摘要 自從20年余前第一次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞穿透肽(cell-penetrating peptides, CPPs)以來, 細(xì)胞穿透肽新家族成員的發(fā)掘和應(yīng)用研究發(fā)展迅速。這些短肽可以通過共價或非共價連接形式穿過細(xì)胞膜, 并且可以攜帶多種沒有能力克服細(xì)胞膜通透性障礙的分子進(jìn)入細(xì)胞。作為納米級轉(zhuǎn)運載體, 大多數(shù)CPPs是無毒的, 并已成為藥物治療、診斷以及蛋白質(zhì)、核酸功能等方面研究的新型潛在工具。該文重點從CPPs的分類、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、跨膜機制、細(xì)胞器定位、細(xì)胞毒性、與外源物質(zhì)連接方式以及應(yīng)用等方面介紹了國際上有關(guān)CPPs的研究進(jìn)展及其存在的挑戰(zhàn)和未來前景。
細(xì)胞膜對外源分子的進(jìn)入具有選擇性。許多生物活性分子不能克服細(xì)胞膜的通透性障礙, 是基因和藥物靶向診斷和治療的主要限制因素。而細(xì)胞穿透肽(cell-penetrating peptides, CPPs)是一系列能夠快速穿透細(xì)胞質(zhì)膜的短肽[1-2](如I型人類免疫缺陷病毒的反轉(zhuǎn)錄激活因子HIV-1 Tat的基本域長度只有9個氨基酸), 它們能傳遞比自己分子量高100倍的大分子, 例如蛋白質(zhì)、質(zhì)粒、siRNA、納米粒子、核酸和脂質(zhì)體等, 它們通過與CPPs形成復(fù)合物從而進(jìn)入細(xì)胞[3]。與病毒載體相比, CPPs具有生物安全性高、細(xì)胞毒性低、可設(shè)計性強等優(yōu)點。同時, 細(xì)胞穿透肽的發(fā)現(xiàn), 在診斷和治療研究領(lǐng)域極其重要, 極大地推動了細(xì)胞攝取和大分子功能研究。
1 細(xì)胞穿透肽的種類
根據(jù)細(xì)胞穿透肽在序列、疏水性和極性等方面的差異, CPPs可以分為5類: 陽離子多肽(cationicpeptides)、疏水性多肽(hydrophobic sequences)、兩性分子肽(amphipathic peptides)、富含脯氨酸的多肽和抗菌肽(proline-rich and antimicrobial sequences)、嵌合肽(chimeric peptides)[4]。
陽離子的細(xì)胞穿透肽主要由多個精氨酸殘基和賴氨酸殘基組成。最初研究者們認(rèn)為它是攜帶外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的傳遞工具, 而且不引起細(xì)胞反應(yīng)[5]。通過比較由精氨酸、組氨酸、賴氨酸或鳥氨酸組成的短聚合物, 發(fā)現(xiàn)精氨酸殘基在穿透細(xì)胞質(zhì)膜的過程中是最有效的[6]。因此, 精氨酸殘基被認(rèn)為是陽離子CPPs的一個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征。氨基酸序列中精氨酸和賴氨酸殘基的數(shù)量和位置同樣也是轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的關(guān)鍵。研究表明, 分別有7、8、9個殘基的低聚精氨酸會有最高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[7]。
已知的蛋白質(zhì)、多聚精氨酸和縮氨酸中有很多富含精氨酸多肽的例子, 例如: HIV-1 Tat的49-57截序列(RKKRRQRRR)[6]、Tat(transactivator of transcription)的 二 聚 體 分 子Tat2(RKKRRQRRRRKKRRQRRR)[6,8]、果蠅ATF轉(zhuǎn)錄因子的同源結(jié)構(gòu)域N-端截序列(RQIKIWFQNRRMKWKK)[9]等。
信號肽總體來說由三個區(qū)域組成: 帶正電荷的N-端、疏水的H區(qū)域和帶負(fù)電的C-端, 其中疏水的H區(qū)域是疏水性多肽的重要標(biāo)志。對于相關(guān)生物活性的蛋白質(zhì)片段, H區(qū)域擔(dān)任著信號肽的“搬運工”角色[10]。例如, 肉瘤成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)信號肽序列, 由16個氨基酸(AAVALLPAVLLALLAP)組成[10];整合素(integrin) β3信號肽序列由15個氨基酸(VTVLALGALAGVGVG)成。
兩性的CPPs中親水部分大多是由賴氨酸殘基組成[11]。pH中性時, 具有親水和疏水兩面特性的兩性螺旋是多肽穿過質(zhì)膜的必要結(jié)構(gòu)[12]。兩性模型肽(model amphipathic peptide, MAP)是由18個氨基酸組成的多肽(KLALKLALKALKAALKLA), 有一個α螺旋結(jié)構(gòu)[13]。CADY(GLWRALWRLLRSLWRLLWRA)是含20個氨基酸的CPP多肽, 它可以靶向siRNA[14]。Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)是第一個商業(yè)化的兩性分子肽類型的CPP(Chariot kit, ActiveMotif, USA), 可用于蛋白質(zhì)的非共價鍵轉(zhuǎn)導(dǎo), 它有三個區(qū)域: 一個疏水域、一個親水域和一個間隔域, 它能提高疏水域和親水域的靈活性和完整性[15]。
富含脯氨酸序列或多聚脯氨酸序列在水中能形成螺旋狀結(jié)構(gòu)。例如, SAP(sweet arrow peptide,SAP)(VRLPPP)來自于玉米貯存蛋白, 是γ-zein中富含脯氨酸的N-端重復(fù)區(qū)域, SAP包含50%的脯氨酸殘基。
抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是生物體防御外界病原體侵襲時產(chǎn)生的由基因編碼、核糖體合成的一類小分子活性多肽, 是生物體內(nèi)先天性防御系統(tǒng)的重要組成成分[16]。在體外, 往往在幾分鐘之內(nèi), 它就可殺傷革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、寄生蟲、病毒及腫瘤細(xì)胞[17]。例如, S413-PV(ALWKTLLKKVLKAPKKKRKVC)是 一 個 由13個氨基酸組成的多聚陽離子抗菌肽, 來源于抗菌肽S4和猿病毒40(SV40)大T抗原NLS(nuclear localization sequence)[18]。
嵌合肽可能包含兩個或更多的模體。例如,轉(zhuǎn) 運 素(transportan)是 由27個 氨 基 酸(GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL)組成的嵌合肽, 前12個殘基來源于神經(jīng)肽甘丙肽(galanin)的N-端, 而C-端14個殘基來自于黃蜂毒素的mastroparan多肽;pVEC(peptide vascular endothelial-cadherin, pVEC)是由18個氨基酸組成的來源于鼠類的多肽(LLIILRRRIRKQAHASK)。值得注意的是, pVEC和轉(zhuǎn)運素都可以被小黑麥幼苗的各種組織內(nèi)化[19]。
2 CPPs結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系
傳遞高分子的CPPs序列所共有的特征是具有正電荷, CPPs能與核酸和一些蛋白質(zhì)的負(fù)電荷相互作用, 因此為CPP功能的預(yù)測提供了參考。然而, 并不是所有帶正電荷的序列都是細(xì)胞穿透肽, 不同序列CPPs的功能與其氨基酸構(gòu)成關(guān)系不大[20]。例如,pVEC(LLIILRRRIRKQAHASK)和pVEC-scrambled(IAARIKLRSRQHIKLRHL)雖具有相同的氨基酸組成, 但后者氨基酸的排列是隨機的, 在植物和哺乳動物細(xì)胞中, pVEC-scrambled比pVEC的內(nèi)化能力明顯降低[19]。單一氨基酸的替換甚至就可能導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)運或者核定位能力的完全喪失, 例如突變的Tat(MTat), 它的第一個精氨酸殘基被丙氨酸代替[6], 就基本喪失了細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運能力[8]。在相同的組織中,CPPs的細(xì)胞內(nèi)化能力受其氨基酸序列和長度的影響[8]。對于Tat的有效轉(zhuǎn)運, 至少需要6個精氨酸殘基,而且研究結(jié)果顯示, 伴隨著精氨酸殘基數(shù)的提高, 其轉(zhuǎn)運能力也提高[6,21]。研究結(jié)果表明, 氨基酸序列和結(jié)構(gòu)在決定CPPs的細(xì)胞穿透特性方面是很重要的因素。
3 CPPs的跨膜機制
CPP的跨膜機制至今仍不十分明確。初始階段(1988~2003年)的研究認(rèn)為, CPPs穿膜是非內(nèi)吞、非能量依賴的直接穿膜過程, 目前這些實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性已備受質(zhì)疑[22]。2003年, 有研究者提出用流式細(xì)胞儀無法區(qū)分CPPs在細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外, 不能對細(xì)胞攝取的有熒光標(biāo)記的CPPs進(jìn)行定位; 另一質(zhì)疑是細(xì)胞固定技術(shù)對CPPs觀察的影響, 因固定劑乙醇和醋酸可以增加核膜的通透性, 有研究指出, 熒光標(biāo)記的細(xì)胞蛋白在使用上述固定劑固定后可以定位在不當(dāng)位置。
隨著更多有類似細(xì)胞穿透性質(zhì)蛋白的發(fā)現(xiàn)以及對它們跨膜機制的研究, 發(fā)現(xiàn)它們是通過形成某種跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來完成轉(zhuǎn)導(dǎo)的[23]。現(xiàn)在已經(jīng)提出的CPPs可能的轉(zhuǎn)導(dǎo)模式有三種[24-25], 即倒置微團模式(inverted cell model)、地毯模式(carpet model)和打孔模式(barrel stave pore formation model)。倒置微團模式由Prochiantz研究小組[26]提出, 他們利用核磁共振技術(shù)研究CPP與磷脂膜的相互作用。他們認(rèn)為, 首先CPP帶正電的基團與帶負(fù)電的磷脂分子相互作用, 隨后CPP的疏水性氨基酸與細(xì)胞膜相互作用從而使細(xì)胞膜發(fā)生反轉(zhuǎn)和重排, 形成微團結(jié)構(gòu)將CPP包圍其中, 然后將CPP釋放入細(xì)胞內(nèi)。雖然這一假說能夠解釋一些CPP的穿膜機制, 但對于不含有疏水性氨基酸的Tat和富含精氨酸的多肽來說卻無能為力。地毯模式首次被提出來是為了解釋一些抗菌肽的穿膜機制, 但它同樣可以用來解釋在高濃度時會出現(xiàn)細(xì)胞毒性的CPP的內(nèi)化, 主要包括三個步驟: 首先, CPP依靠其陽性電荷與磷脂膜的負(fù)電荷產(chǎn)生相互作用, 引起CPP二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變, 使得CPP就像地毯一樣將整個細(xì)胞表面覆蓋; 然后, CPP方向發(fā)生倒轉(zhuǎn), 插入磷脂膜中, 引起膜張力的改變; 最后,膜的穩(wěn)定性被破壞, 出現(xiàn)瞬時的通透性增高, CPP得以內(nèi)化。這一機制能夠更好地解釋一些抗菌肽的毒性作用[27]。打孔模式是指兼性α螺旋結(jié)構(gòu)的CPP內(nèi)化時, CPP成束聚集排列于細(xì)胞表面, 并平行排列插入細(xì)胞膜中, 形成像棍子箍成的桶樣結(jié)構(gòu)的孔型通道——疏水性氨基酸與膜疏水核心相互形成外表面, 親水氨基酸形成孔的內(nèi)表面, 然后CPP發(fā)生跨膜轉(zhuǎn)位, 實現(xiàn)內(nèi)化。這種模式也是抗微生物肽進(jìn)入細(xì)胞的一種內(nèi)化機制[28]。
進(jìn)一步的研究表明, 內(nèi)吞才是細(xì)胞穿透肽內(nèi)化的主要機制[29-30], 目前這一觀點已被認(rèn)可和證明。內(nèi)吞通路主要包括網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)、胞膜窖介導(dǎo)、巨吞飲介導(dǎo)的內(nèi)吞。有研究小組提出CPPs的巨胞飲機制[31]。2004年, 有報道Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠活細(xì)胞的巨胞飲機制, 表明Tat與內(nèi)涵體標(biāo)記的共區(qū)域化, 說明CPPs定位于內(nèi)涵體中[32]。有研究稱, 巨胞飲作用是細(xì)胞內(nèi)化的主要途徑, 它能在不同程度上發(fā)生于所有的細(xì)胞內(nèi), 而且可以從膜的邊緣擾動和形成囊泡的大小兩個方面區(qū)分巨胞飲與其他形式的內(nèi)吞作用。
4 CPPs進(jìn)入細(xì)胞以后的細(xì)胞器定位
多數(shù)CPP因序列上帶有核定位序列(nuclear lo-calization sequence, NLS), 在進(jìn)入細(xì)胞并從內(nèi)含體釋放出來后, 都能通過核孔復(fù)合物(nuclear pore complexs, NPCs)穿過核膜, 進(jìn)入細(xì)胞核。直徑小于9 nm或者60 kDa的高分子可通過NPC被動地擴散。此外,NPC可以促進(jìn)直徑10~20 nm高分子的主動轉(zhuǎn)運。在NPC里, 核蛋白需要NLS作為核輸入蛋白α/β介導(dǎo)的核進(jìn)口路徑的靶點[35]。因此, 推測CPPs可利用已知的核進(jìn)入機制輕易地進(jìn)入細(xì)胞核。
線粒體是治療多種疾病和紊亂的重要靶點。線粒體定位序列效率相對較低。由陽離子和親脂性殘基組成的線粒體定位肽已被用于研究細(xì)胞的氧化脅迫反應(yīng)[36]。脂質(zhì)體粒子MITO-porter是基于STR-R8MEND(stearyl-octaarginine, multifunctional envelopetype nanodevices)概念的傳遞治療藥物到線粒體的分子, 它是一種脂質(zhì)體為基礎(chǔ)的納米載體, 可以通過膜融合將貨物轉(zhuǎn)運到線粒體中[37]。
葉綠體基因工程是一項充滿希望又富有挑戰(zhàn)的植物基因工程遺傳操作技術(shù), 研發(fā)能將DNA等大分子運送到葉綠體內(nèi)的CPPs無疑將會極有利于植物葉綠體基因工程的發(fā)展。加拿大研究人員Eudes等[38]構(gòu)建了帶熒光標(biāo)記的葉綠體定位CPP肽, 并在受試葉肉細(xì)胞的葉綠體中檢測到大量的標(biāo)記熒光,證明了該CPP的葉綠體定位轉(zhuǎn)運能力。他們將開發(fā)的幾種細(xì)胞器定位轉(zhuǎn)運CPPs一起申請了國際專利[34]。
5 細(xì)胞毒性和細(xì)胞功能
在植物中, 以體細(xì)胞胚胎或小孢子為試材的研究顯示, 獨自的CPP或者與攜帶貨物形成的復(fù)合物在實驗濃度下, 沒有觀察到細(xì)胞毒性[41]。小孢子與CPPs或CPP-貨物復(fù)合物共育后的活性與對照小孢子活性相似(約65%~70%活性細(xì)胞); CPPs在小黑麥葉肉原生質(zhì)體的活性方面沒有負(fù)面影響[8,19]。CPP處理不同植物的根細(xì)胞也沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性效應(yīng)[7]。
6 CPPs與外源物質(zhì)的連接方式
CPP能夠輸送種類繁多的物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞, 所轉(zhuǎn)運的物質(zhì)在物理和化學(xué)性質(zhì)上不盡相同。因此, 需要不同的連接方法, 通過共價、非共價偶聯(lián)或者二者聯(lián)合使用, 將CPP與外源物質(zhì)連接[42]。其中, 連接的方式對CPPs在攝取水平和方式上有深遠(yuǎn)影響[1]。
共價連接是CPP與外源物質(zhì)結(jié)合常見的方法。蛋白質(zhì)和CPP往往通過化學(xué)偶聯(lián)或者使用重組DNA技術(shù)進(jìn)行連接, 形成含有細(xì)胞穿透序列的融合蛋白。與外源物質(zhì)共價連接進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)運的CPP有Tat、多聚Arg、轉(zhuǎn)運素以及單純皰疹病毒的VP22蛋白和降鈣素等。然而, 從化學(xué)觀點來看, CPP共價連接技術(shù)在方法學(xué)上對連接物質(zhì)有嚴(yán)格的限制, 并且可能改變連接物的生物活性, 尤其是帶電荷的寡核苷酸或siRNA。
基于該方法與載物結(jié)合的大多數(shù)是兩親性型的CPP, 如MPG多肽與siRNA、寡核酸, Pep-1肽與核酸、蛋白等, 其他還有陽離子型的Tat和寡聚精氨酸[43]。非共價結(jié)合相對比較簡單, 包括靜電作用和疏水作用, 運用非共價結(jié)合方法可以實現(xiàn)核酸和蛋白等生物活性大分子的胞內(nèi)傳遞并保留其生物活性[44]。因此, 對一些連接物而言, 非共價連接顯得更為合適。
7 細(xì)胞穿透肽的應(yīng)用
在過去的數(shù)十年里, 人們一直致力于將肽段、蛋白質(zhì)和寡核苷酸等用于疾病的治療, 但是由于細(xì)胞膜的生物屏障作用, 這些大分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題。自1999年首次報導(dǎo)了Tat可攜帶活性蛋白β半乳糖苷酶進(jìn)入活體小鼠包括腦組織在內(nèi)的所有細(xì)胞后[45], CPPs開始作為轉(zhuǎn)導(dǎo)工具應(yīng)用于實驗研究中, 使蛋白質(zhì)等大分子能夠穿過細(xì)胞膜發(fā)揮作用, 其在腫瘤顯像與治療、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、炎癥及免疫治療、疫苗研究等領(lǐng)域展現(xiàn)出很大的研究價值, 并且已經(jīng)取得了不少新的進(jìn)展, 具有廣泛的用前景。
Tat與 一 種 多 肽 模 擬 物(anti-Her-2/neu peptidemimetic, AHNP), 共軛連接(Tat-AHNP)之后, AHNP就可以選擇性地吸附一種表皮生長因子受體ErbB2,并在乳腺癌細(xì)胞中過量表達(dá)。這種設(shè)計新穎的對癌細(xì)胞有特異性的運輸多肽Tat-AHNP將可以用于乳腺癌的治療[47]。
7.1.2 CPPs在腦疾病治療中的應(yīng)用 在腦腫瘤的治療中, 由于存在血腦屏障, 大多數(shù)抗癌藥物必須以侵入性、高毒性的方式進(jìn)入大腦, 大大限制了有效治療。有關(guān)研究證明, CPPs能以一種無毒方式穿越血腦屏障, 可運載抗癌藥物進(jìn)入腦內(nèi), 并且可以保留其藥理作用[48]。也有研究報道, 將狂犬病毒的糖蛋白(rabies virus glycoprotein, RVG)和含9個精氨酸殘基的小肽交聯(lián)在一起組成一個新的細(xì)胞穿透肽RVG-9R, 不僅能特異性地將siRNA遞送進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞中, 并且能穿越血腦屏障, 這為難以治療的腦部疾病帶來了曙光[43]。
7.1.3 CPPs在生物影像學(xué)中的應(yīng)用 利用CPPs可以提高造影劑和生物傳感器在生物體內(nèi)的穿透能力以及實時觀測病毒感染細(xì)胞等。有研究者利用Tat將納米半導(dǎo)體遞送到兔子腦組織中[49]。Tat能快速完成這一功能, 而且利用低能量的手控紫外燈就能立刻觀測到兔子腦組織中的熒光顯影, 這一研究成果可以應(yīng)用于腫瘤患者手術(shù)中的腫瘤顯影。
7.1.4 其他 除以上的應(yīng)用外, 也有研究報道, 將轉(zhuǎn)錄因子STAT-6抑制肽與HIV-Tat來源的PTD4(proteintransduction domain 4)交聯(lián)后可以降低小鼠體內(nèi)卵白蛋白引起的炎癥反應(yīng), 而STAT-6的功能與過敏性疾病有關(guān), 提示其抑制肽可以用來治療過敏性鼻炎和過敏性哮喘[50]。由于CPPs能夠通過血腦屏障, 可攜帶膽堿乙�；D(zhuǎn)移酶、腦源性神經(jīng)生長因子治療老年性癡呆; 攜帶酪氨酸羥化酶、膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)因子治療帕金森病[51]。研究者們利用Tat的穿膜能力成功地將各種多克隆抗體遞送進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部, 近期也有關(guān)于遞送單克隆抗體的報道, 而且這一技術(shù)能夠被廣泛地用于輻射免疫治療及輻射免疫檢測[52]。
植物轉(zhuǎn)基因的方法很多, 1991年P(guān)otrykus[53]將其歸結(jié)為17種。后來, 又出現(xiàn)了超聲波法、離子束法等。在報道的眾多轉(zhuǎn)基因方法中, 有不少是大同小異的。大致可劃分為兩類: 一種是載體介導(dǎo)法, 如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、病毒介導(dǎo)法等; 另一種是DNA直接攝取法, 如基因槍法、聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)法、電擊法、顯微注射法和超聲波導(dǎo)入法等。CPP納米載體的出現(xiàn)為植物基因工程操作展現(xiàn)了新的曙光。
在植物中, CPP介導(dǎo)高分子的傳遞是一個較新的領(lǐng)域。Chang等[7]報道了在綠豆、大豆、玉米和洋蔥根尖細(xì)胞中, 24 kDa的熒光蛋白被Tat蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Tat-PTD)和精氨酸豐富的細(xì)胞內(nèi)傳遞多肽(AID)以共價和非共價的方式轉(zhuǎn)導(dǎo)。最近的研究顯示, 懸浮的煙草細(xì)胞原生質(zhì)體和黑小麥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體都可以攝取CPPs, 例如: Tat、Tat2、AID、pVEC、轉(zhuǎn)運素和穿透素[8,19]。在原生質(zhì)體、煙草懸浮細(xì)胞、綠豆、大豆根尖和未成熟的小麥胚中都有成功的核酸(DNA和dsRNA)轉(zhuǎn)染報道[8,54]。Chugh等[55]借助Tat2將攜帶gus基因的質(zhì)粒DNA進(jìn)入小麥胚胎細(xì)胞, 實現(xiàn)了gus基因的瞬時表達(dá)。以上都說明, CPP克服了細(xì)胞壁作為大分子蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要障礙。
由于植物細(xì)胞比動物細(xì)胞具有更強的全能性,特別是小孢子細(xì)胞還具有群體大、單倍性、可培養(yǎng)性等特點, 因此, CPPs介導(dǎo)植物細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)的建立, 在植物基因功能研究及基因工程遺傳改良上具有巨大潛力。
CPPs的研究已經(jīng)取得了不少新進(jìn)展, 但還存在一些缺陷, 如內(nèi)含體釋放率低、細(xì)胞定位不精確以及穩(wěn)定性差等。尤其是內(nèi)含體問題, 即進(jìn)入細(xì)胞后,細(xì)胞穿透肽及其負(fù)荷的“貨物”立即被細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體(endosome)包裹, 與細(xì)胞漿分隔開, 本質(zhì)上, 這與處在細(xì)胞外的狀態(tài)沒有區(qū)別。如何突破內(nèi)體包膜釋放進(jìn)細(xì)胞漿, 成為細(xì)胞穿透肽及其負(fù)荷的“貨物”能否發(fā)揮功能的關(guān)鍵。近年來, 這方面也已經(jīng)取得重要進(jìn)展。
7.3.1 化學(xué)物質(zhì)輔助解決 Wattiaux等[58]證明, 氯喹可促進(jìn)TAT多肽從內(nèi)含體中逃逸至胞漿并進(jìn)入胞核。另外, Ca2+和蔗糖也都能促進(jìn)內(nèi)涵體的釋放。
7.3.2 光敏物質(zhì)輔助解決 光敏物質(zhì)能在可見光的激發(fā)下產(chǎn)生活性氧簇, 而活性氧簇能破壞內(nèi)含體膜, 促進(jìn)內(nèi)含體內(nèi)物質(zhì)釋放進(jìn)入胞漿。Maiolo等[59]將CPPs-多肽標(biāo)記上光敏物質(zhì), 作用于細(xì)胞的同時給予激光照射, 結(jié)果顯示, 多數(shù)CPPs偶聯(lián)多肽均從內(nèi)含體逃逸進(jìn)入胞漿或胞核, 發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)活性。
7.3.4 病毒微生物輔助解決 為逃避宿主細(xì)胞的殺傷機制, 一些病毒等微生物在進(jìn)化過程中獲得了從內(nèi)含體逃逸的本領(lǐng)。Wadia等[32]研究發(fā)現(xiàn), 流感病毒血凝素2蛋白(hemagglutinin 2, HA2)與TAT的融合多肽能顯著增強融合蛋白從內(nèi)含體中釋放。此外,人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)衣殼蛋白L2 C-端的23個氨基酸殘基短肽也具有與HA2類似的內(nèi)含體逃逸功能。
7.3.5 CPP自身改造輔助解決 目前已提出很多關(guān)于CPP改造的方案, 也已對很多方案進(jìn)行試驗驗證,雖有進(jìn)展, 但缺少實質(zhì)性的突破。對現(xiàn)有CPPs進(jìn)行改造是更簡便、更安全的方法來促進(jìn)CPP的內(nèi)體逃逸。
8 存在的挑戰(zhàn)與前景
CPP能以共價或非共價鍵連接的方式傳遞比自己大很多的“貨物”(蛋白質(zhì)、藥物或核酸等)穿過質(zhì)膜, 并具有細(xì)胞器定位能力, 這兩個特性, 展示了它在細(xì)胞生物技術(shù)操作上的巨大潛力。對CPPs和高分子“貨物”的研究已經(jīng)打開了藥理學(xué)、疾病診斷和治療方法研究的新視野, 為生物藥物載體的發(fā)展帶來了很多機會, 也給生物大分子治療疾病帶來了曙光。CPPs在植物上的應(yīng)用研究雖然起步較晚, 但其可能性已得到證實, CPPs能夠攜帶基因和蛋白以一種簡單且低成本的方式轉(zhuǎn)運進(jìn)植物細(xì)胞中, 讓我們看到了CPPs在植物基因或蛋白研究中的巨大潛力。然而,實現(xiàn)CPP-“貨物”成功傳遞的步驟、方法尚需完善,其細(xì)胞內(nèi)化的機制也存在爭論。CPPs在哺乳動物細(xì)胞中作為傳遞工具的一個重要不足是沒有細(xì)胞特異性, 這可能是CPPs用于藥物治療和其他藥理學(xué)應(yīng)用的主要缺點。
對CPP多肽序列的特征、重要的結(jié)構(gòu)特點與其功能的關(guān)系還需要進(jìn)一步解析, 其中包括CPP大小和序列對細(xì)胞內(nèi)化和亞細(xì)胞定位的影響, 以及繼續(xù)發(fā)現(xiàn)新的CPPs, 繼續(xù)擴大、優(yōu)化CPPs在植物與哺乳動物中的各種應(yīng)用, 等等。近年來, 研究者們對CPPs的巨大興趣無疑強化了CPPs在納米生物新興領(lǐng)域的巨大潛力。隨著CPPs內(nèi)化機制的進(jìn)一步解析、明確以及CPP-“貨物”運送技術(shù)的進(jìn)一步完善, CPPs的應(yīng)用會越來越廣泛。
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