[摘 要] 目的：探討靶向融合肽IL-4Rα-lytic對卡波西肉瘤相關皰疹病毒（KSHV）陽性原發(fā)性滲出性淋巴瘤（PEL）細胞的體內(nèi)外殺傷作用及其安全性。方法：應用 MTT 法檢測 IL-4Rα -lytic 對 KSHV 陽性PEL細胞BCBL-1和BCP-1的殺傷能力。通過FCM檢測IL-4Rα-lytic 誘導 KSHV 陽性 PEL 細胞凋亡的情況。建立 BCBL-1 細胞小鼠移植瘤模型，連續(xù)3周（3次/周）腹腔注射IL-4Rα-lytic后，通過活體生物發(fā)光成像技術評估IL-4Rα-lytic對小鼠體內(nèi)BCBL-1細胞移植瘤的抑制效果，并通過H-E染色和全血分析法檢測其毒副作用。結果：靶向融合肽IL-4Rα-lytic在體外對兩種KSHV陽性PEL細胞BCBL-1和BCP-1均有選擇性殺傷作用（均 P<0.01），并且可以在短時間內(nèi)發(fā)揮殺傷作用（均 P<0.01）。靶向融合肽 IL-4Rα-lytic 可誘導 KSHV 陽性 PEL 細胞BCBL-1和BCP-1凋亡（均P<0.05）。靶向融合肽IL-4Rα-lytic顯著抑制BCBL-1細胞小鼠移植瘤的生長，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），并且無明顯的器官毒性（均P>0.05），同時不會造成體質(zhì)量異常（P>0.05）。結論：靶向融合肽IL-4Rα-lytic在體內(nèi)外均顯著抑制KSHV陽性PEL細胞的生長，且無明顯毒副作用，有望為PEL的治療提供一種新的治療方案。
原發(fā)性滲出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）是一種罕見的霍奇金淋巴瘤，主要表現(xiàn)為腹水、胸腔積液和心包積液等[1-2]。PEL的惡性程度高，常規(guī)化療藥物治療效果不佳，預后極差，患者中位生存期少于6個月[3-4]，因此亟待研發(fā)安全有效的治療手段。PEL通常與卡波西肉 瘤 相 關 皰 疹 病 毒（Kaposisarcoma-associated herpesvirus，KSHV）感染相關[5-9]。本課題組前期的研究結果[10-11]顯示，處于KSHV感染潛伏期的 PEL 細胞均不同程度地過表達 IL-4Rα，而KSHV 陰性細胞則不表達或低表達 IL-4Rα；過表達IL-4Rα引起JAK1-PI3K-Akt信號通路的組成型激活，從而促進潛伏期腫瘤的生長。研究結果[12-13]發(fā)現(xiàn)，IL-4R高表達與多種類型惡性腫瘤相關，并在以其為治療靶點的研究中觀察到藥物對腫瘤長期、持續(xù)的療效。上述研究結果均提示，IL-4Rα可能是KSHV陽性PEL的潛在治療靶點。利用帶負電的膜磷脂酰絲氨酸在多數(shù)腫瘤與正常細胞細胞膜上表達水平的差異，PAPO等[14]合成非對映體裂解肽（包含D-和L-形式的亮氨酸和賴氨酸等15個氨基酸），并發(fā)現(xiàn)此裂解肽能夠因癌細胞表面酸性成分的靜電吸引而具有一定的細胞選擇性，隨后通過類似陽離子抗菌肽的工作原理裂解細胞膜。KOHNO等[15]在此基礎上，通過優(yōu)化氨基酸序列設計了裂解肽 Lytic，減少了對正常細胞的殺 傷 。之 后 ，YANG 等[16]設 計 的靶向融合肽IL-4Rα-lytic 含 有 靶 向 IL-4Rα 的 靶 向 肽和裂解肽Lytic 兩個片段，可特異地靶向多種類型表達IL-4Rα受體的腫瘤細胞（如胰腺癌、乳腺癌等細胞）。本研究旨在檢測靶向融合肽IL-4Rα-lytic對KSHV陽性PEL細胞的體內(nèi)外殺傷效果，并分析其安全性，為PEL的治療提供新的思路和理論基礎。
1 材料與方法
人B細胞淋巴瘤細胞系BCBL-1、BCP-1和BJAB由本室保存，熒光素酶標記的BCBL-1細胞為本實驗室前期構建[17]。所有細胞均采用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，于 37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6周齡、體質(zhì)量20 g左右的雌性NOD/SCID小鼠購自維通達生物技術有限公司（實驗動物合格證號：20210402Abzz0619000685）。CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，AnnexinⅤ-APC/PI試劑盒購自 BD Biosciences 公司。IVIS Spectrum 活體光學成像系統(tǒng)購自美國珀金埃爾默公司，熒光素底物購自翌圣生物科技股份有限公司，正倒置一體熒光顯微鏡購自美國ECHO公司，pocH-100i全自動血液分析儀購自日本希森美康公司。組織切片和H-E染色由武漢賽維爾生物科技有限公司完成。
IL-4Rα-lytic 和 Lytic多肽均用固態(tài)合成法合成（純度>95%），并經(jīng)過質(zhì)譜分析驗證。多肽溶解在 PBS（pH=7.4）中。IL-4Rα-lytic: KQLIRFLKRLDRNGGGKL-l-LK-l-L-kk-LLK-l-LKKK（小寫的氨基酸為D型氨基酸）；Lytic:KL-l-LK-l-L-kk-LLK-l-LKKK（小寫的氨基酸為D型氨基酸）。
將密度為 5×105個/mL 的 KSHV 相關細胞（包括KSHV陽性PEL細胞BCBL-1、BCP-1和KSHV 陰性細胞BJAB）懸液接種于96孔板（50 µL/孔），然后加入2.5、5、10或20µmol/L的IL-4Rα-lytic或Lytic溶液（50 µL/孔），于 37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2 h后，每孔加入CCK-8試劑10 µL，通過酶標儀檢測450 nm波長處各孔細胞的光密度（D）值，并計算細胞存活率（細胞存活率=實驗組D450/對照組D450×100%）。實驗重復3次。
將 密 度 為 1×106 個/mL 的 BCBL-1、BCP-1 和BJAB 細胞置于 12 孔板中，分別加入 IL-4Rα-lytic 和Lytic 溶液（終濃度均為 5 µmol/L），同時對照組加入等體積培養(yǎng)基，37 ℃下處理2 h。離心、冷染色緩沖液洗滌后，用 100 µL 結合緩沖液重懸細胞。每管依次加入 0.5 µL Annexin Ⅴ-APC 和 1 µL PI，室溫下避光 15 min，加 400 µL 結合緩沖液，混勻，上機檢測細胞的凋亡情況。實驗重復3次。
將熒光素酶標記的 BCBL-1 細胞經(jīng)腹腔注射至NOD/SCID小鼠體內(nèi)（注射劑量為1×107個細胞/只），建立小鼠異種移植模型。細胞植入后第9天，小鼠腹腔注射熒光素底物（150 mg/kg），利用活體生物發(fā)光成像技術檢測小鼠體內(nèi)腫瘤的生長情況。隨后，將具有相似信號強度的荷瘤小鼠隨機分成 PBS 組（對照組）和 IL-4Rα-lytic 組（4 只/組），經(jīng)腹腔分別注射PBS 和 IL-4Rα-lytic（5 mg/kg），每周 3 次，連續(xù) 3 周。在藥物治療過程中，每 2~3 d 稱量一次小鼠體質(zhì)量。3周后，再次進行活體光學成像檢測移植瘤的大小，然后經(jīng)尾靜脈取血，用全自動血液分析儀進行血液分析。第 23 天時處死小鼠，切取肺、肝和腎組織標本，經(jīng)固定、石蠟包埋、H-E染色后，在正倒置一體熒光顯微鏡下觀察并拍照。
采用 GraphPad Prism 6 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以xˉ±s 表示，組間差異比較采用t檢驗，以P<0.05或P<0.01表示差異有統(tǒng)計學意義。
2 結果
隨后，檢測了IL-4Rα-lytic不同處理時間的殺傷效果，結果（圖 1B）顯示，5 µmol/L 的 IL-4Rα-lytic 可在 10 min 內(nèi)誘導 60% 以上的 KSHV 陽性 PEL 細胞BCBL-1 和 BCP-1 死亡（均 P<0.01），而 5 µmol/L 的Lytic處理相同時間未造成明顯的細胞死亡。這一殺傷水平未隨著時間增加而增強，提示IL-4Rα-lytic對KSHV陽性PEL細胞的殺傷主要是通過IL-4Rα-lytic穿膜而導致的快速殺傷。
實驗結果表明，IL-4Rα-lytic可顯著抑制BCBL-1細胞小鼠移植瘤的生長，且無明顯的毒副作用。
3 討 論
PEL惡性程度高、預后較差、長期生存者少，目前主要采用CHOP方案化療和逆轉(zhuǎn)錄病毒治療法聯(lián)用進行治療。但是，常規(guī)治療所用藥物在殺傷腫瘤細胞的同時也會對正常細胞產(chǎn)生殺傷，同時腫瘤細胞的耐藥性也影響著治療效果。此外，PEL不常見，臨床研究多局限于個案報道，可用的特效藥物少，因此研發(fā)新型的毒副作用小的靶向治療藥物并探究其作用機制對于治療PEL意義重大。
總之，本研究提供了一種針對PEL的特異性強、安全性高的靶向融合肽 IL-4Rα-lytic，為進一步的動物實驗和PEL的治療提供了新的思路和實驗基礎。
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