谷胱甘肽(GSH)是一種具有重要生理功能的活性三肽,結(jié)構(gòu)中的巰基(—SH)易被氧化脫氫。因此,GSH不僅可以清除體內(nèi)氧自由基及其他自由基,還能與重金屬離子、多種化學(xué)物質(zhì)及其代謝物結(jié)合,并促進(jìn)其排出體外,幫助體內(nèi)保持正常免疫系統(tǒng)的功能[1⇓~3]。GSH在人體血液中的含量為26~34 mg/100 g,過(guò)量會(huì)引起如阿爾茨海默癥、沃納綜合癥、帕金森癥、癌癥及心臟疾病等疾病;缺乏則會(huì)造成發(fā)育緩慢、脫發(fā)、嗜睡、牛皮癬、肝損害、肌肉和脂肪減少等問(wèn)題[4,5]。因此,實(shí)時(shí)、精準(zhǔn)地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH的含量對(duì)于臨床診斷、疾病治療、病原體檢測(cè)意義重大。
目前,檢測(cè)GSH的方法[6⇓⇓⇓~10]有高效液相色譜法、電化學(xué)法、比色法、熒光分析法等,其中基于熒光探針的熒光分析法[11]靈敏度高、響應(yīng)速度快、選擇性好且可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),成為檢測(cè)GSH領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),并廣泛用于生物體內(nèi)定性或定量檢測(cè)。
基于GSH上—SH的強(qiáng)親核性、還原性以及對(duì)金屬離子高親和力的獨(dú)特性質(zhì),運(yùn)用[12⇓⇓~15]邁克爾加成反應(yīng)、親核取代、還原反應(yīng)以及硫醇誘導(dǎo)的2,4-二硝基苯磺�；�(DNBS)的斷裂反應(yīng)與絡(luò)合反應(yīng)對(duì)GSH進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)機(jī)理[16]主要基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、電子傳遞(ET)、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)、激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)及內(nèi)濾熒光效應(yīng)(IFE)。為進(jìn)一步從分子結(jié)構(gòu)上認(rèn)識(shí)、了解GSH熒光探針,從有機(jī)小分子熒光探針和無(wú)機(jī)納米熒光探針的角度對(duì)GSH熒光探針進(jìn)行概括和總結(jié)。重點(diǎn)討論了12種熒光團(tuán)[16⇓~18]對(duì)探針的熒光性能和生物應(yīng)用的影響,并分析了GSH響應(yīng)機(jī)制。
2 檢測(cè)GSH的有機(jī)小分子熒光探針
可用于檢測(cè)GSH的有機(jī)小分子熒光探針可分為香豆素類(lèi)、BODIPY類(lèi)、羅丹明類(lèi)、花菁類(lèi)、苯并噻唑類(lèi)、萘酰亞胺類(lèi)、金屬有機(jī)骨架類(lèi)以及其他有機(jī)熒光探針。
2.1 用于GSH檢測(cè)的香豆素類(lèi)熒光探針
作為一種內(nèi)酯化合物,香豆素具有熒光量子產(chǎn)率高、Stokes位移大、光學(xué)性能好、結(jié)構(gòu)易修飾等優(yōu)點(diǎn),是設(shè)計(jì)合成特異性檢測(cè)GSH熒光探針的理想底物,相比于傳統(tǒng)熒光探針基于非共價(jià)鍵的超分子相互作用,香豆素類(lèi)熒光探針多屬于反應(yīng)型探針,其識(shí)別過(guò)程主要是與GSH發(fā)生不同類(lèi)型的反應(yīng),生成具有熒光性質(zhì)的化合物,進(jìn)而使熒光探針的光學(xué)信號(hào)發(fā)生改變,最終實(shí)現(xiàn)對(duì)GSH的靈敏檢測(cè)[19]。
2.1.1 基于邁克爾加成的香豆素類(lèi)熒光探針
香豆素類(lèi)探針具有吸電子基團(tuán),易被GSH中親核的硫陰離子(GS-)攻擊。最終,α和β碳原子之間的雙鍵被打破,完成邁克爾加成�；谏鲜鰴C(jī)理,設(shè)計(jì)了許多基于邁克爾加成的香豆素類(lèi)熒光探針(圖1)。
可逆熒光探針有利于定量、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中GSH的變化。Chen等[20]設(shè)計(jì)出一種可逆的香豆素類(lèi)探針G-1。GSH的—SH與探針的馬來(lái)酰亞胺進(jìn)行邁克爾加成(圖2),從而使489 nm處熒光增強(qiáng)。G-1檢測(cè)限為760 nmol·L-1,成功應(yīng)用于L929細(xì)胞和HeLa細(xì)胞內(nèi)GSH成像。
比率探針通過(guò)內(nèi)置校正可提高檢測(cè)GSH的精度。Khatun等[21]合成了一種以香豆素為主體的比率熒光探針G-2。G-2與GSH發(fā)生邁克爾加成反應(yīng),阻斷了與吡啶部分π共軛的擴(kuò)展,使得熒光顏色由綠變藍(lán)(圖3)。隨著GSH濃度的增加,F460/F510的熒光強(qiáng)度比值呈線性上升趨勢(shì),檢測(cè)限為245 nmol·L-1。G-2可定位進(jìn)入GSH缺失的細(xì)胞器(如核仁、線粒體和溶酶體),應(yīng)用于追蹤細(xì)胞周期過(guò)程中GSH。Tian等[22]則合成了比率熒光探針G-3。G-3與GSH發(fā)生邁克爾加成反應(yīng),使GSH的共軛降低,導(dǎo)致吸收峰藍(lán)移,發(fā)出綠色熒光(圖3)。隨著GSH的增加,G-3熒光強(qiáng)度比值F488/F405 呈上升趨勢(shì),對(duì)GSH的檢測(cè)限為50 mmol·L-1。G-3成功應(yīng)用于不同的活細(xì)胞中GSH水平的比率成像。
2.1.2 基于親核取代的香豆素類(lèi)熒光探針
GSH分子中—SH易與吸電子基團(tuán)鹵素發(fā)生親核取代反應(yīng)。許多研究者利用這一反應(yīng)在香豆素?zé)晒鈭F(tuán)上引入鹵素原子,通過(guò)GSH與鹵素原子之間的取代反應(yīng),達(dá)到熒光轉(zhuǎn)換效果(圖4)。
增加探針與GSH中—SH和—NH2的反應(yīng)位點(diǎn)可以提高檢測(cè)GSH的靈敏度。Li等[23]首先在香豆素的3位引入α,β-不飽和丙二腈,4位引入一個(gè)氯原子,制得探針G-4,由于分子內(nèi)存在吸電子基團(tuán)導(dǎo)致探針熒光猝滅。GSH的—SH取代探針G-4的氯原子,—NH2與丙二腈發(fā)生環(huán)化反應(yīng),ICT過(guò)程受到抑制,G-4熒光恢復(fù),發(fā)射黃色熒光(圖5),對(duì)GSH檢測(cè)限為0.43 μmol·L-1。該探針可用于人宮頸癌細(xì)胞水平GSH成像�；谕瑯拥脑O(shè)計(jì)策略,通過(guò)將氯化香豆素和苯并噻唑乙腈結(jié)合,Yin等[24]開(kāi)發(fā)了新型熒光探針G-5。探針的香豆素部分中4位的氯原子與—SH進(jìn)行鹵素取代。在氰基的影響下,具有不飽和鍵的苯并噻唑部分可作為另一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)與—NH2發(fā)生分子環(huán)合(圖5)。G-5的檢測(cè)限為6.9 nmol·L-1。G-5成功應(yīng)用于外源性活細(xì)胞GSH的熒光成像。
臨床研究表明,喉癌腫瘤細(xì)胞中GSH水平明顯高于正常或瘤周組織,但目前熒光探針在臨床標(biāo)本上的應(yīng)用仍然很少。基于此,Zou等[25]設(shè)計(jì)了一種基于香豆素衍生物的雙光子熒光探針G-6。由于溴原子的重原子效應(yīng),探針G-6是無(wú)熒光的。在GSH存在下,溴化的部分可以被—SH親核取代,并伴有強(qiáng)的熒光發(fā)射現(xiàn)象(圖6)。該探針的熒光強(qiáng)度與GSH濃度(0~15 mmol·L-1)呈良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限為90 μmol·L-1。G-6成功地區(qū)分了喉癌組織和正常組織,可用于檢測(cè)活細(xì)胞、小鼠模型和人類(lèi)臨床癌癥組織中的GSH。
Yang等[26]以香豆素和半氰胺為原料合成了一種近紅外熒光探針G-7。該探針與GSH在反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生了親核取代和分子內(nèi)環(huán)化兩個(gè)過(guò)程(圖7)。隨著GSH的加入,G-7通過(guò)紅光發(fā)射在A375細(xì)胞中對(duì)內(nèi)源性GSH進(jìn)行生物成像。
2.1.3 基于脫金屬反應(yīng)的香豆素類(lèi)熒光探針
該類(lèi)香豆素?zé)晒馓结樢蚺c金屬離子配位,發(fā)生PET或者配體-金屬電荷轉(zhuǎn)移(LMCT)導(dǎo)致熒光猝滅。而GSH分子中—SH與金屬離子有更強(qiáng)的絡(luò)合能力,可與該絡(luò)合物發(fā)生脫金屬反應(yīng),形成GSH-金屬絡(luò)合物,使得熒光恢復(fù)(圖8)。
席夫堿制備簡(jiǎn)便,其結(jié)構(gòu)上的亞氨/烷亞氨基使得探針與金屬離子的配位能力增強(qiáng)。He等[27]基于席夫堿易配位特性,選取香豆素酰肼和2, 6-吡啶二甲醛為原料合成雙席夫堿香豆素探針G-8。G-8本身具有較強(qiáng)的熒光,與Cu2+配位后,由于順磁性和光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移,探針熒光猝滅。加入GSH后,發(fā)生脫金屬反應(yīng)(圖9),從而使485 nm處的熒光恢復(fù)。該探針可應(yīng)用于熒光成像并特異性檢測(cè)人宮頸癌細(xì)胞中的GSH。He等[28]以香豆素酰肼和咪唑-2-甲醛為原料設(shè)計(jì)并制備了一種新型熒光探針G-9。Cu2+與G-9絡(luò)合,使得G-9的吸電子能力增強(qiáng)。兩者相互作用提供了一個(gè)額外的熒光猝滅通路。激子能量從配體轉(zhuǎn)移到金屬d軌道或者發(fā)生了LMCT,從而導(dǎo)致G-9的熒光猝滅。由于GSH從G-9-Cu2+中捕獲銅金屬離子的能力較強(qiáng),G-9-Cu2+去蝕,釋放G-9,熒光恢復(fù)(圖9)。G-9-Cu2+對(duì)GSH的檢測(cè)限為0.12 μmol·L-1。該探針可用于生理?xiàng)l件下內(nèi)源性GSH的檢測(cè),為GSH的生物分子檢測(cè)提供了一種新方法。
2.2 用于檢測(cè)GSH的BODIPY類(lèi)熒光探針
BODIPY是一類(lèi)重要的有機(jī)熒光染料,其分子結(jié)構(gòu)易于改性便于修飾,并具有量子產(chǎn)率高、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)。修飾后的BODIPY類(lèi)熒光探針利用自身復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu),可達(dá)到檢測(cè)GSH的目的。
2.2.1 基于芳環(huán)取代的BODIPY類(lèi)熒光探針
含不穩(wěn)定取代基的熒光團(tuán)易與GSH發(fā)生親核取代反應(yīng)生成硫醚(圖10)。
Liu等[29]在BODIPY上引入氯原子,設(shè)計(jì)了熒光探針G-10。氯原子可與GSH上的—SH發(fā)生芳環(huán)親核取代反應(yīng)得到硫醚(圖11),使得557 nm處熒光強(qiáng)度降低,588 nm處熒光強(qiáng)度增加,對(duì)GSH的檢測(cè)限為1.1 μmol·L-1。通過(guò)在探針5位上引入帶正電荷的三苯基膦官能團(tuán),可作為線粒體遞送載體,利用靜電引力將探針傳送到線粒體。除此之外,該探針可用于人宮頸癌細(xì)胞外源性GSH成像。
氮雜-BODIPY的發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng),有利于深入體內(nèi),在分子成像過(guò)程中對(duì)生物樣品的損傷較小。Xiang等[30]報(bào)道了一種含有兩個(gè)7-硝基苯并-2-氧雜-1, 3-二唑(NBD)基團(tuán)的BODIPY近紅外探針G-11。NBD不僅是GSH誘導(dǎo)的親核取代反應(yīng)的離去基團(tuán),還可通過(guò)PET過(guò)程促使熒光探針猝滅。G-11中的NBD被GSH的-SG取代,產(chǎn)生硫-NBD和氮雜-BODIPY,并在730 nm處釋放紅色熒光(圖12)。G-11可用于檢測(cè)人宮頸癌細(xì)胞中的GSH。
BODIPY 3號(hào)位上取代基的推拉電子能力會(huì)影響親核芳香取代反應(yīng)的活性。Chen等[31]將3,4-氨基苯酚引入氯化的BODIPY中,開(kāi)發(fā)了熒光探針G-12。附著在BODIPY核上的苯酚衍生物通過(guò)芳香親核取代與GSH發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生紅色熒光(圖13)。探針的熒光強(qiáng)度與GSH(0~100 μmol·L-1)濃度存在良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限為56 nmol·L-1。該探針可在RAW 264.7細(xì)胞中誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)中明顯觀察到GSH升高,成功檢測(cè)了巨噬細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性的GSH。
2.2.2 以—SH切斷思路為設(shè)計(jì)策略的BODIPY類(lèi)熒光探針
通過(guò)—SH消除探針?lè)肿又械墓矁r(jià)連接,達(dá)到熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換的效果,也是設(shè)計(jì)GSH探針的好策略 (圖14)。
基于熒光猝滅基團(tuán)DNBS被—SH切斷后探針熒光恢復(fù)的研究思路,Wang等[32]設(shè)計(jì)合成了一種含有DNBS且以BODIPY為母核的探針G-13。探針中的DNBS被GSH的—SH切斷,在582 nm處產(chǎn)生橙色熒光(圖15)。探針能夠快速進(jìn)入人宮頸癌細(xì)胞,高度選擇性檢測(cè)出細(xì)胞內(nèi)GSH。
Liu等[33]將香豆素作為一種內(nèi)標(biāo)熒光團(tuán),利用芳環(huán)上的親核取代反應(yīng),通過(guò)共價(jià)連接氯代BODIPY和香豆素,合成了熒光探針G-14。G-14具有綠色熒光,GSH上的—SH切斷香豆素與BODIPY的共價(jià)連接后得到香豆素及對(duì)應(yīng)的BODIPY衍生物。香豆素部分在453 nm處產(chǎn)生藍(lán)色熒光,GSH取代的BODIPY衍生物在558 nm處產(chǎn)生黃色熒光。加入過(guò)量的GSH則形成二取代BODIPY衍生物,在588 nm處發(fā)出粉色熒光(圖16)。該探針對(duì)GSH的檢測(cè)限為1.07 μmol·L-1,可用于人宮頸癌細(xì)胞中外源性GSH的成像研究。
2.3 可用于檢測(cè)GSH的羅丹明類(lèi)熒光探針
羅丹明是一種呫噸類(lèi)熒光染料,其衍生物螺環(huán)打開(kāi)會(huì)引起熒光“開(kāi)關(guān)”現(xiàn)象,同時(shí)伴隨熒光顏色變化(圖17)。用于特異性檢測(cè)GSH一直是羅丹明類(lèi)探針研究的熱點(diǎn)。
在底環(huán)上引入親水基團(tuán)可以改善羅丹明類(lèi)熒光探針?biāo)苄圆畹奶攸c(diǎn),Ouyang等[34]以偏苯三酸酐為原料合成了含羧基的羅丹明探針G-15。當(dāng)GSH中的—SH與羅丹明醛基加成時(shí),開(kāi)環(huán)水解成具有熒光的羅丹明衍生物,576 nm處熒光強(qiáng)度顯著增加,裸眼觀察溶液顏色由無(wú)色變成粉色(圖18),對(duì)GSH的檢測(cè)限為27 nmol·L-1。探針G-15可用于檢測(cè)人宮頸癌細(xì)胞水平上的GSH。
Chen等[35]研制了一種基于羅丹明的熒光探針G-16。結(jié)構(gòu)中螺旋體的內(nèi)酰胺環(huán)破壞了羅丹明熒光團(tuán)的共軛,使得G-16沒(méi)有熒光。GSH與環(huán)溴酰胺基團(tuán)發(fā)生親核取代,促進(jìn)螺旋體內(nèi)酯開(kāi)環(huán),釋放出羅丹明發(fā)色團(tuán),熒光顏色從無(wú)色變?yōu)榉凵?圖19)。G-16的熒光強(qiáng)度與GSH濃度(5~50 μmol·L-1)呈良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限為0.17 μmol·L-1。G-16可用來(lái)監(jiān)測(cè)氧化劑引起的GSH的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。
近紅外熒光發(fā)射探針具有強(qiáng)組織穿透性、低自發(fā)熒光干擾等優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)越來(lái)越受到關(guān)注。Tong等[36]設(shè)計(jì)并合成了一種基于共軛加成和分子內(nèi)氨基誘導(dǎo)螺旋體內(nèi)酰胺開(kāi)環(huán)的新型GSH近紅外探針G-17。GSH中的-SH與G-17中的醛基發(fā)生加成反應(yīng),生成不穩(wěn)定的中間體。然后,羅丹明的羰基與GSH的—NH2基團(tuán)發(fā)生反應(yīng),誘導(dǎo)羅丹明內(nèi)酰胺開(kāi)環(huán),熒光顏色由黃色變?yōu)榫G色(圖20),檢測(cè)限為0.1 μmol·L-1。G-17可應(yīng)用于MCF-7細(xì)胞內(nèi)源性和外源性GSH成像,是一種快速有效的檢測(cè)活細(xì)胞中過(guò)量GSH的方法。Yang等[37]也設(shè)計(jì)并合成了一種近紅外熒光探針G-18。G-18由于羅丹明部分的螺旋體內(nèi)酰胺環(huán)而沒(méi)有熒光。加入GSH后,氫離子與GSH的羧基相互作用,形成不穩(wěn)定的中間體。由于羅丹明部分與帶負(fù)電荷的羧酸基團(tuán)之間的距離減小,產(chǎn)生一個(gè)高酸性的微環(huán)境,從而使得羅丹明的螺旋環(huán)部分打開(kāi),熒光開(kāi)啟,發(fā)出明亮的紅色熒光(圖20)。在GSH濃度1~3 μmol·L-1的范圍內(nèi),探針與其有良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限為70 nmol·L-1。該探針已成功地應(yīng)用于血清中GSH的測(cè)定和低細(xì)胞毒性活細(xì)胞中GSH的生物成像。
2.4 用于檢測(cè)GSH的花菁類(lèi)熒光探針
花菁類(lèi)熒光探針的熒光母核為花菁染料(花菁染料、半花菁染料、Oxonol染料)。這類(lèi)探針含有季銨鹽陽(yáng)離子,具有很好的親和力并能夠有效富集于線粒體中。此外,合成步驟簡(jiǎn)便、背景干擾小、量子產(chǎn)率高。因此,研究與拓展該類(lèi)探針具有現(xiàn)實(shí)意義。探針的硫醚鍵是GSH識(shí)別位點(diǎn),發(fā)生親核反應(yīng),生成硫醚化合物,并伴隨熒光變化(圖21)。
Lee等[38]以花菁為母體,開(kāi)發(fā)了兩例熒光增強(qiáng)型探針G-19、G-20。探針G-19通過(guò)苯硫醚鍵連接兩個(gè)花菁單元,導(dǎo)致探針自猝滅。探針G-20含有3,5-二(三氟甲基)苯硫醚基團(tuán),花菁部分與3,5-二(三氟甲基)苯硫醚發(fā)生PET而使探針無(wú)熒光。GSH切斷G-19和G-20的硫醚鍵,導(dǎo)致兩個(gè)近紅外探針在805 nm處熒光顯著增強(qiáng)(圖22)。探針G-19、G-20對(duì)GSH的檢測(cè)限分別為0.63 和0.33 μmol·L-1。它們可用于SCC7荷瘤小鼠內(nèi)GSH的熒光檢測(cè)與成像。
Lin等[39]通過(guò)醚鍵將羥基苯并噻唑茂菁(HBTMC)和NBD連接,制成了熒光探針G-21。G-21自身無(wú)熒光。GSH與探針發(fā)生親核取代反應(yīng),609 nm處紅色熒光增強(qiáng)(圖23)。該探針可用于在細(xì)胞水平上GSH的熒光檢測(cè)。
2.5 用于檢測(cè)GSH的苯并噻唑類(lèi)熒光探針
與經(jīng)典的熒光機(jī)制(PET、ICT和FRET)相比,ESIPT有大Stokes位移和高環(huán)境敏感性,更具吸引力。而2-(苯并噻唑-2-基)苯酚衍生物具有光穩(wěn)定性?xún)?yōu)異、熒光量子產(chǎn)率高、細(xì)胞膜通透性好等優(yōu)點(diǎn),因此可將其從苯酚形式轉(zhuǎn)化為酮式的ESIPT過(guò)程作為設(shè)計(jì)策略,開(kāi)發(fā)檢測(cè)GSH的熒光探針(圖24)。
Chen等[40]合成了一例大Stokes位移(202 nm)的聯(lián)苯基苯并噻唑衍生物探針G-22。將DNBS作為識(shí)別基團(tuán)及電子受體,其與羥基苯并噻唑(HBT)部分的PET抑制了HBT分子內(nèi)部ESIPT,致使探針熒光猝滅。當(dāng)GSH與探針?lè)磻?yīng)時(shí),DNBS與苯并噻唑衍生物間的PET被阻斷,生成的4-羥基-3-(苯并噻唑-2-基)-4-聯(lián)苯基腈產(chǎn)生分子內(nèi)ESIPT,熒光開(kāi)啟發(fā)出強(qiáng)烈的青色熒光(圖25),對(duì)GSH的檢測(cè)限為0.17 μmol·L-1。Zheng等[41]開(kāi)發(fā)了熒光探針G-23用于跟蹤GSH。G-23沒(méi)有熒光。加入GSH后,形成了G-23-OH,發(fā)生ESIPT,顯示了一個(gè)大的Stokes位移,探針發(fā)出綠色熒光(圖25)。探針對(duì)GSH(0~1 mmol·L-1)檢測(cè)限為330 nmol·L-1。G-23可應(yīng)用于活細(xì)胞和斑馬魚(yú)內(nèi)源性GSH的成像。
Zhang等[42]基于HBT合成了一種新穎的單激發(fā)雙發(fā)射熒光探針G-24。GSH與探針先發(fā)生邁克爾加成和酯裂解反應(yīng),后發(fā)生ESIPT,探針的顏色從無(wú)色變?yōu)闇\藍(lán)色(圖26)。該探針對(duì)GSH的檢測(cè)限為0.24 μmol·L-1。G-24為利用化學(xué)反應(yīng)和分子間弱相互作用制備多選擇性探針提供了新的途徑。
2.6 用于檢測(cè)GSH的萘酰亞胺類(lèi)熒光探針
萘酰亞胺衍生物具有共軛體系較大、含強(qiáng)給電子基團(tuán)等特點(diǎn)。在萘酰亞胺4位引入給電子基團(tuán),它的共軛體系改變,形成分子內(nèi)具有供-吸電子電荷轉(zhuǎn)移的化合物,這種化合物往往能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光。該類(lèi)探針具有亞砜基團(tuán),GSH常以其為識(shí)別位點(diǎn),發(fā)生芳香親核反應(yīng),生成硫醚化合物(圖27)。
Liu等[43]先后開(kāi)發(fā)了兩例GSH熒光探針G-25、G-26。G-25熒光團(tuán)上接有非氧化態(tài)的嗎啉基,是一種開(kāi)關(guān)型熒光探針,初始態(tài)無(wú)熒光。G-26則是以?xún)蓚�(gè)氧化嗎啉(硫代嗎啉-S-二氧化物和嗎啉-N-氧化物)為功能基團(tuán),探針呈藍(lán)色熒光。GSH與兩例探針的磺酰胺發(fā)生取代反應(yīng)后得到相同產(chǎn)物,在495 nm處發(fā)出綠色熒光(圖28)。探針可用于檢測(cè)溶酶體中的GSH。
雙光子探針通常采用雙熒光團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)結(jié)合來(lái)設(shè)計(jì)探針結(jié)構(gòu),利用這類(lèi)探針進(jìn)行細(xì)胞成像具有更低的光毒性、更好的三維空間定位、更深的穿透深度和更低的自身吸收的優(yōu)點(diǎn)。Xu等[44]設(shè)計(jì)了熒光探針G-27。GSH通過(guò)芳香親核取代機(jī)制攻擊G-27,親核取代產(chǎn)物產(chǎn)生綠色發(fā)射,裂解產(chǎn)物產(chǎn)生橙色發(fā)射(圖29)。在加入GSH(2~150 μmol·L-1)后,探針在495 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增大,呈良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限為0.10 μmol·L-1。該探針成功地應(yīng)用于雙色熒光成像,檢測(cè)活細(xì)胞中的GSH。
為探索活細(xì)胞中決定探針靈敏度的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)因素,Zong等[45]合成了以亞砜基為識(shí)別基團(tuán)的GSH超靈敏探針G-28。加入GSH后,—SH攻擊探針中的亞硫酰基,發(fā)生親核取代(圖30)。G-28的熒光強(qiáng)度對(duì)GSH的響應(yīng)呈單指數(shù)增長(zhǎng),對(duì)GSH(0~500 mmol·L-1)的檢測(cè)限為0.11 mmol·L-1。G-28可追蹤發(fā)育神經(jīng)元中GSH水平的細(xì)微波動(dòng),對(duì)發(fā)育中神經(jīng)元的GSH通量進(jìn)行生物成像。
2.7 用于檢測(cè)GSH的金屬有機(jī)骨架熒光類(lèi)探針
金屬有機(jī)骨架材料(MOFs)通常是一系列由金屬離子或金屬團(tuán)簇與有機(jī)配體(通常含有羧酸、氮、硫)有序排列并通過(guò)配位鍵連接的多孔骨架結(jié)構(gòu)材料。與有機(jī)分子不同,MOFs中由金屬離子或金屬團(tuán)簇和有機(jī)配體形成的剛性框架可以將配體與金屬中心節(jié)點(diǎn)分離,增強(qiáng)熒光,減少自猝滅。此外,由于其可調(diào)的多孔結(jié)構(gòu),基于MOFs的傳感器比其他熒光傳感器更靈敏。目前,MOFs已被深入開(kāi)發(fā)用于構(gòu)建熒光化學(xué)傳感器,將該新型材料用于GSH檢測(cè)也有一定優(yōu)勢(shì)。
UiO-67具有優(yōu)異的光學(xué)性能,GSH可以通過(guò)與配體之間的電子效應(yīng)有效增強(qiáng)UiO-67的熒光,從而實(shí)現(xiàn)GSH識(shí)別。基于上述原理,Zhu等[46]制備了以UiO-67為骨架的熒光探針G-29,因?yàn)榕潴w(4,4'-二苯乙烯甲酸)具有共軛結(jié)構(gòu)導(dǎo)致G-29具有熒光。
當(dāng)GSH接近配體時(shí),GSH的供電子基團(tuán)(肽鍵和—SH)會(huì)增加共軛結(jié)構(gòu)的電子密度,從而增強(qiáng)配體的共軛度,增強(qiáng)溶液熒光(圖31)。G-29的熒光強(qiáng)度與GSH濃度(0.5~10 mmol·L-1)有良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限為97.5 μmol·L-1。G-29有望作為臨床醫(yī)學(xué)的診斷工具。
Wang等[47]利用UiO-66-NH2,建立了比率熒光探針G-30。多巴胺在聚乙烯亞胺(PEI)溶液中自氧化形成共聚物(PDA-PEI)。PDA-PEI通過(guò)FRET使G-30的熒光猝滅。由于GSH的還原性,阻止了PDA-PEI的形成,并且可以恢復(fù)G-30的熒光(圖32)。探針對(duì)GSH(1~70 μmol·L-1)的檢測(cè)限為0.57 μmol·L-1。該探針應(yīng)用于人血清樣品中的GSH檢測(cè)。
Jalili等[48]利用咪唑沸石框架(ZIF-8)將黃色和藍(lán)色碳點(diǎn)封裝在內(nèi),制備了一種雙發(fā)射金屬有機(jī)框架G-31。在Cu2+的存在下,G-31中黃色碳點(diǎn)的熒光增強(qiáng),而藍(lán)色碳點(diǎn)的熒光猝滅。在Cu2+-G-31體系中加入GSH后,由于GSH與Cu2+的強(qiáng)烈相互作用,兩個(gè)碳點(diǎn)的熒光逐漸恢復(fù) (圖33)。在紫外線照射下,可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化達(dá)到檢測(cè)目的。G-31對(duì)GSH的檢測(cè)范圍為3~25 nmol·L-1,檢測(cè)限為0.90 nmol·L-1。
2.8 用于檢測(cè)GSH的其他有機(jī)熒光類(lèi)探針
由聚集引起的猝滅效應(yīng)(ACQ)會(huì)限制探針在體內(nèi)的使用,所以開(kāi)發(fā)抗ACQ效應(yīng)的GSH型熒光探針具有很大的意義。Cui等[49]設(shè)計(jì)了一種具有扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)和聚集增強(qiáng)發(fā)射特性(AIE),含三苯基乙烷的喹口惡啉吡啶化合物G-32。GSH將G-32結(jié)構(gòu)中的二硝基苯基醚裂解,產(chǎn)物具有AIE活性且水溶性較低,從而在516 nm左右開(kāi)啟了熒光,顏色由橙色變?yōu)榫G色(圖34)。探針的熒光強(qiáng)度與GSH濃度(0~10 μmol·L-1)呈良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限為434 nmol·L-1。G-32成功地檢測(cè)了牛血清樣品中的GSH。此外,還可以通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)HeLa細(xì)胞中的GSH。
咪唑[1,5-α]吡啶具有出色的光學(xué)特性,如強(qiáng)光穩(wěn)定性、高量子產(chǎn)率和大Stokes位移。Hou等[50]擴(kuò)展了咪唑[1,5]吡啶的共軛體系,合成了一種新的熒光探針G-33。由于ICT,電荷從咪唑[1,5]吡啶部分轉(zhuǎn)移到呋喃部分,G-33產(chǎn)生紅色熒光。GSH與G-33中碳碳雙鍵部分發(fā)生邁克爾加成,抑制ICT,G-33的熒光顏色從紅色變?yōu)榍嗌?圖35)。G-33對(duì)GSH(0~30 μmol·L-1)的檢測(cè)限為97 nmol·L-1。該探針成功地用于MCF-7細(xì)胞和斑馬魚(yú)內(nèi)源性GSH的成像,是研究?jī)?nèi)源性GSH的強(qiáng)有力的分子工具。
卟啉是一類(lèi)天然存在的大環(huán)化合物,在活生物體代謝中起重要作用。由于特殊的光電特性,如強(qiáng)吸光度、高發(fā)射率和豐富的化學(xué)性質(zhì),卟啉已廣泛應(yīng)用于UV-vis傳感器、光電化學(xué)傳感器(PEC)和電化學(xué)發(fā)光。Chen等[51]制備了一例基于5,10,15,20-(4-磺基苯基)卟啉(TPPS4)-Hg2+的裸眼可視“開(kāi)關(guān)”型熒光探針G-34。在Hg2+存在下,電子給體氮原子的孤對(duì)電子轉(zhuǎn)移到Hg2+的空軌道上,形成復(fù)合物,從而導(dǎo)致G-34的熒光猝滅。加入GSH后,GSH對(duì)Hg2+的親和力比卟啉環(huán)的N原子強(qiáng),使得探針轉(zhuǎn)為“開(kāi)”狀態(tài),熒光顏色變?yōu)榉凵�。�?40 nm和700 nm處,探針對(duì)GSH(0~28.5 μmol·L-1、38.15~61.87 μmol·L-1)的裸眼檢測(cè)限為0.43 nmol·L-1。
GSH中的—SH具有還原性,可使探針?lè)肿又械亩蜴I斷裂,從而熒光恢復(fù)/增強(qiáng)(圖36)�；诙蜴I-硫醇交換反應(yīng),設(shè)計(jì)了下列兩種探針(圖37、38)。
Hu等[52]合成了基于AMC的席夫堿熒光探針G-35。探針的自身熒光來(lái)自n-π*誘導(dǎo)的席夫堿中兩個(gè)碳氮鍵的傳遞。GSH對(duì)二硫鍵響應(yīng),通過(guò)硫醇-二硫鍵交換反應(yīng)裂解成—SH,從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的增加(圖37)。該探針對(duì)GSH的檢測(cè)限為36 μmol·L-1。G-35可在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行GSH成像。
方形素(SQ)是典型的近紅外染料,Zheng等[53]建立了一種基于方形素的新型近紅外自猝滅探針G-36。G-36由兩個(gè)SQ熒光團(tuán)通過(guò)二硫鍵連接而成,由于ACQ增強(qiáng)和FRET介導(dǎo)的自猝滅效應(yīng),背景熒光強(qiáng)度很弱。GSH通過(guò)分子間氫鍵和特定的靜電相互作用選擇性裂解G-36的二硫鍵連接物,中斷兩個(gè)SQ熒光團(tuán)之間的熒光自猝滅效應(yīng)(圖38)。該探針檢測(cè)限為0.15 μmol·L-1。G-36可以監(jiān)測(cè)腫瘤或正常細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性和外源性GSH。
3 檢測(cè)GSH的無(wú)機(jī)納米熒光探針
目前用于檢測(cè)GSH的有機(jī)熒光探針普遍具有水溶性較差的缺點(diǎn),而設(shè)計(jì)的無(wú)機(jī)熒光探針,如半導(dǎo)體量子點(diǎn)(QDs)、碳點(diǎn)(CDs)、金屬納米簇(NCs)等則具有較好的水溶性。該類(lèi)熒光探針大多基于熒光的猝滅與恢復(fù)的原理來(lái)檢測(cè)GSH。
3.1 用于檢測(cè)GSH的半導(dǎo)體量子點(diǎn)
QDs是指由半導(dǎo)體材料合成的尺寸在0~100 nm的微小顆粒,主要由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成。由于其優(yōu)良的光學(xué)性能,可用于對(duì)GSH的特異性檢測(cè)。
基于晶體紫(CV)功能化QDs可以方便、快速、低成本地檢測(cè)GSH。Sheng等[54]制備了一例水溶性巰基丙酸(MPA)封端的QDs與CV混合的納米熒光探針G-37,CV的N+和MPA的—COO-之間因靜電相互作用產(chǎn)生FRET使探針發(fā)生熒光猝滅。由于GSH與Cd2+結(jié)合能力比MPA強(qiáng),使MPA攜帶CV從QDs的表面解離下來(lái),QDs的熒光恢復(fù)(圖39)。在550 nm處,G-37的熒光強(qiáng)度與GSH濃度(0.02~50 μmol·L-1)呈良好線性關(guān)系,對(duì)GSH的檢測(cè)限為8.2 nmol·L-1。探針G-37為快速測(cè)定水樣和尿樣中GSH提供了新思路。
在含金屬的QDs中,ZnS的化學(xué)毒性相對(duì)較小。ZnS QDs作為一種生態(tài)友好型熒光探針,化學(xué)穩(wěn)定性高,在熒光化學(xué)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。Amouzegar等[55]以此為設(shè)計(jì)策略合成了一種MPA包封的探針G-38。加入Zn2+后,生成Zn(OH ,并在量子點(diǎn)表面形成了鈍化層,導(dǎo)致量子點(diǎn)的熒光增強(qiáng)。在Zn2+-G-38中加入GSH后,GSH能與Zn2+形成配合物,導(dǎo)致Zn(OH 裂解,量子點(diǎn)鈍化層被破壞,從而熒光強(qiáng)度降低(圖40)。GSH檢測(cè)范圍為1.95~104.0 μmol·L-1,檢測(cè)限為0.92 μmol·L-1。
對(duì)QDs表面進(jìn)行改性可開(kāi)發(fā)出敏感和生物相容性良好的熒光探針,可用于細(xì)胞中GSH的檢測(cè)。Sun等[56]在二氧化硅包覆的半導(dǎo)體量子點(diǎn)(QD-SiO2)上增加MnO2納米片,制備穩(wěn)定的生物相容性熒光納米探針G-39。MnO2通過(guò)FRET猝滅QD-SiO2的熒光。加入GSH使MnO2納米片被還原降解,G-39的熒光恢復(fù)。探針熒光強(qiáng)度隨著GSH濃度增加而逐漸增大,在0.01~120 μmol·L-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。G-39具有生物相容性好和細(xì)胞攝取能力強(qiáng)的特點(diǎn),已成功用于細(xì)胞內(nèi)GSH的實(shí)時(shí)成像。
3.2 用于檢測(cè)GSH的碳點(diǎn)
CDs是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新型的熒光碳納米粒子,分為石墨烯量子點(diǎn)、碳量子點(diǎn)、碳納米點(diǎn)和碳化聚合物點(diǎn)。由于其具有優(yōu)良的光學(xué)特性、良好的生物相容性、低毒性等優(yōu)點(diǎn),在物質(zhì)檢測(cè)和細(xì)胞成像等方面發(fā)揮著重要作用。CDs檢測(cè)GSH的原理一般都為間接檢測(cè),首先,CDs與物質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致熒光猝滅;加入GSH后可以恢復(fù)CDs的熒光,從而達(dá)到檢測(cè)GSH的目的。
由于—SH對(duì)Cu2+具有很強(qiáng)的絡(luò)合能力,基于金屬離子置換法能夠?qū)崿F(xiàn)GSH的檢測(cè)。Yang等[57]用三乙基四胺對(duì)CDs表面改性得到探針G-40。由于Cu2+易被G-40表面上的氨基和酰胺基選擇性捕獲,形成G-40/Cu2+的聚集體,熒光猝滅。當(dāng)GSH加入到G-40/Cu2+聚集體系中,GSH和Cu2+之間的強(qiáng)相互作用使聚集體結(jié)構(gòu)被破壞,在470 nm處釋放藍(lán)色熒光(圖41)。探針的熒光強(qiáng)度與GSH濃度(0.2~175 μmol·L-1)線性關(guān)系良好,檢測(cè)限為0.11 μmol·L-1。G-40可用于活體酵母細(xì)胞中Cu2+和GSH的檢測(cè)。
直接熱解檸檬酸獲得的CDs經(jīng)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)進(jìn)行表面鈍化后,熒光有較大改善。Pan等[58]通過(guò)這種方法設(shè)計(jì)了熒光探針G-41。GSH和過(guò)量的EDC溶液混合,部分EDC與GSH形成穩(wěn)定的復(fù)合物,把CDs加入上述混合溶液中,CDs表面被剩余的EDC鈍化,相當(dāng)于GSH間接控制CDs的表面鈍化程度(圖42)。G-41對(duì)GSH(1~50 μmol·L-1)的檢測(cè)限為0.943 μmol·L-1。探針G-41可用于人血清中的GSH監(jiān)測(cè)。
當(dāng)鹵原子引入熒光探針的共軛體系時(shí),系間竄越速度增加,探針的熒光減弱,形成“重原子效應(yīng)”[59],而—SH化合物可以取代鹵原子使探針熒光恢復(fù)�；谠撍悸�,本課題組[60]設(shè)計(jì)合成了一種以CDs為母體、溴乙酰溴為功能化基團(tuán)的熒光探針G-42。由于重原子效應(yīng),G-42自身熒光猝滅。當(dāng)溴原子被GSH的—SH取代后,熒光恢復(fù)。在470 nm處G-42的熒光強(qiáng)度與GSH(0~36 μmol·L-1)呈線性關(guān)系,檢測(cè)限為140 nmol·L-1。由于G-42具有低毒性和良好的細(xì)胞滲透性,可用于在人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞水平上檢測(cè)GSH。
為避免熒光團(tuán)或受體和熒光團(tuán)之間用共價(jià)鍵連接的復(fù)雜過(guò)程,Wu等[61]研制了一例基于IFE的熒光納米探針G-43,氮摻雜CDs作為熒光團(tuán),DTNB作為識(shí)別分子。GSH與探針中的DTNB生成5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB),TNB具有較高的摩爾消光系數(shù),且與氮摻雜CDs的激發(fā)光譜重疊,產(chǎn)生IFE,導(dǎo)致510 nm處G-43的熒光強(qiáng)度逐漸降低。G-43對(duì)GSH的檢測(cè)限為30 nmol·L-1。該探針可用于小鼠氧化應(yīng)激模型研究以及人肝癌細(xì)胞成像。
Jia等[62]設(shè)計(jì)了一種吡啶N含量高的紅色碳點(diǎn)G-44,可以比色和熒光雙模式檢測(cè)GSH。加入GSH后,G-44的顏色從紅色變?yōu)樽仙-44在576~486 nm的吸光度比與GSH(12.5~800 μmol·L-1)的對(duì)數(shù)濃度線性成正比,檢測(cè)限為0.7 μmol·L-1。此外,他們還制備了以該探針為基礎(chǔ)的纖維素復(fù)合水凝膠和試紙條,為便攜、準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)GSH提供了很大的機(jī)會(huì)。
在檸檬酸(CA)和聚醚酰亞胺(PEI)合成的CDs的基礎(chǔ)上,Wang等[63]以CA、PEI和羅丹明B為前驅(qū)體,開(kāi)發(fā)了雙波長(zhǎng)發(fā)射的探針G-45。在360 nm激發(fā)時(shí),熒光光譜顯示出CDs (447 nm)和羅丹明B(581 nm)兩個(gè)發(fā)射帶,分別為藍(lán)色和橙色。加入Hg2+后,G-45在447 nm處的熒光被猝滅。而GSH可以恢復(fù)Hg2+猝滅的熒光(圖43)。該探針熒光強(qiáng)度比值(F447/F581)與GSH濃度(1~10 μmol·L-1)呈正比,檢測(cè)限為0.27 μmol·L-1。G-45可實(shí)現(xiàn)水、人血、尿等水溶液中GSH的測(cè)定。
Li等[64]制備了雙發(fā)射碳點(diǎn)G-46。GSH與G-46表面的含氧官能團(tuán)易形成分子間氫鍵,誘導(dǎo)探針有序聚集,形成形狀不均勻的大納米顆粒,從而導(dǎo)致G-46在430 nm處的熒光峰呈現(xiàn)上升趨勢(shì),在642 nm處的熒光峰則呈比例下降(圖44)。探針對(duì)GSH的檢測(cè)限為0.26 μmol·L-1。G-46可以作為一種有效的工具,應(yīng)用于比率GSH傳感和分化癌細(xì)胞與正常細(xì)胞方面。
大多長(zhǎng)波長(zhǎng)發(fā)射CDs不受生物基質(zhì)的藍(lán)色自發(fā)熒光影響、對(duì)生物組織的光損傷較小,但存在量子產(chǎn)率低、Stokes位移小等缺點(diǎn)。針對(duì)此問(wèn)題,本課題組[65]設(shè)計(jì)出了具有較大Stokes位移的黃色碳點(diǎn)G-47。Ag+與G-47的羧基結(jié)合,靜態(tài)猝滅機(jī)制導(dǎo)致熒光猝滅。而GSH又對(duì)Ag+有高親和力,可以恢復(fù)G-47的熒光。通過(guò)這一熒光“關(guān)-開(kāi)”過(guò)程實(shí)現(xiàn)對(duì)GSH的檢測(cè),檢測(cè)限為76 nmol·L-1。G-47能夠用于番茄、紫葡萄和H1299細(xì)胞中GSH的檢測(cè)。
石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)可作為有毒過(guò)渡金屬量子點(diǎn)的綠色替代品,同時(shí)也可以很好地應(yīng)用于GSH的檢測(cè)。Wang等[66]合成了GQDs包裹的方形MnO2納米復(fù)合材料G-48。通過(guò)有效的FRET和IFE,GQDs熒光被抑制。GSH可將MnO2分解,恢復(fù)GQDs熒光。G-48在456 nm處的熒光強(qiáng)度與GSH濃度(0.07~70 μmol·L-1)呈線性關(guān)系,檢測(cè)限為48 nmol·L-1。基于同樣的設(shè)計(jì)策略,Guo等[67]合成了氧化石墨烯-MnO2-熒光素(GO-MnO2-FL)納米復(fù)合材料G-49。FL與GO-MnO2納米復(fù)合材料之間發(fā)生ET,導(dǎo)致熒光猝滅。GSH將MnO2還原為Mn2+,阻斷了FL與GO-MnO2之間的能量傳遞,從而使得復(fù)合材料的熒光顯著增強(qiáng)(圖45),對(duì)GSH(10 μmol·L-1~2 mmol·L-1)的檢測(cè)限為1.53 μmol·L-1。G-49具有優(yōu)異的腫瘤靶向能力,在GSH介導(dǎo)的癌癥診斷方面具有巨大的潛力。
3.3 用于檢測(cè)GSH的金屬納米熒光探針
NCs由幾個(gè)到幾十個(gè)原子組成,并由硫磺酸保護(hù),有時(shí)甚至含有數(shù)百個(gè)金屬原子。其大小(<2 nm)介于原子和納米粒子之間。NCs的直徑與金屬中電子的費(fèi)米波長(zhǎng)相當(dāng),導(dǎo)致連續(xù)的態(tài)密度分裂成離散的能級(jí),從而具有獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)和化學(xué)特性。近年來(lái),關(guān)于NCs的研究呈爆炸式增長(zhǎng),可作為熒光探針應(yīng)用于生物傳感、生物成像。
Li等[68]以多糖(藻酸鹽二醛,ADA)、二苯丙氨酸(FF)、Au納米顆粒(AuNPs)和5-氨基熒光素(FI-NH2)為原料,制備得到熒光探針G-50。由于FI-NH2和AuNPs之間的納米金屬能量轉(zhuǎn)移(NSET),FI-NH2的熒光被猝滅。引入GSH后,形成穩(wěn)定的Au—S鍵,同時(shí)阻斷了NSET過(guò)程,518 nm處FI-NH2的熒光恢復(fù),468 nm處Au納米球的熒光保持不變,可用作內(nèi)置參比信號(hào)。在正常細(xì)胞(0~200 μmol·L-1)和人體宮頸癌細(xì)胞(1~15 mmol·L-1)內(nèi),熒光比率信號(hào)與GSH濃度呈正相關(guān)。G-50為診斷和治療癌癥提供了重要思路。
Li等[69]基于金納米晶簇(AuNCs)聚集態(tài)與分散態(tài)之間的轉(zhuǎn)化策略設(shè)計(jì)了探針G-51。通過(guò)加入聚集劑2-SH-1-甲基咪唑(MMI),調(diào)節(jié)AuNCs狀態(tài),使AuNCs處于分散態(tài)和聚集態(tài)時(shí)熒光顏色分別表達(dá)為藍(lán)色和紅色。在PBS溶液中,若同時(shí)加入GSH和MII,AuNCs為分散態(tài),探針熒光顏色無(wú)變化(圖46),對(duì)GSH檢測(cè)限為12 nmol·L-1。
G-四鏈體是一種特殊形式的核酸,易于合成和修飾,可以與金屬離子和卟啉特異性結(jié)合。將N-甲基卟啉IX(NMM)與G-四鏈體結(jié)合作為GSH檢測(cè)的信號(hào)單元,Ji等[70]開(kāi)發(fā)了一例基于Ag+和NMM介導(dǎo)的G-四鏈體結(jié)構(gòu)的熒光探針G-52。以富含G序列的DNA鏈為原料,初始的鏈內(nèi)分子雜化形成“發(fā)夾”結(jié)構(gòu),富含G序列部分被封閉。在添加Ag+后,通過(guò)形成C-Ag+-C堿基對(duì),“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)被破壞,富集G序列被釋放進(jìn)而形成G-四鏈體結(jié)構(gòu),其能夠結(jié)合NMM并在612 nm處產(chǎn)生強(qiáng)熒光。然而,在GSH的存在下,由于GSH對(duì)Ag+的強(qiáng)結(jié)合能力,無(wú)法形成C-Ag+-C堿基對(duì),G-52恢復(fù)到其原始結(jié)構(gòu)(圖47),熒光猝滅,對(duì)GSH的檢測(cè)限為3.5 nmol·L1-。
3.4 用于檢測(cè)GSH的基于二氧化錳納米片的熒光探針
二氧化錳(MnO2)納米材料摩爾消光系數(shù)大、生物相容性好,在體內(nèi)可分解為無(wú)毒的Mn2+由腎臟排出,因此,被廣泛應(yīng)用于熒光傳感器中。MnO2納米材料可通過(guò)誘導(dǎo)熒光猝滅或獨(dú)特的氧化還原反應(yīng)實(shí)現(xiàn)GSH的檢測(cè)。目前,研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種基于MnO2納米片熒光探針用于GSH檢測(cè)。
基于MnO2納米片氧化還原反應(yīng),Yao等[71]報(bào)道了一例熒光探針G-53。MnO2納米片可將OPDA氧化成2,3-二氨基吩嗪(OPDAox),最佳發(fā)射在568 nm。加入GSH可使MnO2納米片還原為Mn2+,降低了納米片的有效氧化活性,抑制OPDAox的形成(圖48)。同時(shí),導(dǎo)致568 nm處熒光猝滅。G-53檢測(cè)限為10 nmol·L-1。
Zhang等[72]通過(guò)靜電作用將AIE分子SiO2-NPs吸附在MnO2納米片上,制成探針G-54。由于帶負(fù)電荷的MnO2納米片與陰離子四苯基乙烯衍生物(TPE3)之間存在空間位阻,使得TPE3在SiO2納米粒子表面無(wú)法聚集,G-54無(wú)熒光產(chǎn)生。隨著GSH的加入,MnO2還原為Mn2+導(dǎo)致納米片分解,釋放氨基官能化的SiO2-NPs,TPE3聚集在帶正電荷的SiO2-NP表面,形成TPE3-SiO2-NPs。TPE3分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限,在490 nm處發(fā)出強(qiáng)烈熒光,熒光強(qiáng)度與GSH濃度(0.5~100 μmol·L-1)正相關(guān),檢測(cè)限為200 nmol·L-1。G-54可應(yīng)用于復(fù)雜的探針熒光標(biāo)記過(guò)程。
MnO2在酸性條件下易被還原,溶液顏色褪為無(wú)色。Fu等[73]通過(guò)結(jié)合pH響應(yīng)型熒光染料AHC(3-乙�；�-7-羥基-2H-鉻-2-基團(tuán))和MnO2納米片,合成了一種多功能納米探針G-55。由于IFE,AHC被MnO2納米片高效猝滅。加入GSH后,MnO2納米片被還原分解,AHC的藍(lán)色熒光恢復(fù)。同時(shí),隨著酸性pH的增強(qiáng),不僅MnO2納米片被分解,AHC中苯酚基團(tuán)也發(fā)生去質(zhì)子化,增強(qiáng)了ICT,從而導(dǎo)致AHC藍(lán)色熒光增強(qiáng)(圖49)。隨著GSH (0.5~20 μmol·L-1)的加入,G-55在456 nm處的熒光逐漸增強(qiáng),檢測(cè)限為0.22 μmol·L-1。
4 結(jié)論與展望
本文從有機(jī)小分子和無(wú)機(jī)納米探針兩個(gè)角度,以熒光團(tuán)為分類(lèi)依據(jù),綜述了近五年報(bào)道的GSH熒光探針。重點(diǎn)介紹了GSH對(duì)于不同熒光團(tuán)的響應(yīng)模式,同時(shí)討論了探針的設(shè)計(jì)策略、熒光變化和實(shí)際應(yīng)用�；诓煌瑹晒鈭F(tuán)的谷胱甘肽探針的傳感性能及應(yīng)用的比較總結(jié)于表1中。
目前來(lái)看,GSH熒光探針在選擇性、靈敏度、生物相容性、細(xì)胞內(nèi)分布能力等方面都得到了提高。其中:(1)比率探針和雙發(fā)射探針可以進(jìn)行有效的自校準(zhǔn),提高GSH檢測(cè)的精度和準(zhǔn)確性;(2)近紅外和雙光子熒光團(tuán)的設(shè)計(jì)降低了生物系統(tǒng)熒光背景干擾和組織損傷能力并提高了穿透深度,有利于在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用;(3)將AIE分子與探針相結(jié)合,不僅避免了傳統(tǒng)熒光探針的ACQ效應(yīng),還使探針的熒光標(biāo)記過(guò)程得到有效改善。以上三點(diǎn)均為GSH熒光探針的開(kāi)發(fā)提供了新的思路。
此外,人體細(xì)胞內(nèi)GSH含量變化能夠間接反映某些疾病,但目前能實(shí)時(shí)跟蹤細(xì)胞內(nèi)GSH并精確量化的探針較少。因此將來(lái)的研究應(yīng)更多地集中在探針的臨床應(yīng)用上,需要不同領(lǐng)域科學(xué)家之間的跨學(xué)科合作,希望相關(guān)研究的綜述能夠?yàn)檠芯咳藛T提供參考和信息。
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