一、什么是多肽自組裝？
自組裝多肽是指能夠在一定條件下，通過π-π堆積，靜電相互作用等分子間作用力，形成組裝體的多肽類材料。此類材料具有良好的生物相容性和可控性，能夠形成顆粒，纖維和凝膠等納米結構，發(fā)揮特定的形貌學功能，廣泛應用在生物醫(yī)學等領域。自組裝多肽組裝之后形成的形態(tài)通常有球形膠束、囊泡、線狀、帶狀、層狀、柱狀、管狀、球狀和網(wǎng)狀等結構。單體肽分子可自組裝成微納米結構，如納米纖維、納米管、納米囊、納米粒等。自組裝多肽發(fā)現(xiàn)于一次偶然的情況，1993年，Zhang等偶然從酵母蛋白(Yeast protein) 中分離出一個奇怪的重復片段AEAEAKAAEAEAKAK (EAK16)，這種肽可以通過離子互補作用自組裝成納米纖維進而形成水凝膠結構[1]。EAK16因其良好的生物相容性可用于臨床治療、修復神經(jīng)、藥物緩釋等。自此以后，多肽納米自組裝技術進入大眾視野，各個領域的科學家開始著手研究自組裝多肽的功能。
二、自組裝多肽的應用：
8. 人工骨架：自組裝多肽可以用于制備人工骨架，用于支持細胞生長和骨組織的再生。
三、多肽自組裝的形成
以下是自組裝多肽形成的主要過程：
1. 親疏水相互作用：多肽分子通常包含極性和非極性氨基酸殘基。在水性溶液中，極性殘基會朝向水分子，形成氫鍵和離子相互作用，而非極性殘基則會聚集在一起，形成疏水內核。這種親疏水相互作用促進了多肽的自組裝。
2. 氫鍵：氫鍵是一種強大的非共價相互作用，常見于多肽分子之間的氨基酸殘基。氫鍵形成是通過氫原子與帶有電負性的氮、氧或氟原子之間的相互作用。這種氫鍵的形成有助于穩(wěn)定多肽的二級結構，如螺旋和β折疊。
3. 范德華力：范德華力是一種弱的吸引力，由于分子間的臨時電荷不均而產(chǎn)生。雖然每個范德華力相對較弱，但當許多分子之間同時作用時，它們可以在自組裝過程中起到重要作用。
5. 疏水聚集：在水性溶液中，非極性殘基傾向于聚集在一起，形成疏水內核。這種疏水聚集可以驅動多肽的自組裝過程。
6. π-π堆積：在含有芳香族殘基的多肽中，π-π堆積也可能參與多肽的自組裝。這是芳香族環(huán)之間的π電子云相互作用，有助于穩(wěn)定多肽的空間結構。
總的來說，自組裝多肽的形成是一個復雜的過程，受到多種非共價相互作用的共同影響。通過調整多肽的氨基酸序列和環(huán)境條件，可以控制和定向自組裝過程，從而獲得特定結構和功能的自組裝多肽材料。這種自組裝過程在生物學、材料科學和納米技術等領域具有廣泛的應用潛力。
四、自組裝多肽的類型
2. β-寡肽（β-Oligopeptides）：β-寡肽是一類由β氨基酸殘基組成的短多肽鏈。它們能夠通過水合作用形成自組裝結構，通常形成纖維狀或膠束狀的聚集體。
3. 螺旋多肽（Helical Peptides）：螺旋多肽是一類能夠形成螺旋結構的自組裝多肽。螺旋多肽通常通過氫鍵相互作用穩(wěn)定二級結構，形成纖維狀或膜狀的自組裝體。
4. 膠束形成多肽（Micelle-forming Peptides）：這類多肽能夠在水性環(huán)境中形成膠束結構，其中疏水殘基聚集在內核，而親水殘基則朝向水相。
5. 水凝膠形成多肽（Hydrogel-forming Peptides）：水凝膠形成多肽可以在水性環(huán)境中自組裝形成凝膠狀結構。這類多肽通常具有優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性，用于組織工程和生物醫(yī)學應用。
6. 共價交聯(lián)自組裝多肽（Covalently Crosslinked Peptides）：這類多肽通過共價鍵交聯(lián)形成穩(wěn)定的結構。在自組裝過程中，多肽分子之間的功能基團會發(fā)生化學反應，形成共價鍵，從而構建長范圍的自組裝結構。
7. 人工蛋白質（Artificial Proteins）：科學家們可以通過合成特定的氨基酸序列來設計人工蛋白質，這些人工蛋白質具有特定的自組裝性質，可用于納米技術、藥物輸送和生物材料等領域。
8. 離子互補性多肽：離子互補性多肽的特征是帶負電的氨基酸殘基和帶正電的氨基酸殘基交替排列，通過靜電相互作用、氫鍵、范德華力來啟動分子自組裝。其親水區(qū)和疏水區(qū)交替排列，分成兩個有序的區(qū)域，疏水氨基酸殘基折疊屏蔽水分子，親水區(qū)具有規(guī)則有序的正負電荷相互吸引。分子間氫鍵的形成加速了肽的自組裝，離子鍵的相互嵌合使自組裝結構強度增加。該類肽形成模式：Ⅰ型(−+)；Ⅱ型(−−++)；Ⅳ型(−−−−++++)。通過重復和結合電荷分布可合理設計離子互補性肽。目前，RADA16-I作為經(jīng)典的離子互補性多肽，其在水溶液中自發(fā)地形成纖維水凝膠的能力已經(jīng)用于生物醫(yī)學和臨床領域，但同時，RADA16-I也暴露出大多數(shù)此類肽的通病，即在低pH時造成不穩(wěn)定性。為了進一步鞏固離子互補肽在醫(yī)學上的應用，科學家們已經(jīng)致力于“改裝”此類肽。Zhang等開發(fā)了一種新的設計模式，以Ac-RVQVRVQVRVQVCOOH(Z1) 為例，Z1的設計與傳統(tǒng)的設計理念不同：在帶正電的氨基酸和負電的氨基酸中間穿插極性未帶電的氨基酸保持電荷分離并在N端酰化，與傳統(tǒng)離子互補性多肽相比，Z1在形成纖維的能力以及水凝膠的機械強度上都優(yōu)于前者，并在全pH (0-14) 中不影響Z1通過鹽觸發(fā)形成β-折疊結構的自組裝。此外，為了更好地完善離子互補性多肽的優(yōu)點，近期已有研究表明，在生理pH條件下，帶有相反電荷的兩種離子互補性多肽驅動生成的水凝膠表現(xiàn)出對成纖維細胞更好的生物相容性，再一次證明了水凝膠在生物醫(yī)學中應用的潛力。離子互補性多肽是自組裝肽的研究起點，揭開了廣大科研工作者研究自組裝肽的序幕。
9. 表面活性劑類多肽：為了進一步完善離子互補性多肽的特點，人們開始致力于改變疏水作用力來進一步研究親水氨基酸和疏水氨基酸的比例關系，表面活性劑類多肽(Surfactant-like peptides，SLP) 就此產(chǎn)生。SLP有一個顯著的特征：模擬多肽聚合與表面活性劑分子的性質，該肽分為疏水區(qū)和親水區(qū)。親水頭部一般由1-2個帶電的氨基酸殘基(His、Asp、Glu) 組成。疏水尾部一般由3-9個非極性氨基酸(Ala、Phe、Ile、Val) 組成。一般來說疏水尾部不會超過9個氨基酸，因為過多的疏水氨基酸會影響此類肽在介質中的溶解度。SLP可組裝成納米管、納米囊、納米纖維結構。Wang等揭示了傳統(tǒng)SLP (A3K、A6K、A9K) 在水溶液中的自組裝形態(tài)與趨勢，A3K會自組裝成膜結構，A6K組裝成納米纖維結構，A9K會組裝成直徑更小的納米棒狀結構，同時賴氨酸的存在賦予了這3種肽抗菌效力。由此可見，增加疏水鏈長度會影響肽動態(tài)自組裝的趨勢或自聚行為，此外，以上研究都是使用親水氨基酸作為頭部搭配不超過9個氨基酸的疏水尾，這就證明了疏水鏈長度要適當，太長會降低肽在水溶液中的溶解度，太短又會導致自聚集的可能性變小，所以合理設計頭部基團與疏水尾的長度可以獲得合適的表面活性劑類多肽。當然，SLP并不拘泥于形成特定的結構模式，Mello LR及同事討論了不同兩親性設計所引起的肽納米形貌的改變，其設計的雙嵌段八聚體肽FFFFRRRR-NH2與對照肽RRFFFFRR-NH2分別形成球狀膠束以及納米帶結構。FFFFRRRR-NH2形成膠束的原因可能是靜電斥力導致的β-折疊結構含量的降低，這種情況下氫鍵的支持力減弱，維持組裝體的疏水作用力可能是主要作用力，當疏水作用力的作用超過氫鍵時，為了適應球形界面的曲率要求，肽粒子結合朝向球狀轉變。而對于RRFFFFRR-NH2形成納米帶的原因可能是當Arg兩側分布時，氨基端羧基端都會形成有序的水平面，在Phe提供的疏水力驅動肽鏈側向結合，從而延展為納米帶形貌。另外Zhao等所設計的SLP (I2K2I2、I4K2、KI4K) 通過改變序列排列設計不同納米結構體，其中I4K2、KI4K分別形成納米纖維與納米管，而I2K2I2卻因缺乏β-折疊沒有形成納米結構，這證明了β-折疊結構的側向堆積與氨基酸側鏈之間的相互作用有利于納米結構的形成。通過添加陽離子殘基可賦予SLP類似表面活性劑抗菌的能力。高抑菌性、低毒性、低成本似乎已成為此類肽的標簽。對于未來抗菌肽和細胞穿透肽的發(fā)展，添入SLP的設計因素或許具有明朗的應用前景
由于SLP表面極性親水面與非極性疏水面在多肽螺旋輪中均勻分布，因此兩親性成為這類肽組裝過程的重要參數(shù)，它不僅可以調節(jié)疏水引力將多肽聯(lián)結在一起，還可以通過兩親性設計調節(jié)SLP所涉及的不同細胞反應。SLP雖沒有離子互補性多肽作為緩釋功能的應用強，但SLP對于各領域的應用潛力較高，其結構設計簡單、生產(chǎn)成本較低、生物相容性不亞于離子互補性多肽的特點，會使其在不久的將來廣泛應用于生物醫(yī)藥領域。
10. 化學基團修飾類多肽：近年來，科學家們已經(jīng)不滿足于通過對天然氨基酸的改變來設計自組裝多肽，而是使用高度疏水的烷基鏈、脂質基團以及糖類等修飾多肽�；瘜W基團修飾多肽已被證明是可行的�；瘜W基團修飾多肽表現(xiàn)出二級結構增多從而使納米體更加穩(wěn)定�；瘜W基團可以通過在肽鏈本身設計相應的功能區(qū)域發(fā)揮特定的作用。目前，關于疏水烷基鏈兩親性多肽自組裝的工作被廣泛報道。疏水作用力作為驅動分子自組裝的核心力，通過在氨基端設計連接烷基碳鏈，可以使此類肽的功能和性質發(fā)生改變。Otsuka等討論了C16-W3K的疏水性烷基尾部長度和其他外部因素對C16-W3K溶液凝膠行為的影響，C16-W3K可形成α-螺旋結構，結果表明，較長的烷基化尾促進了C16-W3K多肽溶液的自組裝，該脂肽(Lipopeptide) 分子可以逐漸從球狀結構轉變成蠕蟲狀最終變?yōu)槟z狀。遺憾的是，此文獻未闡明納米結構轉變的機制，但脂質尾的偶聯(lián)被證明確實增加了自組裝趨勢。在此基礎上，Hasan等的工作也表明尾長是影響自組裝的主要因素，脂肽的抗菌活性也明顯依賴于尾長，并且多肽形成膠束結構具有更優(yōu)的抗菌效果。許多烷基化的兩親性多肽自組裝成直徑約為幾納米、長度約為幾微米的圓柱形納米纖維，還有少數(shù)可形成巨大納米帶。筆者在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，并不是連接脂質尾就可以促進多肽分子自組裝，在中性條件的水溶液中，脂質尾長度C8及以下以及C18以上并不會促進多肽自組裝進程，反而在水溶液中多肽顯示出無序結構，由此可見，適當?shù)闹|尾對于多肽組裝成穩(wěn)定的有序結構是具有積極作用的，可根據(jù)改變不同脂肪鏈的長度和正電荷數(shù)從而影響脂肽分子生物學活性。疏水作用力過強或過弱可能會影響氫鍵的生成和穩(wěn)定，從而導致納米結構的崩裂。
眾所周知，設計脂肽分子并不僅僅局限于連接碳鏈，棕櫚�；�(Palmitoyl)、肉豆蔻酸(Myristic acid) 等脂質基團也是很好的選擇。專肽生物有研究表明，人α-防御素5 (HD5) 通過在C端肉豆蔻�；纬傻募{米宿主防御肽(Host defense peptide) 表現(xiàn)出比HD5單體更強的體外殺菌效果以及自組裝行為，這種納米自組裝體在小鼠體內實驗中成功治療由大腸桿菌Escherichia coli ATCC25922引起的膿毒癥(Sepsis)，并表現(xiàn)出相當?shù)偷募毎拘院腿苎钚�，這為維持腸道動態(tài)平衡以及減少炎癥反應提供了理論基礎。到目前為止，人們致力于合成具有可控結構的糖肽聚合物用于開發(fā)新型生物材料。Qi等設計了一種殼聚糖-肽偶聯(lián)物，它是由殼聚糖(Chitosan) 主鏈與一條抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs) 和另外一條酶裂解肽組成(CPC-1)，CPC-1起初會在聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG) 的誘導下形成納米顆粒，然后在多種細菌分泌的明膠酶的切割下，CPC-1會自發(fā)地轉變?yōu)槔w維結構，當被明膠酶切割時，CPC-1被裂解致使由殼聚糖與PEG穩(wěn)定的納米顆粒完成解體，AMPs被暴露出來，完成殺菌過程。被化學修飾的多肽已表現(xiàn)出更加優(yōu)異的應用于疾病診斷、臨床醫(yī)學的潛力。天然肽的缺點日益凸顯，如何優(yōu)化天然肽形成納米肽，并發(fā)揮出納米肽的優(yōu)勢已成為科研人員的當務之急。文中闡述的3種納米多肽類型為納米肽的設計提供了新的思路。
五、影響多肽自組裝的因素
1. pH值
多肽的自組裝的重要核心驅動力是分子之間形成氫鍵。但氫鍵的形成易受pH的影響，改變溶液的pH會使肽鏈的C端和N端或一些化學基團出現(xiàn)正電化或負電化。這就意味著肽鏈形成帶正負電荷的多肽，從而表現(xiàn)出不同的自組裝趨勢、納米結構和結構功能特點。Chen等設計了帶有不同長度的組氨酸AMPs：WH5(QL)6K2、WH7(QL)6K2和WH9(QL)6K2。3種AMPs都可在中性pH下形成基于β-折疊誘導的納米纖維結構，當pH低于組氨酸的pKa時，靜電斥力導致納米結構的解體，實驗表明，當pH較低時，組氨酸發(fā)生質子化，賴氨酸與組氨酸形成靜電斥力，納米結構解體轉為單體AMPs分子，引起細菌膜的裂解。此項研究為以細菌代謝產(chǎn)生的乳酸引起的局部感染輸送pH響應性藥物提供了理論基礎。
最近的研究表明，兩條膠原模擬肽(CMPS) NapFFGKO和NapFFGDO會通過pH切換實現(xiàn)溶膠到凝膠的轉變，當pH為生理條件下時，兩條肽都不會形成凝膠，當pH為9.0時，陰離子與NapFFGKO的胺基通過分子間締合誘導凝膠的形成，當pH為5.0時，去質子化的NapFFGDO又會與正離子結合形成凝膠，有趣的是，當兩條肽聚合一起又可以在生理pH下共組裝成水凝膠，由此可見，靜電相互作用對于多肽的聚合產(chǎn)生了顯著的影響。
pH值對于富含帶電的氨基酸肽序列(如Glu、Asp、Lys、His和Arg) 至關重要，并對氫鍵的形成與多肽首尾基團的呈電化具有顯著影響。因此通過控制pH，可以合理地設計基于不同酸堿度的具有釋放藥物、緩釋等應用的自組裝多肽。
2. 肽濃度
濃度是寡肽的自組裝聚合的重要參數(shù)，濃度研究可以確定寡肽開始聚集的臨界聚集濃度(Critical aggregation concentration，CAC)。寡肽在CAC下以單體分子形式存在，高于CAC時開始聚集。肽濃度高于臨界膠束濃度(Critical micelle concentration，CMC) 時，肽分子之間才發(fā)生締結作用。Fung等探究了EAK16-Ⅱ的自組裝隨濃度變化而變化的過程。原子力顯微鏡(Atomic force microscopy，AFM) 顯示當濃度為0.05 mg/mL時，溶液中觀察到一條條孤立的細絲以及少量的球狀聚集體。在濃度為0.1、0.2、0.5 mg/mL的溶液中發(fā)現(xiàn)有細長的纖維，當濃度低于0.1 mg/mL時，觀察到的納米結構(即纖維、細絲和球狀聚集體) 的數(shù)量減少，纖維寬度也隨濃度的變化而變化。Chang等設計了一種用肝素(Heparin) 結合成的自組裝肽兩親性分子(PA)，序列為AKKARKAKKARK，該肽通過自身的疏水性和β-折疊結構可形成直徑為7-10 nm的圓柱形結構，當濃度達到CMC時，兩親性多肽表現(xiàn)出更強的殺滅革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria) 的能力。最近的研究表明α-糜蛋白酶(α-chymotrypsin) 吸附在KLOEt表面可以控制寡肽的自組裝，當寡肽到達CAC時可形成幾納米的纖維網(wǎng)絡，α-糜蛋白酶的表面密度介導了寡肽的自組裝動力學，得出的結論是多肽的聚集濃度與酶濃度呈負相關。在該酶促自組裝系統(tǒng)中，低濃度和中濃度的多肽傾向于α-螺旋，而高濃度的多肽又轉變?yōu)棣?折疊，但所有濃度的多肽都有形成纖維網(wǎng)絡的趨勢，只是形成自組裝體的時間不同。
濃度的改變導致氫鍵等非共價鍵力的含量發(fā)生改變，這會引起肽分子之間電子云重排，進而引起納米形貌的改變，此外，致密的纖維網(wǎng)絡表面可能與水等溶劑發(fā)生協(xié)同作用從而使納米結構更加穩(wěn)定，這為自組裝生物傳感器功能材料的發(fā)展提供新的視野。
3. 離子濃度
離子濃度向來是影響肽分子堆積和蛋白質性質結構功能的重要因素，鹽離子的存在會使帶電荷的基團產(chǎn)生屏蔽作用，從而使分子之間的靜電作用減弱。電荷屏蔽作用還會引起分子間疏水鍵作用力的增強，使肽分子更容易聚合引起自組裝。離子還會與個別氨基酸序列特異性識別并作用，在極性氨基酸中構成鹽橋，從而通過分子間的物理交聯(lián)促進自組裝結構生成。
Hong等研究了NaCl對EAK16-I (AEAKAEAKAEAKAEAK) 的自組裝的影響。在鹽離子存在的條件下，平臺處的表面張力值大約為55 MJ/m2，在鹽離子不存在的條件下，平臺處的表面張力值大約為57 MJ/m2，由此可見在鹽離子存在的條件下，EAK16-Ⅰ的自組裝表面活性要高于無鹽離子存在時。在NaCl存在且肽濃度相同時，EAK16-Ⅰ形成不同于無NaCl形成的球狀結構的纖維。鹽離子的存在可能有利于纖維納米結構的產(chǎn)生。Ozbas等研究了MAX1有無鹽離子的構象顯示，在肽濃度(< 2 wt%)、溫度都相同時，pH為7.4無鹽的情況下，肽分子呈現(xiàn)無序結構。在溶液中添加少量的鹽后，離子與帶電荷氨基酸的靜電相互作用使MAX1迅速形成β-發(fā)夾結構并隨后形成β-折疊。發(fā)夾分子通過疏水塌陷和氫鍵超分子組裝成三維水凝膠網(wǎng)絡。由于多種離子在體內具有調控細胞新陳代謝、維持血管內外離子平衡以及促進骨質發(fā)育等作用，基于離子濃度響應的自組裝多肽在醫(yī)學領域具有廣泛的應用潛能。
4. 溫度
Tiné等的研究結果表明, 其設計的四離子肽RWDW的自組裝過程受溫度的影響很大，在15 ℃和25 ℃時，四肽形成緊密且相互纏繞的纖維，當溫度上升至35 ℃，纖維結構崩裂且線條相聚較遠，此外25 ℃顯示的纖維層也逐漸弱化，在所研究的3種溫度下，分子聚集體的形態(tài)與解聚過程都有所差異。由此可見，升高溫度后，多肽自身的氫鍵發(fā)生斷裂，二級結構發(fā)生改變，疏水作用力和π水作堆積成為主要推動分子自組裝的作用力，這會導致納米結構的轉變。當溫度返還時，氫鍵重新生成，二級結構恢復，自組裝多肽的納米形態(tài)隨之恢復。
5. 手性
