摘 要 由于在蛋白質(zhì)分離、生物傳感器、疾病診斷和治療以及基礎(chǔ)的生物醫(yī)藥研究等領(lǐng)域的潛在重要應(yīng)用 ,合成受體與短肽(3 —20 氨基酸殘基) 相互作用的研究已引起了人們的關(guān)注。本文綜述了近年來(lái)合成受體與短肽相互作用的研究進(jìn)展 ,介紹了小分子受體與個(gè)別氨基酸殘基的相互作用 ,小分子受體對(duì)短肽的序列選擇性識(shí)別 ,小分子受體對(duì)短肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)與識(shí)別以及高分子受體與短肽的相互作用 ,并對(duì)短肽受體的設(shè)計(jì)進(jìn)行了建議與展望。
在很長(zhǎng)的一段時(shí)間里 ,人們對(duì)于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用始終存在這樣一種認(rèn)識(shí) ,即酶-底物及其抑制劑、抗原-抗體、激素-受體等蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成 ,是相互作用的兩個(gè)分子間整個(gè)互補(bǔ)界面的相互作用 ,是整體空間構(gòu)象的識(shí)別與契合。也就是說(shuō) ,兩者的結(jié)合涉及較大的一個(gè)空間 ;參與結(jié)合的氨基酸殘基不是線(xiàn)性肽段 ,而是在一級(jí)結(jié)構(gòu)上相距較遠(yuǎn) ,但又共同構(gòu)成一個(gè)適合于結(jié)合的立體結(jié)構(gòu)。這種觀(guān)點(diǎn)在很多的蛋白質(zhì)復(fù)合體中得到證實(shí)[1 —3 ] 。隨著對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面研究的深入 ,很多文獻(xiàn)又報(bào)道了蛋白質(zhì)相互作用中的結(jié)構(gòu)[4 —8 ] 、能量[6 , 9 ] 、電性互補(bǔ)[10 ]及動(dòng)力學(xué)等方面的研究結(jié)果 ,為深入研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用打下了基礎(chǔ)。
近年來(lái)蛋白質(zhì)間相互作用研究的一個(gè)重要突破在于蛋白質(zhì)表面“熱點(diǎn) ( hot spots) ”的確定 ,所謂的“熱點(diǎn)”是位于或接近蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面幾何中心的一個(gè)約 600A2 的區(qū)域 ,如圖 1 所示。構(gòu)成“熱點(diǎn)”的殘基對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的穩(wěn)定性起重要的作用[11 —14 ] 。Wells 等發(fā)現(xiàn) ,改變熱點(diǎn)區(qū)域內(nèi)某些氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)的親和行為影響較大 ,而熱點(diǎn)周?chē)臍埢鶆t對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物的穩(wěn)定性貢獻(xiàn)較小[15 ] 。研究還發(fā)現(xiàn)在熱點(diǎn)區(qū)域內(nèi)起作用的殘基中 Trp (色氨酸) 、Phe (苯丙氨酸) 以及 Arg(精氨酸) 3 個(gè)氨基酸對(duì)于結(jié)合能的貢獻(xiàn)最大 ,這與 Geysen 的研究結(jié)果[16 ] 一致。Geysen 認(rèn)為 ,結(jié)合的兩個(gè)分子間少數(shù)幾個(gè)關(guān)鍵基團(tuán)的弱相互作用提供了絕大部分的結(jié)合能 ;含有與結(jié)合有關(guān)的幾個(gè)關(guān)鍵基團(tuán)的線(xiàn)性短肽可模擬蛋白質(zhì)折疊的抗原決定簇。
2 小分子受體與短肽相互作用
目前 ,在研究合成受體與短肽相互作用的分子設(shè)計(jì)中 ,主要包括幾個(gè)方面 : (1) 針對(duì)特定的氨基酸殘基 ,如 His(組氨酸) 、Arg、Trp 等 ; (2) 針對(duì)一類(lèi)性質(zhì)相近的氨基酸 ,如堿性氨基酸 :Lys(賴(lài)氨酸) ,Arg ;或酸性氨基酸 :Asp (天冬氨酸) 、Glu (谷氨酸) 等 ; (3) 針對(duì)氨基酸的端基 ,即 N 端陽(yáng)離子或 C 端陰離子 ; (4)針對(duì)特定的多肽改性基團(tuán) ,如磷酸化基團(tuán) ; (5) 針對(duì)一個(gè)特定的序列 ,這也是目前研究的熱點(diǎn) ,但涉及的序列往往很短 ,很多研究都少于 3 個(gè)氨基酸殘基的短肽 ,最為普遍的是兩個(gè)氨基酸殘基 ,或者多肽一頭一尾的氨基酸殘基 ; (6) 針對(duì)特定多肽構(gòu)象的識(shí)別 ,即α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu) ,這類(lèi)研究往往集中于合成受體與肽的弱相互作用誘導(dǎo)二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。
2. 1 小分子受體與個(gè)別氨基酸殘基相互作用
針對(duì)多肽特定的氨基酸殘基(端基、側(cè)鏈和磷酸化殘基) 設(shè)計(jì)相應(yīng)的受體 ,使其與多肽發(fā)生選擇性相互作用是多肽受體設(shè)計(jì)中一個(gè)重要方法。通過(guò)將某些能與特定氨基酸殘基發(fā)生弱相互作用的小分子(環(huán)糊精、氨基三乙酸(NTA) 、卟啉等) 進(jìn)行修飾和改性 ,目前已經(jīng)發(fā)展了很多此類(lèi)的受體。
劉育等[18 ] 通過(guò)紫外、圓二色、熒光、二維核磁方法 ,在 Tris-HCl 緩沖液中研究了橋連雙環(huán)糊精 (圖2a) 在加入金屬離子前后與系列脂肪族短肽 Leu-Gly ,Gly-Leu , Gly-Pro , Glu-Glu , Gly-Gly , Gly-Gly-Gly 以及 Glu-Cys-Gly 的包結(jié)行為 ,從主-客體間誘導(dǎo)契合和識(shí)別機(jī)理方面研究了選擇性及鍵和能力。結(jié)果表明 ,橋聯(lián)雙環(huán)糊精受體對(duì) Glu-Cys-Gly 具有明顯的選擇性 ,親和常數(shù)是 Glu-Glu 的 51 倍 ,說(shuō)明所合成的橋連雙環(huán)糊精受體能有效識(shí)別短肽的尺寸和疏水性。而在絡(luò)合 Ni2 + 之后 ,金屬橋聯(lián)雙環(huán)糊精對(duì) Glu-Glu具有最高的結(jié)合常數(shù) ,達(dá)到 6182 ×104 M- 1,金屬離子的參與有效地提高了橋聯(lián)雙環(huán)糊精的鍵和能力和選擇性。
宋樂(lè)新等[19 ] 設(shè)計(jì)了熒光素標(biāo)識(shí)的 (1 R ,3 R)-1-氨基-1 ,3-二羧基環(huán)戊烷衍生物橋聯(lián)的雙環(huán)糊精受體 ,利用熒光偏振方法 ,研究其與一系列短肽的相互作用。比較了主體分子與一對(duì)手性異構(gòu)體相互作用的自由能變化增量以及它們之間的結(jié)合常數(shù) ,證實(shí)環(huán)糊精二聚體對(duì)短肽具有手性識(shí)別能力 ,并探討了環(huán)糊精二聚體與短肽之間相互作用的焓-熵補(bǔ)償行為。
Breslow 等[20 ,21 ]合成了具有不同間隔臂的橋聯(lián)環(huán)糊精 ,并分別研究了它們?cè)谒芤褐信c幾種短肽的結(jié)合能力。紫外滴定結(jié)果顯示二硫鍵橋聯(lián)環(huán)糊精(圖 2b) 對(duì) Trp-Trp 二肽表現(xiàn)出了極強(qiáng)的結(jié)合能力 ,而對(duì) Phe-Phe 二肽則沒(méi)有特異性結(jié)合。
水溶液中肽的識(shí)別具有一定的難度 ,一個(gè)重要原因是氫鍵受溶劑干擾很難發(fā)揮作用 ,而利用離子相互作用穩(wěn)定氫鍵是一種設(shè)計(jì)水相受體的有效方法。2004 年 Schmuck 等[22 ] 采用從頭算法設(shè)計(jì)了一種新型的二肽受體(圖 3) ,可在水溶液中有效識(shí)別 C端未保護(hù)的二肽 ,結(jié)合系數(shù)達(dá)到 10^4M- 1以上。通過(guò)在受體中引入胍羰基 ,與二肽的羧基形成氫鍵和離子對(duì) ,同時(shí)二肽主鏈氨基與受體形成的其他氫鍵也起到增強(qiáng)復(fù)合物穩(wěn)定性的作用。在此基礎(chǔ)上 ,通過(guò)咪唑環(huán)的引入增加了普通胍基受體的選擇性。紫外-可見(jiàn)滴定測(cè)定其在水中與不同底物的結(jié)合常數(shù)( K) ,結(jié)果顯示 K 值 :Val-Val > Ala-Ala > Gly-Gly ,這一結(jié)果揭示氨基酸側(cè)基的疏水基團(tuán)與受體間的疏水作用可以進(jìn)一步增強(qiáng)親和性。該方法在理論計(jì)算的基礎(chǔ)上合成出新的高效的二肽受體 ,優(yōu)于當(dāng)時(shí)報(bào)道的其他的二肽受體。Schmuck 課題組[23 —26 ]隨后又研究了幾種四肽與該類(lèi)配體的相互作用 ,也得到了不錯(cuò)的結(jié)果。
在受體上引入可形成配位鍵的過(guò)渡金屬元素 ,與多肽序列中特定殘基或磷酸化基團(tuán)形成強(qiáng)的配位離子相互作用 ,也是實(shí)現(xiàn)受體在水相中對(duì)多肽識(shí)別有效的方法[27 —29 ] 。Piehler 等[30 ] 研究了含 2 —4 個(gè)NTA 的熒光探針化合物與含多個(gè) His 殘基的熒光六肽間的相互作用而引起熒光猝滅的現(xiàn)象 (圖 4) ,證明該探針化合物對(duì) His 標(biāo)記的肽有較高的親和性。在金屬離子配位相互作用識(shí)別多肽方面 ,卟啉及其衍生物作為受體的報(bào)道很多[31 —34 ],這里不再詳述。
經(jīng)典的已為人們所熟知的人工受體如冠醚、環(huán)番等如加以巧妙利用也可以設(shè)計(jì)出性能優(yōu)良的受體[35 ],圖 5 為 Urbach 等[36 ] 報(bào)道的合成受體葫蘆脲(Q8) 對(duì) N 端色氨酸的識(shí)別 ,Q8 可以與甲基紫羅堿MV 及一個(gè)芳環(huán)客體形成1∶1∶1型配合物。他們用等溫滴定微量熱、質(zhì)譜、紫外-可見(jiàn)、熒光、1H NMR 研究了 Q8·MV 與 4 種包含色氨酸的三肽的相互作用 ,發(fā)現(xiàn)其對(duì) Trp-Gly-Gly 的結(jié)合常數(shù) (113 ×10^5) ,是 Gly-Trp-Gly 的 6 倍 ,是 Gly-Gly-Trp 的 40 倍。分析表明 ,這種差異是由吲哚的電荷相互作用產(chǎn)生 ,化合物形成伴隨著電荷轉(zhuǎn)移和吲哚熒光的變化 ,這些光學(xué)性質(zhì)以及體系的穩(wěn)定性和選擇性在探測(cè)和分離特定的肽方面具有一定的應(yīng)用前景。
蛋白質(zhì)磷酸化是生物界最普遍 ,也是最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾[37 ] �？赡娴牧姿峄^(guò)程幾乎涉及所有的生理及病理過(guò)程 ,如細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、新陳代謝以及細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化等。例如 ,酪蛋白磷酸肽 (CPP) 是一類(lèi)富含磷酸絲氨酸生物活性肽 ,分布于牛乳酪蛋白的不同區(qū)域 ,其活性中心是連續(xù)的磷酸化絲氨酸殘基和谷氨酸殘基 ,基本結(jié)構(gòu)可表示為 :pSer-pSer-pSer-Glu-Glu。CPP 在中性和堿性狀態(tài)下可作為無(wú)機(jī)離子載體 ,通過(guò)磷酸化絲氨酸與鈣、鋅、鐵等離子結(jié)合 ,形成可溶性復(fù)合物 ,由小腸壁細(xì)胞吸收后再釋放出來(lái) ,從而有效避免了其在小腸中被沉淀 ,促進(jìn)了這些離子的吸收[38 ] 。
由于針對(duì)磷酸化蛋白的分離和分析缺少廉價(jià)高效的識(shí)別材料 , 因此限制了該領(lǐng)域的發(fā)展。通過(guò)對(duì)磷酸化多肽的識(shí)別研究 ,可積累對(duì)含不同電荷殘基識(shí)別的調(diào)控經(jīng)驗(yàn) ,有利于深入了解離子化基團(tuán)對(duì)多肽識(shí)別的影響。對(duì)臨床快速檢測(cè)磷酸化蛋白具有指導(dǎo)意義。在氨基酸中 ,Ser (絲氨酸) 、Thr (蘇氨酸) 和Tyr(酪氨酸) 上都含有羥基 ,是磷酸化的位點(diǎn)。因此 ,對(duì)于磷酸化肽的識(shí)別往往是通過(guò)合成或者生物受體與磷酸結(jié)構(gòu)單元形成的離子鍵、絡(luò)合配位等效果實(shí)現(xiàn)。
就目前對(duì)磷酸化肽的識(shí)別來(lái)說(shuō) ,合成的受體主要是利用磷酸結(jié)構(gòu)的金屬離子絡(luò)合配位作用。Ojida等合成了金屬離子鋅配位的 DPA 結(jié)構(gòu) ,可以對(duì)磷酸化肽進(jìn)行有效的識(shí)別。圖 6 為他們?cè)O(shè)計(jì)的一系列的DPA 結(jié)構(gòu)。在兩個(gè) DPA 結(jié)合臂之間由具有熒光效果的結(jié)構(gòu)相連接 ,當(dāng)它們與磷酸化肽進(jìn)行結(jié)合的時(shí)候 ,熒光效果會(huì)隨著結(jié)合程度的不同而不同程度地增強(qiáng) ,據(jù)此獲得主體客體之間相互作用的計(jì)量比以及結(jié)合常數(shù) ,并對(duì)識(shí)別過(guò)程進(jìn)行了分析。
Yamaguchi 等[41 ] 和 Yoshimura 等[42 ] 也合成了類(lèi)似的結(jié)構(gòu) ,DPA 結(jié)構(gòu)單元通過(guò)π2π堆積固定到凝膠結(jié)構(gòu)上 ,對(duì)磷酸類(lèi)結(jié)構(gòu)以及含有磷酸結(jié)構(gòu)的衍生物進(jìn)行識(shí)別。他們還分析了這種水凝膠對(duì)不同磷酸衍生物 ,如 ATP、磷酸化的絲氨酸、磷酸根離子等的選擇性。
雖然針對(duì)特定殘基設(shè)計(jì)的受體對(duì)多肽有一定的選擇性 ,但由于自然界中肽的種類(lèi)無(wú)法估量 ,含有相同殘基的肽的數(shù)量也很巨大 ,導(dǎo)致對(duì)多肽的選擇性較差。肽序列選擇性受體的設(shè)計(jì)和組合化學(xué)的發(fā)展為肽的專(zhuān)一性識(shí)別提供了一定的幫助。
2. 2 小分子受體對(duì)短肽的序列選擇性識(shí)別
識(shí)別一個(gè)蛋白的表面需要在構(gòu)型確定的環(huán)境內(nèi)排列大量的功能基團(tuán)[17 ] 。多肽的序列選擇性識(shí)別是蛋白表面位點(diǎn)專(zhuān)一性識(shí)別的基礎(chǔ) ,對(duì)蛋白功能化控制、蛋白-蛋白及蛋白-寡肽相互作用的理解有重要幫助。Still 組是最早開(kāi)始以多肽為目標(biāo)物進(jìn)行序列選擇性識(shí)別的研究組之一 ,他們的主要目標(biāo)是積累肽識(shí)別的理論知識(shí) ,并將這些理論知識(shí)用于親和性的確定和計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)。Still 等[43 —46 ] 已經(jīng)給出一個(gè)包含很多識(shí)別元素的漂亮組合 ,這些信息在肽識(shí)別和肽庫(kù)構(gòu)建方面具有重要的意義。大部分序列選擇性識(shí)別的報(bào)道都是通過(guò)單一氨基酸殘基識(shí)別位點(diǎn)的簡(jiǎn)單連接構(gòu)筑 ,如環(huán)糊精、冠醚或酰胺基團(tuán)。
Schneider 等針對(duì)非保護(hù)肽端基和側(cè)鏈引入多種識(shí)別基團(tuán) ,利用受體對(duì)雙端基和側(cè)鏈的共同作用識(shí)別多肽序列。如圖 7 所示 ,水中和甲醇中的核磁滴定證明 ,18-冠-6 基團(tuán)和多肽 N 端陽(yáng)離子相互作用 ,受體氨基陽(yáng)離子與多肽 C 端相互陰離子作用。單磺基團(tuán)的引入有兩個(gè)目的 ,一個(gè)是增加了受體分子與肽芳環(huán)側(cè)鏈的相互作用 ,另一個(gè)則是可以用熒光光譜測(cè)定相互作用。這個(gè)工作最大的意義在于在同一體系中引入多種功能基團(tuán)共同作用 ,具有很大的指導(dǎo)意義。后來(lái)他們又通過(guò)類(lèi)似的方法引入卟啉基團(tuán)作為氨基酸和三肽的紫外2可見(jiàn)傳感器[48 ] 。
模擬自然界的肽受體是設(shè)計(jì)肽序列選擇性受體的一個(gè)重要方法。Schrader 等[49 , 50 ] 發(fā)展了序列選擇性肽受體的合理設(shè)計(jì)理論。他的理論認(rèn)為很多生物體系都為肽序列的有效識(shí)別提供一個(gè)淺溝 ,并輔以一個(gè)對(duì)目標(biāo)氨基酸殘基的專(zhuān)一性鍵合的口袋。Schrader 課題組選用 kemp′s 酸作為受體骨架 ,為肽識(shí)別提供空間。Kemp′s 酸兩個(gè)羧基一個(gè)連接單�；� 3 ,5-二氨基吡唑 ,另一個(gè)接間位取代的苯胺衍生物作為識(shí)別位點(diǎn) ,圖 8 給出了該化合物對(duì)二肽Ser-Ala 的識(shí)別情況 ,Monte Carlo 結(jié)果顯示其與 Ser-Ala 二肽的識(shí)別為三點(diǎn)協(xié)同作用。
然而 Fujita 等[51 ] 用過(guò)渡金屬 Pd 制備了一種新型的 Pd 配位的三嗪籠形受體 (圖 9) 。這種自組裝配位籠受體通過(guò)π-π相互作用和 CH-π相互作用的協(xié)同作用對(duì)含有 Trp-Trp-Ala 鏈段的肽具有 10^6M- 1以上的作用常數(shù) ,而對(duì)于含陽(yáng)離子型 His 殘基的 Ac-Trp-His-Ala-NH2 不存在結(jié)合能力 ,顯示了其高度的序列選擇性。受體與多肽的單晶結(jié)果證實(shí)了它們之間的作用模式是一種疏水作用。
組合化學(xué)在多肽的序列選擇性受體研究方面具有重要應(yīng)用 ,通過(guò)肽庫(kù)可以篩選出合適的序列選擇性受體[52 , 53 ],目前這方面的研究報(bào)道很多 ,多數(shù)參與多肽序列選擇性識(shí)別研究的課題組在組合化學(xué)方面都有不同程度的介入。通過(guò)組合化學(xué)優(yōu)化 ,已經(jīng)取得一些可觀(guān)的成果[54 —57 ] 。組合化學(xué)技術(shù)也使大量有效受體的設(shè)計(jì)和合成成為可能。Still 的受體1[58 ]和 Wennemers 的剛性較強(qiáng)的受體 2[59 ] 就是較好的例子(圖 10) 。
Anslyn 等[60 ]利用 Still 和 Wennemers 的思路設(shè)計(jì)了包含剛性骨架和可變?nèi)谋鄣氖荏w識(shí)別三肽 ,研究表明該受體對(duì) Xxx-Lys-Lys ( Xxx 為 His、Cys 或Met) 的三肽具有序列選擇性 ,結(jié)合常數(shù)接近 10^6M- 1 。他們同時(shí)還證實(shí)三肽手臂的協(xié)同作用 (離子對(duì)) 能增加結(jié)合能力 ,如 His-Lys-Lys(110 ×10^6 M- 1)> His-Gly-Gly(115 ×10^4 M- 1) > Lys-Lys-His(0) , Gly-Gly-Gly(0) 。
2. 3 小分子受體對(duì)多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)與識(shí)別
多數(shù)少于或等于 30 個(gè)氨基酸殘基的多肽在水溶液中并不以規(guī)整的構(gòu)型存在 ,而是以許多自由能近似的構(gòu)型群形式存在[61 ] 。因此 ,可以設(shè)計(jì)一定的受體 ,通過(guò)相互作用誘導(dǎo)并穩(wěn)定多肽的某一構(gòu)型 ,使其自由能降低并在構(gòu)型群中占有多數(shù) ,從而達(dá)到識(shí)別多肽的最終目的。當(dāng)前研究中主要集中于α螺旋和β折疊的誘導(dǎo)識(shí)別。
α螺旋是一種重要的二級(jí)結(jié)構(gòu) ,在多種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)表面相互作用中扮演著重要的角色。合理設(shè)計(jì)對(duì)α螺旋具有特定選擇性識(shí)別的受體是一個(gè)挑戰(zhàn) ,這種挑戰(zhàn)源于α螺旋較大的表面區(qū)域 ,以及疏水和靜電互補(bǔ)在表面拓?fù)鋵W(xué)上的匹配。
Hamilton 課題組[17 , 62 ] 利用胍基與肽上 Asp 殘基的互補(bǔ)的特性 ,設(shè)計(jì)了一系列含有多個(gè)胍基結(jié)構(gòu)的受體 ,這些受體可以在競(jìng)爭(zhēng)性溶劑中對(duì)模型α螺旋肽進(jìn)行識(shí)別。由于降低了去溶劑化能量和溶劑較低的介電常數(shù) ,這種相互作用在有機(jī)溶劑里更為明顯。如圖 11 所示 ,胍基分子與 Asp 側(cè)鏈相互作用 ,胍基間距離依賴(lài)于 Asp 殘基間距離( i + 3 n) 。
Fairman 等[63 ]利用 Lys 側(cè)鏈氨基正離子能與陰離子相互作用的特點(diǎn) ,設(shè)計(jì)了包含 3 個(gè)不連續(xù) Lys殘 基 的 肽 : Ile-Gln-Gln-Leu-Lys-Asn-Gln-Ile-Lys-Gln-Leu-Leu-Lys-Gln (Cp3K2N) 及其相應(yīng)的陰離子卟啉受體(內(nèi)消旋-四-(4-磺基苯)-卟啉 , TPPS4) 。紫外、圓二色及分析超速離心結(jié)果表明 ,受體 TPPS4 能通過(guò)多重靜電相互作用與肽 Cp3K-N 發(fā)生特異性相互作用 ,并誘導(dǎo)其形成α螺旋結(jié)構(gòu) (圖 12) 。TPPS4 的這種特異性和誘導(dǎo)α螺旋的能力在電子和光學(xué)活性的感應(yīng)材料方面具有潛在的應(yīng)用。
提高受體對(duì)生物分子親和性的一個(gè)有效方法就是利用目標(biāo)蛋白表面的模板受體進(jìn)行識(shí)別 ,這已經(jīng)通過(guò)分子表面印跡、樹(shù)脂印跡以及金屬印跡的模板聚合實(shí)現(xiàn)。納米單層膜作為模板能為目標(biāo)分子提供較大的表面 ,這使它們成為生物表面識(shí)別的工具 ,因此也成為目標(biāo)α螺旋的潛在受體。Rotello 等[64 ]報(bào)道了在水溶液中三甲胺功能化的金納米單層膜對(duì)含 4個(gè)天冬氨酸殘基的α螺旋肽有顯著識(shí)別和穩(wěn)定作用 ,如圖 13 所示。
β折疊的誘導(dǎo)識(shí)別主要有兩種方式 ,即模擬成核鏈 ( nucleating strand mimics) 和 模 擬 成 核 轉(zhuǎn) 角( nucleating turn mimics) , Nowick 等[65 ,66 ] 和 Kelly等[67 ,68 ]的分別建立過(guò)成功的模型體系。
3 高分子和短肽相互作用
3.1 線(xiàn)性高分子與短肽相互作用
線(xiàn)性高分子與肽相互作用的報(bào)道在文獻(xiàn)中出現(xiàn)較少[69 , 70 ],本研究組通過(guò)與親水單體共聚的方法將功能單體引入高分子體系 ,制備了系列包含功能單體的水溶性共聚物 , 并將其用作吸附材料的模型[71 —75 ] 。通過(guò)等溫滴定微量熱、核磁、熒光和表面等離子體共振等現(xiàn)代分析測(cè)試手段研究模型聚合物與多肽在水中的作用機(jī)理 ,從而進(jìn)一步指導(dǎo)吸附劑的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì) ,為高選擇性多肽吸附材料的設(shè)計(jì)提供了一定的理論指導(dǎo)。圖 14 給出了幾種吸附劑對(duì)尿毒癥中分子八肽(Val-Val-Arg-Gly-Cys-Thr-Trp-Trp) 的吸附能力 ,從圖中可以看出 ,丁基修飾的聚乙烯胺(E) 吸附劑對(duì)八肽的吸附能力明顯強(qiáng)于其他幾種吸附劑。二維核磁對(duì)含有相同功能單體的水溶性聚合物模型與八肽相互作用的研究表明 ,模型聚合物與八肽的相互作用強(qiáng)弱趨勢(shì)與吸附劑的吸附結(jié)果基本一致 ,證明了線(xiàn)性聚合物作為吸附劑模型篩選有效功能單體的有效性。同時(shí) ,通過(guò)對(duì)吸附劑模型與八肽相互作用的研究 ,證明了吸附劑對(duì)八肽的吸附機(jī)理是疏水作用和靜電作用的協(xié)同作用。
3. 2 肽吸附分離材料
隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展 ,在研究多肽和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能時(shí) ,一個(gè)必不可少的環(huán)節(jié)是要將其從成千上萬(wàn)種復(fù)雜的混合物中分離出來(lái) ,并得到高純度的樣品。因此 ,近年來(lái)對(duì)于多肽的分離純化技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為生物技術(shù)的一個(gè)重要分支。在分子識(shí)別基礎(chǔ)上進(jìn)行多肽分離材料的設(shè)計(jì)將極大地提高分離效果。目前基于分子識(shí)別原理設(shè)計(jì)的多肽分離純化材料主要分為親和吸附劑、分子印跡聚合物等幾類(lèi)。
3. 2. 1 親和吸附劑
親和吸附劑可以應(yīng)用于多種物質(zhì)的分離 ,它的分離原理是基于分子間靜電、氫鍵、疏水相互作用以及金屬配位作用的分子識(shí)別。親和配體包括生物特異性配體和仿生物特異配體。由于抗體十分昂貴且容易變性 ,因此生物特異性配體吸附劑的應(yīng)用有很大的局限性。目前 ,應(yīng)用該方法設(shè)計(jì)多肽親和吸附劑主要是固定化金屬離子親和色譜 (immobilizedmetal ion affinity chromatography , IMAC) 的柱填充材料[76 —81 ]
IMAC 作為一種新型高效色譜分離模式 ,利用親和吸附劑作為柱填充材料 ,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于肽類(lèi)物質(zhì)的分離分析。IMAC 常作為捕獲Π釋放柱 ,富集某一類(lèi)肽段(如表面含有裸露的組氨酸殘基或磷酸化的肽段) ,以及含有組氨酸標(biāo)簽的重組多肽的分離純化。鄒漢法等[76 ] 通過(guò)直接聚合方法得到了含有磷酸酯基團(tuán)的整體柱材料 ,利用磷酸酯基團(tuán)與 Ti4 +的螯合配位作用固定化 Ti4 +,制備了 Ti4 +-IMAC(圖15) 。再通過(guò) Ti4 + 與磷酸化肽上磷酸基團(tuán)的選擇性作用達(dá)到富集的目標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 Ti4 + 固定化親和色譜固定相對(duì)磷酸化肽段具有很高的選擇性和明顯的富集效果。分離和富集磷酸化肽的選擇性和效率優(yōu)于其他富集方法如 :Fe3 +-IMAC ,Zr4 +-IMAC[82 ],TiO2 以及 ZrO2 等。
3. 2. 2 分子印跡聚合物
將要分離的目標(biāo)分子與交聯(lián)劑在聚合物單體溶液中進(jìn)行共聚制備得到顆粒介質(zhì) ,然后利用洗脫或萃取的方式除去包埋在介質(zhì)中的目標(biāo)分子 ,便得到分子印跡聚合物。此時(shí)的高分子介質(zhì)中形成了在三維空間大小、形狀以及功能配體都與模板分子互補(bǔ)的分子印跡微腔 ,可以將目標(biāo)分子的空間結(jié)構(gòu)保持“印跡”或留下“記憶”。這種分子印跡聚合物又被形象地稱(chēng)為“塑料抗體”或“人工抗體”,可實(shí)現(xiàn)對(duì)模板分子的特異性識(shí)別 ,這種特異性可以和多克隆抗體相媲美[83 , 84 ] 。
然而 ,由于多肽在溶液中構(gòu)型自由度比較大 ,并不適合于分子印跡。除少數(shù)在水中結(jié)構(gòu)很確定的多肽[85 ]外 ,針對(duì)多肽分子印跡的報(bào)道相對(duì)較少。一般對(duì)多肽的印跡都是基于三個(gè)方面 : (1) 蛋白質(zhì)表面結(jié)構(gòu)的印跡 ; (2) 蛋白質(zhì)暴露域短肽序列的印跡 ; (3) 以識(shí)別蛋白質(zhì)的生物分子作為功能單體制備印跡聚合物。
目前發(fā)展較為成熟的表面印跡技術(shù)是利用金屬離子與組氨酸之間的螯合作用分離帶有組氨酸片段的多肽。Shea 等[86 , 87 ]利用丙烯酰胺為功能單體 ,于富水相中制備分子印跡聚合物分離含有 N 端組氨酸的多肽 ,并對(duì)比了 Ni2 + 、Cu2 + 、Zn2 + 不同金屬離子對(duì)印跡效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 Ni2 + 對(duì)肽的特異性識(shí)別作用最強(qiáng)。但遺憾的是 ,利用金屬螯合作用的表面印跡技術(shù)只能應(yīng)用于含有裸露組氨酸殘基的蛋白質(zhì) ,并且金屬螯合作用的特異性不強(qiáng)。近年來(lái) ,新發(fā)展的抗原決定基法[88 , 89 ] 是基于使用多肽或蛋白質(zhì)序列中裸露的一個(gè)特異短肽(抗原決定部位)片段作為模板分子(圖 16) ,利用它所合成的分子印跡聚合物也能有效識(shí)別多肽和整個(gè)蛋白[90 ] 。
分子印跡聚合物可以高選擇性地吸附混合物中的印跡分子 ,但制備分離材料之前必須獲得待分離物質(zhì)的純品。如果純品難于得到或價(jià)格昂貴 ,那么印跡方法將難于實(shí)現(xiàn)。另外 ,由于肽和蛋白由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及其與印跡常用的有機(jī)溶劑的不匹配性 ,導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物活性的喪失 ,如何能在水相進(jìn)行分子印跡仍是一種挑戰(zhàn)[91 ] 。
4 總結(jié)和展望
眾多的文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)短肽識(shí)別的研究還主要限于小分子受體的設(shè)計(jì)及合成 ,短肽結(jié)構(gòu)的柔順性和多樣性增加了其被識(shí)別的難度。特別是在極性溶劑(生物體系) 中 ,一些弱相互作用往往因受到溶劑分子的競(jìng)爭(zhēng) ,作用強(qiáng)度被大大削弱 ,導(dǎo)致識(shí)別的難度增大。而疏水性小分子受體的設(shè)計(jì)又受到水相溶解性的限制 ,發(fā)展并不順利。對(duì)于高分子體系而言 ,盡管分子印跡技術(shù)用于多肽的識(shí)別得到了一定程度的研究 ,但分子印跡由于體系的限制難于有好的表現(xiàn)。
從目前發(fā)展的趨勢(shì)來(lái)看 ,小分子受體應(yīng)該以各種識(shí)別基團(tuán)的優(yōu)化和組合為基礎(chǔ) ,制備在水體系內(nèi)具有序列選擇性識(shí)別功能的受體。而實(shí)現(xiàn)肽吸附分離材料的高選擇性首先要利用分子識(shí)別理論進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)并通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬輔助篩選有效的配體 ,通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化配體后將優(yōu)化得到的配體布局在吸附分離材料的表面 ,模仿蛋白質(zhì)“利用弱相互作用進(jìn)行組裝和識(shí)別”的特點(diǎn) ,實(shí)現(xiàn)配體的協(xié)同作用[92 ],有可能產(chǎn)生類(lèi)似自然體系的響應(yīng)性和和協(xié)同性 ,達(dá)到高選擇性的識(shí)別效果。
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