摘 要 本文綜述了表面展示肽在無機(jī)納米材料合成與組裝中的應(yīng)用。表面展示肽是利用噬菌體、細(xì)胞等表面展示技術(shù)篩選出來的一類多肽 ,可以特異性地識(shí)別不同的無機(jī)物表面。一方面它們能夠誘導(dǎo)不同種類無機(jī)納米材料的合成 ,有助于我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)生物礦化的過程和基本原理 ;同時(shí)表面展示肽也可以用于無機(jī)納米材料的組裝 ,構(gòu)建具有特定功能的納米結(jié)構(gòu) ,從而為納米器件的構(gòu)造提供新的途徑。
蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)具有重要功能的一類生物分子 ,研究蛋白質(zhì)與無機(jī)物底物的表面相互作用是理解生物礦化過程的關(guān)鍵所在[1 —3 ] 。傳統(tǒng)的研究方法是分離純化生物礦化過程中起主要作用的蛋白 ,進(jìn)而研究它們?cè)隗w外條件下對(duì)無機(jī)礦物生長(zhǎng)的誘導(dǎo)作用 ,從而從分子生物學(xué)水平上理解生物礦化過程[4 - 6 ] 。但是由于生物體系的復(fù)雜性 ,蛋白提取純化過程中易受到所提取組織中其它蛋白的干擾 ,因此目前還無法實(shí)現(xiàn)對(duì)與生物礦化相關(guān)的大多數(shù)蛋白的分離和結(jié)構(gòu)鑒定。隨著理論計(jì)算化學(xué)的發(fā)展 ,人們可以通過理論計(jì)算模擬多肽分子和無機(jī)物表面的相互作用[7 ,8 ] 。但由于這種模擬方法中需要將無機(jī)物表面看成是理想的單晶表面 ,而在實(shí)際生物體系中無機(jī)礦化產(chǎn)物有可能是多晶態(tài)甚至是非晶態(tài)。近年來 ,研究者開始采用噬菌體和細(xì)胞等表面展示技術(shù)篩選與無機(jī)物有識(shí)別作用的多肽[9 ,10 ],這種表面展示肽一方面可以使我們進(jìn)一步理解生物礦化過程 ,同時(shí)也為無機(jī)納米材料的合成與組裝提供了新的機(jī)遇。
2 識(shí)別無機(jī)物的表面展示肽
表面展示是一種新的基因操作技術(shù)[11 ], 它使表達(dá)的多肽以融合蛋白形式展現(xiàn)在噬菌體或細(xì)胞表面 , 從而使多肽保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性 ,有利于研究多肽 (蛋白質(zhì)) 的性質(zhì)、相互識(shí)別和相互作用 , 并由此從展示庫(kù)中篩選出特定功能的多肽 ,即表面展示肽。大量研究結(jié)果表明 ,生物分子和無機(jī)物的相互作用在生物礦化過程中扮演著重要角色 ,利用表面展示技術(shù)篩選出與無機(jī)物有特異性識(shí)別作用的多肽無疑將可以使我們更深入地了解認(rèn)識(shí)生物礦化過程。
Belcher 等[9 ] 利用大約 119 ×109 個(gè)有相同氨基酸數(shù)目(7 或 12 個(gè)氨基酸) 的噬菌體 M13 的 p Ⅲ展示庫(kù)與無機(jī)物作用(圖 1) ,篩選了與 GaAs 有特異性識(shí)別的表面展示肽。首先 ,將噬菌體的隨機(jī)肽庫(kù)在Tris 緩沖溶液中與無機(jī)物混合 ,使在 p Ⅲ展示中的多肽能夠與無機(jī)物表面發(fā)生作用。經(jīng)過一段時(shí)間之后 ,與無機(jī)物表面有相互作用的多肽噬菌體被吸附在無機(jī)物表面 ;再用不同pH 值的 Tris 緩沖溶液洗脫有相互作用的多肽噬菌體。對(duì)洗脫下來的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增 ,將得到的擴(kuò)增體系即新的“噬菌體肽庫(kù)”再與無機(jī)物作用。最后 ,經(jīng)過 3 —5 輪的“吸附2洗脫2擴(kuò)增”過程 ,便可得到含有一種或幾種多肽肽序的“噬菌體肽庫(kù)”。分析這個(gè)肽庫(kù)中噬菌體的 p Ⅲ蛋白的編碼基因 ,可以得到與無機(jī)物有特異性識(shí)別作用的多肽肽序[12 ] 。從篩選的過程可以看出表面展示肽的篩選首先要求展示肽庫(kù)中必須存在能夠與無機(jī)物產(chǎn)生特異性識(shí)別的多肽 ,因此構(gòu)建出有效的展示肽庫(kù)是表面展示肽篩選成功的必要前提。
研究者也嘗試了利用細(xì)胞表面展示肽庫(kù)[10 ] 和酵母表面展示肽庫(kù)[13 ,14 ]來篩選可以識(shí)別特定無機(jī)物的多肽。通過對(duì)所得到的表面展示肽的分析發(fā)現(xiàn) ,與不同無機(jī)物產(chǎn)生識(shí)別作用的表面展示肽中存在特殊的氨基酸序列 ,某些物質(zhì)還存在有特定的識(shí)別基序(motif) ,這一結(jié)果為人們?cè)O(shè)計(jì)可與無機(jī)物產(chǎn)生特異性識(shí)別的多肽分子提供了重要的依據(jù)。研究證明通過表面展示技術(shù)獲得的部分表面展示肽與生物體系中誘導(dǎo)礦化過程的蛋白質(zhì)氨基酸序列相同或相似 ,為在人工條件下模擬和研究生物礦化的過程提供了一種有效的途徑。表 1 給出了目前已經(jīng)篩選出的對(duì)一些無機(jī)物有識(shí)別作用的表面展示肽序列。
3 表面展示肽識(shí)別無機(jī)物的機(jī)制
研究結(jié)果表明表面展示肽與無機(jī)物底物的識(shí)別包含化學(xué)[31 ] (例如偶極和電荷效應(yīng)) 和物理[32 ] (例如尺寸大小和形貌匹配) 兩方面機(jī)制。
Belcher 等[9 ]首先研究了含有 12 個(gè)氨基酸殘基的噬菌體展示肽與 GaAs(100) 晶面的相互作用。發(fā)現(xiàn)隨著擴(kuò)增次數(shù)的增加 ,得到的表面展示肽中極性氨基酸殘基的平均含量逐漸增加 ,超過了其在整個(gè)隨機(jī)肽庫(kù)中所占的比例 ,表明極性氨基酸殘基在多肽與 GaAs (100) 晶面的相互作用中起到了主要作用。隨后的研究發(fā)現(xiàn) ,對(duì)于其它的半導(dǎo)體材料和部分磁性材料 ,如 ZnS[16 —18 ] 、CdS[16 ,18 ] 、PbS[16 ] 、FePt[18 ,19 ]和 CoPt[18 ],所篩選出的表面展示肽大部分也是由極性氨基酸殘基所構(gòu)成的。
對(duì)與貴金屬有識(shí)別作用肽的篩選 ,首先是用細(xì)胞表面展示技術(shù)進(jìn)行的。以金為例 ,篩選出的肽序是 MHGKTQATSGTIQS[20 ,21 ],分析這段肽序可以得出一個(gè)有趣的結(jié)論 :這段肽主要是由一些含有羥基的氨基酸 ,如絲氨酸(S) 、蘇氨酸(T) 以及含有疏水側(cè)鏈的氨基酸組成 ,而人們通常認(rèn)為與金屬有強(qiáng)相互作用的半胱氨酸(C) 、甲硫氨酸(M) 、組氨酸(H) 和色氨酸(W) 含量很低。雖然 C、M、H 和 W 含量的增加可以大大增強(qiáng)肽與底物的作用力[14 ],但從篩選的“吸附2洗脫2擴(kuò)增”過程來看 ,強(qiáng)的相互作用力在增加了多肽與底物的吸附能力同時(shí) ,也將使“洗脫”過程變得更加困難。采用噬菌體等其它的表面展示技術(shù)篩選對(duì)金有識(shí)別作用的多肽序列也得到了相同的結(jié)論 ,表明所得到的表面展示肽序列是由所使用的底物種類所決定的 ,而與采用何種表面展示技術(shù)無關(guān)。
對(duì)于 CaCO3[30 ] 來說 ,其識(shí)別多肽主要包含不帶電荷的氨基酸殘基或堿性氨基酸殘基 ;而與其它無機(jī)物 ,例如金屬氧化物[24 —26 ] 、GeO2[27 ] 、SiO2[28 ] 和沸石[27 ]等有識(shí)別作用的多肽主要由堿性氨基酸殘基和含羥基氨基酸殘基所構(gòu)成�？偟膩碚f ,堿性氨基酸殘基在多肽與無機(jī)物表面的相互作用中起到了主要的作用。多肽中堿性氨基酸殘基側(cè)鏈的羥基、氨基、巰基、酰胺基等功能基團(tuán)作為 Lewis 堿提供電子與無機(jī)底物中的 Lewis 酸受體作用 ,其它的氨基酸殘基則主要起調(diào)節(jié)多肽的電荷和極性等作用。
表面展示肽不僅可以識(shí)別不同種類的無機(jī)納米材料 ,而且能夠區(qū)分大小、形貌或晶體結(jié)構(gòu)不同的同一種類無機(jī)納米材料。例如 ,展示肽 Z8 和 A7 就分別識(shí)別兩種不同尺寸 (4 nm 和 2 nm) 的 ZnS 納米粒子[16 ] ; GaAs ( 100) 晶面的展示肽與 GaAs ( 111) B(arsenic terminated) 晶面的作用較弱[9 ] 。
多肽的結(jié)構(gòu)對(duì)其與底物的識(shí)別過程也會(huì)產(chǎn)生影響。展示肽中非極性氨基酸的存在不僅能調(diào)節(jié)多肽與底物相互作用力的強(qiáng)弱 ,而且能使多肽序列保持一定的空間構(gòu)象 ,這就要求底物必須具有特定的結(jié)構(gòu)才能與之匹配。Sarikaya 等[10 ,33 ] 利用分子模擬給出了金的結(jié)合肽在 Au (111) 和 (112) 表面的折疊狀態(tài) ,如圖 2 所示。結(jié)合肽具有反平行的β折疊結(jié)構(gòu) ,其周期性的 OH —功能基團(tuán)正好與 Au (111) 面的晶格相匹配 ,而與 Au (112) 面卻不匹配。
由上可見多肽和無機(jī)底物的識(shí)別是一個(gè)復(fù)雜的過程 ,受到納米材料的尺寸、電荷、極性和晶體結(jié)構(gòu)等諸多因素的影響 ,是化學(xué)和物理兩方面機(jī)制共同作用的結(jié)果。
4 表面展示肽在無機(jī)納米材料合成中的應(yīng)用
對(duì)生物礦化過程的研究表明 ,在生物礦化過程中形成了大量具有納米結(jié)構(gòu)的礦物質(zhì)。通過對(duì)分離純化的礦化蛋白的結(jié)構(gòu)分析 ,人們發(fā)現(xiàn) ,在同種物質(zhì)的礦化蛋白中存在許多序列相同或相近的多肽基序 ,表明多肽基序在生物礦化過程中起著重要的作用。這些基序可以有效地誘導(dǎo)納米材料的生成 ,是礦物質(zhì)析出的成核點(diǎn)。表面展示肽中也存在與礦化蛋白相同或相似的基序 (motif) ,同樣可以誘導(dǎo)無機(jī)納米材料的合成。
Belcher 等[16 ] 用 ZnS 的 表 面 展 示 肽 Z8(LRRSSEA2HNSIV) 、A7 (NNPMHQN) 以及與 ZnS 沒有識(shí)別作用的隨機(jī)肽序進(jìn)行了 ZnS 納米晶的合成。結(jié)果表明 Z8 和 A7 肽都誘導(dǎo)了單分散的球形 ZnS 納米粒子的生成 ,而隨機(jī)肽序合成的則是無規(guī)則形態(tài)的大尺寸 ZnS 粒子 (圖 3) 。電子衍射 ( ED) 分析表明 ,Z8 肽誘導(dǎo)合成的 ZnS 納米晶具有閃鋅礦結(jié)構(gòu) ,A7肽誘導(dǎo)合成的 ZnS 納米晶具有纖維鋅礦結(jié)構(gòu) ,而隨機(jī)肽序得到的 ZnS 粒子是非晶結(jié)構(gòu)。Stone 等[23 ] 通過改變合成過程中 Ag 的展示肽 AG4 加入量得到了球形、三角形、六邊形 (圖 4) 的 Ag 納米粒子。鐵磁體L 10相 FePt 的合成通常都需要高溫 ,而 Belcher等[19 ]證明利用 FePt 的表面展示肽在室溫下就可以得到有較高各向異性的 FePt 納米粒子 ,并且發(fā)現(xiàn)展示肽中含有存在于許多生物體礦化鐵磁礦物蛋白中的 motif (2KHLPST2) 。
Sarikaya 等[21 ,34 ] 用 Au 的展示肽 GBP21 (MHG2KTQATSGTIQS) 還原 AuCl3 合成 Au 納米晶。質(zhì)譜結(jié)果表明 ,每個(gè)多肽 GBP21 結(jié)合兩個(gè) Au ( Ⅲ) 離子 ,其中一個(gè)結(jié)合在序列2QAT2中 ,另一個(gè)在肽的 C 末端。由于羧酸是合成 Au 納米晶的常用有機(jī)分子 ,因此 ,序列2QAT2很有可能是 Au 的成核位點(diǎn)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn) ,序列2TQATS2在合成中起到了主要的作用 ,其合成的原理可能是一種酸催化機(jī)制。序列附近可作為質(zhì)子給體的氨基酸殘基 ,如絲氨酸 (S) 、蘇氨酸(T) 、賴氨酸( K) 、谷氨酰胺(Q) 、組氨酸(H) 在還原過程中扮演了主要的角色。
我們小組[35 ]研究了 1 —4 聚賴氨酸寡肽誘導(dǎo)的Na2SiO3 水解行為 ,發(fā)現(xiàn) 1 —3 聚賴氨酸寡肽不能有效地誘導(dǎo) Na2SiO3 水解生成具有特定形態(tài)的 SiO2 粒子 ,而在四聚賴氨酸寡肽 ( KKKK) 存在的條件下 ,Na2SiO3 快速水解 ,生成直徑200 nm左右的 SiO2 粒子(圖 5) 。這表明 ,對(duì)于聚賴氨酸 ,四聚體 ( KKKK) 是有效誘導(dǎo) SiO2 納米粒子生成的最小賴氨酸寡肽片段。賴氨酸是一種 Lewis 堿氨基酸 ,分子中起主要作用的是ε2NH3+ 陽離子基團(tuán) ,因此很容易吸引溶液中的 Si —O- 基團(tuán) ,導(dǎo)致硅酸的聚合。當(dāng)聚賴氨酸的鏈長(zhǎng)達(dá)到四聚以上時(shí) ,聚賴氨酸這種聚電解質(zhì)便很容易在溶液中通過靜電作用等分子間作用力進(jìn)行自組裝 ,形成硅酸聚合所需的成核和模板位點(diǎn) ,導(dǎo)致Si —O- 基團(tuán)迅速聚合 ,從而有效地誘導(dǎo) SiO2 納米粒子的形成。這也是自然界中蛋白質(zhì)等生物分子誘導(dǎo)硅沉積形成生物礦化硅的基本原理。人們利用 PCR技術(shù)解讀了硅藻硅礦化蛋白 Silaffin 1A 的基因密碼 ,其中賴氨酸2賴氨酸 ( KK) 殘基具有很高的重復(fù)性 ,而且在賴氨酸的殘基上發(fā)現(xiàn)很多氨基衍生物[36 ],并且 SiO2 的表面展示肽也含有最少為四聚的 RRRR或HHHH 片段。因此 ,四聚賴氨酸寡肽 ( KKKK) 也是一種 SiO2 的 motif 。
5 表面展示肽在無機(jī)納米材料組裝中的應(yīng)用
生物分子與無機(jī)納米材料的偶聯(lián)是利用生物分子進(jìn)行無機(jī)納米材料組裝的前提[37 —39 ] 。傳統(tǒng)的偶聯(lián)方式是先使用雙功能基團(tuán)一端與無機(jī)納米材料直接作用(圖 6) ,如金屬材料的表面多通過巰基作用 ,氧化物表面多通過硅烷偶聯(lián) ,再將生物分子與功能分子的另一端相連接。這種方法雖然也取得了一些成果 ,但可偶聯(lián)的材料種類存在一定的局限性。表面展示肽的特異性識(shí)別則對(duì)無機(jī)物沒有限制 ,這樣不僅增加了可選擇的納米材料的種類 ,而且同時(shí)賦予了納米材料單元識(shí)別功能以及使組裝的納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有可逆性和協(xié)同性等特性。
Sarikaya 等[22 ]利用識(shí)別 Au (111) 的表面展示肽GBP21 ,在金的表面上自組裝形成了有序的單層膜。膜的厚度大約為 015 nm ,近似等于 GBP21β折疊的高度 ,膜中不同的結(jié)構(gòu)域 (domain) 之間出現(xiàn)清晰的60°或者 120°的夾角 ,而 Au (111) 的晶面正好是六重對(duì)稱 ,這進(jìn)一步表明表面展示肽是通過分子識(shí)別機(jī)制在金的表面上進(jìn)行自組裝。在隨后的工作中 ,Sarikaya 等[40 ] 又結(jié)合軟 刻 蝕 技 術(shù) ( soft2lithographictechnique) 利用表面展示肽組裝了 Au 納米粒子。首先 ,將 PDMS 印章浸潤(rùn)在多肽 GBP21 的 PBS 溶液中 ,使多肽 GBP21 吸附在 PDMS 印章上。然后將吸附有表面展示肽 GBP21 的 PDMS 印章 ,分別轉(zhuǎn)印在化學(xué)圖案化(MMAPA 的自組裝膜) 和物理圖案化(裸露的Au(111) ) 表面上。AFM 觀察表明多肽 GBP21 在兩種表面都形成了 PDMS 的印章圖案(圖 7) ,但裸露的Au 表面上的多肽結(jié)構(gòu)要松散一些 ,說明通過識(shí)別機(jī)制的相互作用要弱于化學(xué)偶聯(lián)。隨后 ,將 Au 納米粒子溶膠滴加在兩種多肽圖案上浸潤(rùn)一段時(shí)間 ,使Au 納米粒子自組裝到圖案上。結(jié)果發(fā)現(xiàn) ,在裸露的金表面上組裝的納米粒子的數(shù)量要明顯地少于化學(xué)圖案化的表面(圖 8) 。這表明多肽 GBP21 與金的作用可能是受空間構(gòu)象影響的 ,多肽 GBP21 與圖案化的 Au (111) 面作用后沒有更多的空間位置再與 Au納米粒子作用 ;而在化學(xué)圖案化 (MMAPA) 表面上 ,由于只是部分的氨基與 MMAPA 縮合成鍵 ,并沒有破壞多肽 GBP21 的空間構(gòu)象 ,因此 GBP21 仍可以與Au 納米粒子發(fā)生相互作用。
從上面的例子可以看出 ,需要兩段或多段展示肽的存在才能夠?qū)崿F(xiàn)兩個(gè)納米粒子或多個(gè)納米粒子的同時(shí)組裝。Belcher 等將 M13 噬菌體的 p Ⅷ蛋白和p Ⅲ蛋白分別修飾成兩種表面展示肽 ,構(gòu)建了 Au 納米粒子的線性陣列以及 Au 和 CdSe 納米粒子的異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)(圖 9) 。這種有序的納米粒子陣列可以作為模板合成具有良好導(dǎo)電特性納米線 ,這種納米線可以在納米電子學(xué)器件中尋址和連接獨(dú)立的納米結(jié)構(gòu)單元[41 ] 。
6 結(jié)束語
在過去的十幾年里 ,利用 DNA、蛋白質(zhì)、抗原和抗體等生物分子進(jìn)行無機(jī)納米材料的合成和組裝已有很多報(bào)道。然而直接利用人工多肽分子進(jìn)行無機(jī)納米材料合成和組裝的研究還相對(duì)較少 ,這主要是在目前的研究水平上多肽分子的結(jié)構(gòu)和功能設(shè)計(jì)還比較困難。表面展示技術(shù)的出現(xiàn) ,為篩選適用于無機(jī)納米材料合成和組裝的多肽提供了新的機(jī)遇。從篩選過程來看 ,表面展示肽是模擬生物礦化過程中多肽和無機(jī)物底物的特異性識(shí)別機(jī)制得到的一類多肽。這類多肽分子一方面可以誘導(dǎo)具有特殊結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的納米材料的合成 ,另一方面展示肽分子的引入為無機(jī)納米材料的可控組裝提供了新的機(jī)遇。
表面展示肽在無機(jī)納米材料的合成與組裝中的應(yīng)用在過去幾年里已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展 ,未來的研究工作有以下一些問題還有待進(jìn)一步解決 :
(1) 表面展示肽的篩選依賴于表面展示庫(kù)的容量 ,只有表面展示庫(kù)中存在的肽序才有可能被篩選到 ,但過大的展示庫(kù)也將使篩選過程變得復(fù)雜。因此建立和選擇更加合適的肽庫(kù)是這一領(lǐng)域進(jìn)一步發(fā)展的重要基礎(chǔ)。
(2) 利用篩選得到的表面展示肽進(jìn)行無機(jī)納米材料的合成實(shí)驗(yàn) ,研究生物分子和無機(jī)物的相互作用過程 ,雖然可以誘導(dǎo)合成一定結(jié)構(gòu)和形貌的無機(jī)納米材料 ,但進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和形貌調(diào)控很大程度依賴于相關(guān)機(jī)制的進(jìn)一步澄清。例如 ,對(duì)于金屬納米材料的誘導(dǎo)合成 ,在不同展示肽濃度條件下可能會(huì)存在模板和催化兩種作用相互協(xié)同競(jìng)爭(zhēng)的機(jī)制。
(3) 利用表面展示肽進(jìn)行無機(jī)納米材料的組裝 ,目前的研究結(jié)果還是簡(jiǎn)單的納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。但展示肽的修飾從原則上可以賦予組裝的納米結(jié)構(gòu)以生物分子的識(shí)別性、協(xié)同性、可逆性、自修復(fù)等特性 ,雙功能或多功能的多肽結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)與應(yīng)用 ,可以實(shí)現(xiàn)兩種或多種無機(jī)納米材料所構(gòu)成的復(fù)雜納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建[9 ,10 ,42 ],為納米器件的發(fā)展提供了新的途徑。
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