33]時(shí)對(duì)該細(xì)胞系表現(xiàn)出毒性作用。以上表明，環(huán)二肽雖然具有抗腫瘤的生理特性，但是環(huán)二肽類(CDPs)化合物不能對(duì)所有的腫瘤細(xì)胞都具有較強(qiáng)的抑制作用，其更強(qiáng)的毒性作用體現(xiàn)在細(xì)胞特異性方面[35]。
近年來(lái)，關(guān)于含硫DKPs的研究報(bào)道了一些環(huán)二肽對(duì)癌細(xì)胞的毒性作用，這些DKPs大多來(lái)自于真菌[36]。冠毛桿菌(C. cristatum)中發(fā)現(xiàn)的Cristazine通過(guò)死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)HeLa和A451具有細(xì)胞毒作用[32-37]。葉催產(chǎn)素是一種含二聚硫的DKPs，對(duì)實(shí)體腫瘤和血液腫瘤都表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞毒性作用[38-39]，在Lai等[40]的研究中，其在急性髓系白血病細(xì)胞HL-60、U937和KG-1a中誘導(dǎo)分化，并與其他表觀遺傳藥物顯示協(xié)同細(xì)胞毒性。除了細(xì)胞毒性作用，部分DKPs還能抑制一些腫瘤相關(guān)物質(zhì)的合成[36]。BRD4蛋白經(jīng)常在各種類型的腫瘤中表達(dá)，在Yu等[41]的報(bào)道中，基于脯氨酸的幾種五環(huán)、六環(huán)或二聚體DKPs可能是BRD4蛋白(含溴域蛋白4)的有效抑制劑。
Song等[42]在2018年分離并鑒定了3株對(duì)茄科雷爾氏菌(Ralstonia Solanacearum GMI1000)具有高抗菌活性的新菌株。在前期工作中發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌(Escherichia coli GZ-34)對(duì)茄科雷爾菌相對(duì)防治效果最佳，達(dá)到82.27%，且疾病指數(shù)降低至最小，達(dá)到16.67。研究人員對(duì)大腸埃希菌GZ-34的抗青枯病活性做進(jìn)一步研究。在活性研究中發(fā)現(xiàn)cyclo(L-Pro-DIle)和cyclo(L-Pro-L-Phe)是大腸埃希菌GZ-34產(chǎn)生的主要抗青枯病活性物質(zhì)。且后者是該菌株對(duì)稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)孢子形成的抑制活性的關(guān)鍵成分。這些發(fā)現(xiàn)提示，大腸埃希菌中的環(huán)二肽可能被開(kāi)發(fā)為新的潛在抗菌劑，用于農(nóng)業(yè)防治。
2020年郭慶豐等[3]在研究抑菌活性中發(fā)現(xiàn)：化合物cyclo(Tyr-Gly)、cyclo(Pro-Gly)和cyclo(Pro-Val)對(duì)大腸埃希菌有較強(qiáng)的抑制作用，MIC分別為16.0、4.0和8.0 µg/mL。2022年，Youssef 等[43]在對(duì)曲菌屬中新發(fā)現(xiàn)的兩種化合物進(jìn)行的圓盤(pán)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：cyclo(L-NMe-Leu-L-NAc-Phe)和cyclo(D-6-OH-Pro-D-Phe)對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌作用高于白念珠菌(Candida albicans)。目前已知的比較有效的是cyclo(Phe-Pro)(CFP)和為cyclo(His-Pro)(CHP)。其中CFP主要是通過(guò)刺激外膜孔蛋白OmpU的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮作用；CHP主要通過(guò)增加抗促凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低由氧化應(yīng)激所引起的細(xì)胞凋亡進(jìn)而發(fā)揮作用[44]。
迄今為止，已有3種可能的機(jī)制來(lái)解釋CHP的降血糖作用[48]。①腸促胰島素樣機(jī)制，促進(jìn)胰島素分泌。Mori等[49]在測(cè)定大鼠胰腺提取物中的CHP時(shí)推論cyclo(His-Pro)可能通過(guò)參與兒茶酚胺代謝、促進(jìn)胰島素及胃腸激素的分泌來(lái)參與糖代謝。②促進(jìn)腸道對(duì)鋅的吸收以及刺激肌肉細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收的機(jī)制。已知Goto-Kakizaki大鼠模型是研究與肥胖無(wú)關(guān)的糖尿病的最佳模型。Song等[50]利用此模型研究鋅加CHP在遺傳性糖尿病中的抗高血糖活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，CHP能通過(guò)刺激葡萄糖利用來(lái)改善血糖代謝。其過(guò)程可能是通過(guò)影響胰島素受體亞基的自磷酸化來(lái)刺激大鼠肌肉組織中的葡萄糖攝取。③基于對(duì)活性羰基物種(reactive carbonyl species，RCS)具有顯著的解毒作用的特性，促進(jìn)高級(jí)脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物(advanced lipoxi-dation end-products，ALEs)的生成減少。已知持續(xù)的高血糖水平會(huì)促進(jìn)自由基的生成，而自由基會(huì)催化RCS的生成，最后造成β細(xì)胞的功能障礙[51]。這些生物效應(yīng)對(duì)抗氧化、降血糖等肽類藥物的研發(fā)具有提示意義。
環(huán)二肽可以通過(guò)抑制酶的活性來(lái)改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)。申麗等[52]在研究裙帶菜內(nèi)生菌(Bacillus sp.QD4)發(fā)酵液的化學(xué)成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，在400 µg/mL濃度時(shí)，cyclo(L-Pro-D-Tyr)和cyclo(L-Pro-L-Tyr)對(duì)AChE的抑制率分別為5.62％±1.63％和11.62％±2.29％。據(jù)研究表明，部分阿爾茨海默病 (alzheimerdisease，AD)患者的海馬和新皮質(zhì)的乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)會(huì)顯著減少。上述2種環(huán)二肽抑制AChE活性，導(dǎo)致AChE的減少，達(dá)到明顯改善和緩解AD患者的癥狀的成果。這為研發(fā)AChE抑制劑提供了新方向。
此外，環(huán)二肽還可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)調(diào)節(jié)功能。已知cyclo(Gly-Pro)(CGP)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有良好作用，包括抗健忘、促進(jìn)記憶作用[53]，神經(jīng)保護(hù)作用[54]。Kaneko等[55]對(duì)口服CGP促進(jìn)大鼠中風(fēng)模型的任務(wù)學(xué)習(xí)展開(kāi)研究。已知達(dá)到學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)所需天數(shù)的主要影響因素可能是病變區(qū)的大小。而且腦室下區(qū)(subventricular zone，SVZ)神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量的增加被認(rèn)為是皮質(zhì)損傷后新神經(jīng)元的來(lái)源。在該實(shí)驗(yàn)中，他們監(jiān)測(cè)到大鼠在口服CGP后損傷體積減小，干細(xì)胞數(shù)量增加。低CGP組大鼠學(xué)會(huì)任務(wù)的所需時(shí)間更短。據(jù)研究表明[56]：大多數(shù)內(nèi)源性IGF-1與IGFBP-3結(jié)合，少部分游離的IGF-1通過(guò)與IGF-1R結(jié)合，影響神經(jīng)元生長(zhǎng)、存活和生長(zhǎng)。CGP可以通過(guò)與內(nèi)源性IGF-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IGFBP-3來(lái)調(diào)節(jié)游離的IGF-1。他們認(rèn)為是因?yàn)橥庠葱訡GP的添加調(diào)節(jié)了IGF-1的量。損傷區(qū)域附近的IGF-1濃度增加，促進(jìn)了學(xué)習(xí)。該報(bào)道首次闡述了口服最佳劑量的CGP可通過(guò)神經(jīng)可塑性和網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)的方式，促進(jìn)局灶性缺血性梗死大鼠的感覺(jué)-運(yùn)動(dòng)聯(lián)想學(xué)習(xí)，而非通過(guò)神經(jīng)保護(hù)作用。該研究結(jié)果提示CGP給藥有望成為加速腦損傷修復(fù)的策略[55]。
4 總結(jié)和展望
綜上所述，環(huán)二肽的生物活性不僅限于抗菌、抗腫瘤，還包括影響抗氧化、降血糖、加速腦損傷修復(fù)等作用�，F(xiàn)在的科學(xué)技術(shù)越來(lái)越發(fā)達(dá)，我們能夠更容易地提取出環(huán)二肽類化合物，也能更容易合成環(huán)二肽類化合物，環(huán)二肽是環(huán)肽類化合物里最小，最簡(jiǎn)單的環(huán)肽化合物，也是最有特點(diǎn)的化合物。本課題組在對(duì)20余種化學(xué)合成的環(huán)二肽樣品進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)幾種對(duì)NIH-3T3細(xì)胞生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用的活性結(jié)構(gòu)。由此可見(jiàn)，通過(guò)合理設(shè)計(jì)與化學(xué)合成有望開(kāi)發(fā)出新型功能環(huán)二肽。
根據(jù)最新的文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)總結(jié)了多種環(huán)二肽的生理活性，它們可以作為信息分子參與細(xì)胞間信息傳遞，也可以抗腫瘤、抑菌、抗氧化、降血糖和提高心血管系統(tǒng)能力等，如表1所示等。綜上所述，希望加強(qiáng)環(huán)二肽的生物學(xué)活性和藥理價(jià)值方面的研究，更加充分地了解它的特性，發(fā)掘它在抗菌、抗腫瘤藥物研發(fā)、農(nóng)業(yè)應(yīng)用等方面更大的潛力，創(chuàng)造出更大的應(yīng)用價(jià)值。
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