摘 要 本文綜述了表面展示肽在無機納米材料合成與組裝中的應(yīng)用。表面展示肽是利用噬菌體、細胞等表面展示技術(shù)篩選出來的一類多肽 ,可以特異性地識別不同的無機物表面。一方面它們能夠誘導不同種類無機納米材料的合成 ,有助于我們進一步認識生物礦化的過程和基本原理 ;同時表面展示肽也可以用于無機納米材料的組裝 ,構(gòu)建具有特定功能的納米結(jié)構(gòu) ,從而為納米器件的構(gòu)造提供新的途徑。
蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)具有重要功能的一類生物分子 ,研究蛋白質(zhì)與無機物底物的表面相互作用是理解生物礦化過程的關(guān)鍵所在[1 —3 ] 。傳統(tǒng)的研究方法是分離純化生物礦化過程中起主要作用的蛋白 ,進而研究它們在體外條件下對無機礦物生長的誘導作用 ,從而從分子生物學水平上理解生物礦化過程[4 - 6 ] 。但是由于生物體系的復(fù)雜性 ,蛋白提取純化過程中易受到所提取組織中其它蛋白的干擾 ,因此目前還無法實現(xiàn)對與生物礦化相關(guān)的大多數(shù)蛋白的分離和結(jié)構(gòu)鑒定。隨著理論計算化學的發(fā)展 ,人們可以通過理論計算模擬多肽分子和無機物表面的相互作用[7 ,8 ] 。但由于這種模擬方法中需要將無機物表面看成是理想的單晶表面 ,而在實際生物體系中無機礦化產(chǎn)物有可能是多晶態(tài)甚至是非晶態(tài)。近年來 ,研究者開始采用噬菌體和細胞等表面展示技術(shù)篩選與無機物有識別作用的多肽[9 ,10 ],這種表面展示肽一方面可以使我們進一步理解生物礦化過程 ,同時也為無機納米材料的合成與組裝提供了新的機遇。
2 識別無機物的表面展示肽
表面展示是一種新的基因操作技術(shù)[11 ], 它使表達的多肽以融合蛋白形式展現(xiàn)在噬菌體或細胞表面 , 從而使多肽保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性 ,有利于研究多肽 (蛋白質(zhì)) 的性質(zhì)、相互識別和相互作用 , 并由此從展示庫中篩選出特定功能的多肽 ,即表面展示肽。大量研究結(jié)果表明 ,生物分子和無機物的相互作用在生物礦化過程中扮演著重要角色 ,利用表面展示技術(shù)篩選出與無機物有特異性識別作用的多肽無疑將可以使我們更深入地了解認識生物礦化過程。
Belcher 等[9 ] 利用大約 119 ×109 個有相同氨基酸數(shù)目(7 或 12 個氨基酸) 的噬菌體 M13 的 p Ⅲ展示庫與無機物作用(圖 1) ,篩選了與 GaAs 有特異性識別的表面展示肽。首先 ,將噬菌體的隨機肽庫在Tris 緩沖溶液中與無機物混合 ,使在 p Ⅲ展示中的多肽能夠與無機物表面發(fā)生作用。經(jīng)過一段時間之后 ,與無機物表面有相互作用的多肽噬菌體被吸附在無機物表面 ;再用不同pH 值的 Tris 緩沖溶液洗脫有相互作用的多肽噬菌體。對洗脫下來的噬菌體進行擴增 ,將得到的擴增體系即新的“噬菌體肽庫”再與無機物作用。最后 ,經(jīng)過 3 —5 輪的“吸附2洗脫2擴增”過程 ,便可得到含有一種或幾種多肽肽序的“噬菌體肽庫”。分析這個肽庫中噬菌體的 p Ⅲ蛋白的編碼基因 ,可以得到與無機物有特異性識別作用的多肽肽序[12 ] 。從篩選的過程可以看出表面展示肽的篩選首先要求展示肽庫中必須存在能夠與無機物產(chǎn)生特異性識別的多肽 ,因此構(gòu)建出有效的展示肽庫是表面展示肽篩選成功的必要前提。
研究者也嘗試了利用細胞表面展示肽庫[10 ] 和酵母表面展示肽庫[13 ,14 ]來篩選可以識別特定無機物的多肽。通過對所得到的表面展示肽的分析發(fā)現(xiàn) ,與不同無機物產(chǎn)生識別作用的表面展示肽中存在特殊的氨基酸序列 ,某些物質(zhì)還存在有特定的識別基序(motif) ,這一結(jié)果為人們設(shè)計可與無機物產(chǎn)生特異性識別的多肽分子提供了重要的依據(jù)。研究證明通過表面展示技術(shù)獲得的部分表面展示肽與生物體系中誘導礦化過程的蛋白質(zhì)氨基酸序列相同或相似 ,為在人工條件下模擬和研究生物礦化的過程提供了一種有效的途徑。表 1 給出了目前已經(jīng)篩選出的對一些無機物有識別作用的表面展示肽序列。
3 表面展示肽識別無機物的機制
研究結(jié)果表明表面展示肽與無機物底物的識別包含化學[31 ] (例如偶極和電荷效應(yīng)) 和物理[32 ] (例如尺寸大小和形貌匹配) 兩方面機制。
Belcher 等[9 ]首先研究了含有 12 個氨基酸殘基的噬菌體展示肽與 GaAs(100) 晶面的相互作用。發(fā)現(xiàn)隨著擴增次數(shù)的增加 ,得到的表面展示肽中極性氨基酸殘基的平均含量逐漸增加 ,超過了其在整個隨機肽庫中所占的比例 ,表明極性氨基酸殘基在多肽與 GaAs (100) 晶面的相互作用中起到了主要作用。隨后的研究發(fā)現(xiàn) ,對于其它的半導體材料和部分磁性材料 ,如 ZnS[16 —18 ] 、CdS[16 ,18 ] 、PbS[16 ] 、FePt[18 ,19 ]和 CoPt[18 ],所篩選出的表面展示肽大部分也是由極性氨基酸殘基所構(gòu)成的。
對與貴金屬有識別作用肽的篩選 ,首先是用細胞表面展示技術(shù)進行的。以金為例 ,篩選出的肽序是 MHGKTQATSGTIQS[20 ,21 ],分析這段肽序可以得出一個有趣的結(jié)論 :這段肽主要是由一些含有羥基的氨基酸 ,如絲氨酸(S) 、蘇氨酸(T) 以及含有疏水側(cè)鏈的氨基酸組成 ,而人們通常認為與金屬有強相互作用的半胱氨酸(C) 、甲硫氨酸(M) 、組氨酸(H) 和色氨酸(W) 含量很低。雖然 C、M、H 和 W 含量的增加可以大大增強肽與底物的作用力[14 ],但從篩選的“吸附2洗脫2擴增”過程來看 ,強的相互作用力在增加了多肽與底物的吸附能力同時 ,也將使“洗脫”過程變得更加困難。采用噬菌體等其它的表面展示技術(shù)篩選對金有識別作用的多肽序列也得到了相同的結(jié)論 ,表明所得到的表面展示肽序列是由所使用的底物種類所決定的 ,而與采用何種表面展示技術(shù)無關(guān)。
對于 CaCO3[30 ] 來說 ,其識別多肽主要包含不帶電荷的氨基酸殘基或堿性氨基酸殘基 ;而與其它無機物 ,例如金屬氧化物[24 —26 ] 、GeO2[27 ] 、SiO2[28 ] 和沸石[27 ]等有識別作用的多肽主要由堿性氨基酸殘基和含羥基氨基酸殘基所構(gòu)成。總的來說 ,堿性氨基酸殘基在多肽與無機物表面的相互作用中起到了主要的作用。多肽中堿性氨基酸殘基側(cè)鏈的羥基、氨基、巰基、酰胺基等功能基團作為 Lewis 堿提供電子與無機底物中的 Lewis 酸受體作用 ,其它的氨基酸殘基則主要起調(diào)節(jié)多肽的電荷和極性等作用。
表面展示肽不僅可以識別不同種類的無機納米材料 ,而且能夠區(qū)分大小、形貌或晶體結(jié)構(gòu)不同的同一種類無機納米材料。例如 ,展示肽 Z8 和 A7 就分別識別兩種不同尺寸 (4 nm 和 2 nm) 的 ZnS 納米粒子[16 ] ; GaAs ( 100) 晶面的展示肽與 GaAs ( 111) B(arsenic terminated) 晶面的作用較弱[9 ] 。
多肽的結(jié)構(gòu)對其與底物的識別過程也會產(chǎn)生影響。展示肽中非極性氨基酸的存在不僅能調(diào)節(jié)多肽與底物相互作用力的強弱 ,而且能使多肽序列保持一定的空間構(gòu)象 ,這就要求底物必須具有特定的結(jié)構(gòu)才能與之匹配。Sarikaya 等[10 ,33 ] 利用分子模擬給出了金的結(jié)合肽在 Au (111) 和 (112) 表面的折疊狀態(tài) ,如圖 2 所示。結(jié)合肽具有反平行的β折疊結(jié)構(gòu) ,其周期性的 OH —功能基團正好與 Au (111) 面的晶格相匹配 ,而與 Au (112) 面卻不匹配。
由上可見多肽和無機底物的識別是一個復(fù)雜的過程 ,受到納米材料的尺寸、電荷、極性和晶體結(jié)構(gòu)等諸多因素的影響 ,是化學和物理兩方面機制共同作用的結(jié)果。
4 表面展示肽在無機納米材料合成中的應(yīng)用
對生物礦化過程的研究表明 ,在生物礦化過程中形成了大量具有納米結(jié)構(gòu)的礦物質(zhì)。通過對分離純化的礦化蛋白的結(jié)構(gòu)分析 ,人們發(fā)現(xiàn) ,在同種物質(zhì)的礦化蛋白中存在許多序列相同或相近的多肽基序 ,表明多肽基序在生物礦化過程中起著重要的作用。這些基序可以有效地誘導納米材料的生成 ,是礦物質(zhì)析出的成核點。表面展示肽中也存在與礦化蛋白相同或相似的基序 (motif) ,同樣可以誘導無機納米材料的合成。
Belcher 等[16 ] 用 ZnS 的 表 面 展 示 肽 Z8(LRRSSEA2HNSIV) 、A7 (NNPMHQN) 以及與 ZnS 沒有識別作用的隨機肽序進行了 ZnS 納米晶的合成。結(jié)果表明 Z8 和 A7 肽都誘導了單分散的球形 ZnS 納米粒子的生成 ,而隨機肽序合成的則是無規(guī)則形態(tài)的大尺寸 ZnS 粒子 (圖 3) 。電子衍射 ( ED) 分析表明 ,Z8 肽誘導合成的 ZnS 納米晶具有閃鋅礦結(jié)構(gòu) ,A7肽誘導合成的 ZnS 納米晶具有纖維鋅礦結(jié)構(gòu) ,而隨機肽序得到的 ZnS 粒子是非晶結(jié)構(gòu)。Stone 等[23 ] 通過改變合成過程中 Ag 的展示肽 AG4 加入量得到了球形、三角形、六邊形 (圖 4) 的 Ag 納米粒子。鐵磁體L 10相 FePt 的合成通常都需要高溫 ,而 Belcher等[19 ]證明利用 FePt 的表面展示肽在室溫下就可以得到有較高各向異性的 FePt 納米粒子 ,并且發(fā)現(xiàn)展示肽中含有存在于許多生物體礦化鐵磁礦物蛋白中的 motif (2KHLPST2) 。
Sarikaya 等[21 ,34 ] 用 Au 的展示肽 GBP21 (MHG2KTQATSGTIQS) 還原 AuCl3 合成 Au 納米晶。質(zhì)譜結(jié)果表明 ,每個多肽 GBP21 結(jié)合兩個 Au ( Ⅲ) 離子 ,其中一個結(jié)合在序列2QAT2中 ,另一個在肽的 C 末端。由于羧酸是合成 Au 納米晶的常用有機分子 ,因此 ,序列2QAT2很有可能是 Au 的成核位點。進一步的研究發(fā)現(xiàn) ,序列2TQATS2在合成中起到了主要的作用 ,其合成的原理可能是一種酸催化機制。序列附近可作為質(zhì)子給體的氨基酸殘基 ,如絲氨酸 (S) 、蘇氨酸(T) 、賴氨酸( K) 、谷氨酰胺(Q) 、組氨酸(H) 在還原過程中扮演了主要的角色。
我們小組[35 ]研究了 1 —4 聚賴氨酸寡肽誘導的Na2SiO3 水解行為 ,發(fā)現(xiàn) 1 —3 聚賴氨酸寡肽不能有效地誘導 Na2SiO3 水解生成具有特定形態(tài)的 SiO2 粒子 ,而在四聚賴氨酸寡肽 ( KKKK) 存在的條件下 ,Na2SiO3 快速水解 ,生成直徑200 nm左右的 SiO2 粒子(圖 5) 。這表明 ,對于聚賴氨酸 ,四聚體 ( KKKK) 是有效誘導 SiO2 納米粒子生成的最小賴氨酸寡肽片段。賴氨酸是一種 Lewis 堿氨基酸 ,分子中起主要作用的是ε2NH3+ 陽離子基團 ,因此很容易吸引溶液中的 Si —O- 基團 ,導致硅酸的聚合。當聚賴氨酸的鏈長達到四聚以上時 ,聚賴氨酸這種聚電解質(zhì)便很容易在溶液中通過靜電作用等分子間作用力進行自組裝 ,形成硅酸聚合所需的成核和模板位點 ,導致Si —O- 基團迅速聚合 ,從而有效地誘導 SiO2 納米粒子的形成。這也是自然界中蛋白質(zhì)等生物分子誘導硅沉積形成生物礦化硅的基本原理。人們利用 PCR技術(shù)解讀了硅藻硅礦化蛋白 Silaffin 1A 的基因密碼 ,其中賴氨酸2賴氨酸 ( KK) 殘基具有很高的重復(fù)性 ,而且在賴氨酸的殘基上發(fā)現(xiàn)很多氨基衍生物[36 ],并且 SiO2 的表面展示肽也含有最少為四聚的 RRRR或HHHH 片段。因此 ,四聚賴氨酸寡肽 ( KKKK) 也是一種 SiO2 的 motif 。
5 表面展示肽在無機納米材料組裝中的應(yīng)用
生物分子與無機納米材料的偶聯(lián)是利用生物分子進行無機納米材料組裝的前提[37 —39 ] 。傳統(tǒng)的偶聯(lián)方式是先使用雙功能基團一端與無機納米材料直接作用(圖 6) ,如金屬材料的表面多通過巰基作用 ,氧化物表面多通過硅烷偶聯(lián) ,再將生物分子與功能分子的另一端相連接。這種方法雖然也取得了一些成果 ,但可偶聯(lián)的材料種類存在一定的局限性。表面展示肽的特異性識別則對無機物沒有限制 ,這樣不僅增加了可選擇的納米材料的種類 ,而且同時賦予了納米材料單元識別功能以及使組裝的納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有可逆性和協(xié)同性等特性。
Sarikaya 等[22 ]利用識別 Au (111) 的表面展示肽GBP21 ,在金的表面上自組裝形成了有序的單層膜。膜的厚度大約為 015 nm ,近似等于 GBP21β折疊的高度 ,膜中不同的結(jié)構(gòu)域 (domain) 之間出現(xiàn)清晰的60°或者 120°的夾角 ,而 Au (111) 的晶面正好是六重對稱 ,這進一步表明表面展示肽是通過分子識別機制在金的表面上進行自組裝。在隨后的工作中 ,Sarikaya 等[40 ] 又結(jié)合軟 刻 蝕 技 術(shù) ( soft2lithographictechnique) 利用表面展示肽組裝了 Au 納米粒子。首先 ,將 PDMS 印章浸潤在多肽 GBP21 的 PBS 溶液中 ,使多肽 GBP21 吸附在 PDMS 印章上。然后將吸附有表面展示肽 GBP21 的 PDMS 印章 ,分別轉(zhuǎn)印在化學圖案化(MMAPA 的自組裝膜) 和物理圖案化(裸露的Au(111) ) 表面上。AFM 觀察表明多肽 GBP21 在兩種表面都形成了 PDMS 的印章圖案(圖 7) ,但裸露的Au 表面上的多肽結(jié)構(gòu)要松散一些 ,說明通過識別機制的相互作用要弱于化學偶聯(lián)。隨后 ,將 Au 納米粒子溶膠滴加在兩種多肽圖案上浸潤一段時間 ,使Au 納米粒子自組裝到圖案上。結(jié)果發(fā)現(xiàn) ,在裸露的金表面上組裝的納米粒子的數(shù)量要明顯地少于化學圖案化的表面(圖 8) 。這表明多肽 GBP21 與金的作用可能是受空間構(gòu)象影響的 ,多肽 GBP21 與圖案化的 Au (111) 面作用后沒有更多的空間位置再與 Au納米粒子作用 ;而在化學圖案化 (MMAPA) 表面上 ,由于只是部分的氨基與 MMAPA 縮合成鍵 ,并沒有破壞多肽 GBP21 的空間構(gòu)象 ,因此 GBP21 仍可以與Au 納米粒子發(fā)生相互作用。
從上面的例子可以看出 ,需要兩段或多段展示肽的存在才能夠?qū)崿F(xiàn)兩個納米粒子或多個納米粒子的同時組裝。Belcher 等將 M13 噬菌體的 p Ⅷ蛋白和p Ⅲ蛋白分別修飾成兩種表面展示肽 ,構(gòu)建了 Au 納米粒子的線性陣列以及 Au 和 CdSe 納米粒子的異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)(圖 9) 。這種有序的納米粒子陣列可以作為模板合成具有良好導電特性納米線 ,這種納米線可以在納米電子學器件中尋址和連接獨立的納米結(jié)構(gòu)單元[41 ] 。
6 結(jié)束語
在過去的十幾年里 ,利用 DNA、蛋白質(zhì)、抗原和抗體等生物分子進行無機納米材料的合成和組裝已有很多報道。然而直接利用人工多肽分子進行無機納米材料合成和組裝的研究還相對較少 ,這主要是在目前的研究水平上多肽分子的結(jié)構(gòu)和功能設(shè)計還比較困難。表面展示技術(shù)的出現(xiàn) ,為篩選適用于無機納米材料合成和組裝的多肽提供了新的機遇。從篩選過程來看 ,表面展示肽是模擬生物礦化過程中多肽和無機物底物的特異性識別機制得到的一類多肽。這類多肽分子一方面可以誘導具有特殊結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的納米材料的合成 ,另一方面展示肽分子的引入為無機納米材料的可控組裝提供了新的機遇。
表面展示肽在無機納米材料的合成與組裝中的應(yīng)用在過去幾年里已經(jīng)取得了一定的進展 ,未來的研究工作有以下一些問題還有待進一步解決 :
(1) 表面展示肽的篩選依賴于表面展示庫的容量 ,只有表面展示庫中存在的肽序才有可能被篩選到 ,但過大的展示庫也將使篩選過程變得復(fù)雜。因此建立和選擇更加合適的肽庫是這一領(lǐng)域進一步發(fā)展的重要基礎(chǔ)。
(2) 利用篩選得到的表面展示肽進行無機納米材料的合成實驗 ,研究生物分子和無機物的相互作用過程 ,雖然可以誘導合成一定結(jié)構(gòu)和形貌的無機納米材料 ,但進一步的結(jié)構(gòu)和形貌調(diào)控很大程度依賴于相關(guān)機制的進一步澄清。例如 ,對于金屬納米材料的誘導合成 ,在不同展示肽濃度條件下可能會存在模板和催化兩種作用相互協(xié)同競爭的機制。
(3) 利用表面展示肽進行無機納米材料的組裝 ,目前的研究結(jié)果還是簡單的納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。但展示肽的修飾從原則上可以賦予組裝的納米結(jié)構(gòu)以生物分子的識別性、協(xié)同性、可逆性、自修復(fù)等特性 ,雙功能或多功能的多肽結(jié)構(gòu)的設(shè)計與應(yīng)用 ,可以實現(xiàn)兩種或多種無機納米材料所構(gòu)成的復(fù)雜納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建[9 ,10 ,42 ],為納米器件的發(fā)展提供了新的途徑。
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