摘 要 多肽在機(jī)體中具有重要的生理功能 ,并且它具有化學(xué)合成和修飾的便利性 ,因此吸引了越來越多的化學(xué)、生物學(xué)及其交叉領(lǐng)域研究人員的研究興趣。神經(jīng)肽 FF(NPFF) 作為阿片調(diào)節(jié)肽在阿片耐受等藥理學(xué)方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。然而迄今為止仍缺乏 NPFF 受體高選擇性的激動(dòng)劑和拮抗劑 ,從而阻礙了NPFF 藥理學(xué)功能及其作用機(jī)制的研究。本文簡述了 NPFF 的發(fā)現(xiàn) ,綜述了近幾年來在 NPFF 的前體、受體和生理學(xué)功能等方面所取得的最新進(jìn)展。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的工作 ,重點(diǎn)介紹了 NPFF 構(gòu)效關(guān)系方面的研究 ,并展望了該研究方向今后的發(fā)展趨勢(shì)。
具有調(diào)控作用的多肽與其受體 (一類含有10 % —20 %多糖的糖蛋白) 的相互作用是研究與評(píng)價(jià)生物大分子(蛋白質(zhì)、多糖和核酸等) 與小分子識(shí)別作用的重要組成部分之一。細(xì)胞功能、胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫應(yīng)答的調(diào)控大多數(shù)都是通過肽2蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)作用模式來實(shí)現(xiàn)的 ,機(jī)體中內(nèi)源性的生物活性肽具有重要的生物學(xué)功能[1 ] 。然而 ,除胰島素、催產(chǎn)素和降血鈣素等少數(shù)肽之外 ,絕大部分內(nèi)源性的活性肽都不能直接作為藥物來使用 ,而在臨床上經(jīng)常使用的藥物為這些肽類配體的類似物 ,即其相應(yīng)的激動(dòng)劑或拮抗劑[1 ] 。因此 ,肽類配體的構(gòu)建和篩選已成為開發(fā)全新的藥物和藥物前體、生物學(xué)和藥理學(xué)工具的重要策略之一。
根據(jù)近年來一些最新的藥理學(xué)研究結(jié)果推測(cè) :阿片受體的激活會(huì)引起機(jī)體內(nèi)的抗阿片系統(tǒng)出現(xiàn)相應(yīng)的活化 ,并在機(jī)體內(nèi)達(dá)到生理平衡[29 ] 。我們?cè)噲D通過深入地了解內(nèi)源性抗阿片系統(tǒng)的作用機(jī)制來全面理解阿片的痛覺調(diào)節(jié)、耐受和成癮等藥理學(xué)功能。神經(jīng)肽 FF(NPFF) 是最具代表性的抗阿片肽之一 ,我們研究組最近 3 年來圍繞其構(gòu)效關(guān)系及其相關(guān)的藥理學(xué)活性等研究內(nèi)容開展了一些初步的研究。由于篇幅等方面的考慮 ,本文主要闡述了 NPFF 構(gòu)效關(guān)系研究方面的最新進(jìn)展。
1 神經(jīng)肽 FF 及其受體的發(fā)現(xiàn)
1977 年 , Price 和 Greenberg 從 軟 體 動(dòng) 物 蛤(macrocallisa nimbosa) 的體內(nèi)分離出具有心臟興奮功能的四肽 FMRF2NH2(Phe2Met2Arg2Phe2NH2)[30 ] 。發(fā)現(xiàn)在線蟲、果蠅和蝗蟲等無脊椎動(dòng)物體內(nèi)都存在著FMRF2NH2 樣的免疫反應(yīng) ,進(jìn)一步分離得到一系列 C末端均以 RF2NH2 結(jié)構(gòu)結(jié)尾的新肽 ,于是將這些結(jié)構(gòu)相類似的肽都?xì)w為一個(gè)家族 ,即 FMRFa 相關(guān)肽(FaRPs) 家族 ,近期研究人員也將它們稱為 RFa 肽(RFamide peptides)[31 ] 。
然而 ,在脊椎動(dòng)物體內(nèi)尋找 RF2NH2 肽的工作進(jìn)展比較緩慢 ,直到 1981 年 ,Weber 等[32 ] 首次證實(shí)了在脊椎動(dòng)物體內(nèi)也存在著類似 FMRFa 的 RF2NH2肽。隨后 ,Dockray 等[33 ] 于 1983 年利用抗 FMRFa 的抗體進(jìn)行放免分析 ,從雞腦中分離出脊椎動(dòng)物體內(nèi)的第一個(gè) RF2NH2 肽 ———LRLRFa。有趣的是 ,隨后發(fā)現(xiàn)阿片肽甲七肽 ( YGGFMRF) 的 C 末端四肽序列結(jié)構(gòu)與 FMRF2NH2 的氨基酸殘基序列完全一致 ,從而推測(cè) FMRF2NH2 可能是與腦啡肽一起協(xié)同進(jìn)化而來的[34],然而藥理學(xué)研究結(jié)果卻顯示甲七肽和 FMRFa表現(xiàn)出完全相反的生理功能[34 ,35] 。為了進(jìn)一步探討FMRF2NH2 樣物質(zhì)的生物活性 ,1985 年 , Yang 等[36] 運(yùn)用免疫親合的技術(shù) ,用抗 FMRF2NH2 的血清從牛腦中分離得到了兩種新的具有抗阿片活性的 RF2NH2 肽 ,即八肽結(jié)構(gòu)的 NPFF(FLFQPQRF2NH2) 和十八肽結(jié)構(gòu)的 NPAF(AGEGLSSPFWSLAAPQRF2NH2 ) 。
雖然 NPFF 和 NPAF 是作為嗎啡的調(diào)節(jié)肽被發(fā)現(xiàn)的 ,其功能并不僅僅局限于對(duì)阿片系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。已有的報(bào)道表明 , NPFF 不僅具有抗阿片的活性(anti2opioid) ,它還具有加強(qiáng)阿片作用 ,即原阿片活性(pro2opioid) ,因此早期的抗阿片肽也都被歸為阿片調(diào)節(jié)肽 (opioid2modulating peptides)[29 ] 。大量的研究表明 ,NPFF 及其相關(guān)肽在痛覺、阿片耐受和成癮、心血管系統(tǒng)、攝食、體溫、消化道運(yùn)動(dòng)、水平衡和內(nèi)分泌等方面都具有重要的調(diào)節(jié)作用[37 ] 。
自從 NPFF 和 NPAF 發(fā)現(xiàn)之后 ,進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在其它幾種哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也同樣存在著 NPFF 樣的免疫反應(yīng) ,但是未能從它們體內(nèi)分離純化出新的 NPFF 相關(guān)肽。直到 1995 年 ,才從大鼠的脊髓和腦中分離出一種 NPFF 樣物質(zhì) ———NPSF[38 ] 。隨著近年來分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展 ,在人、牛、大鼠和小鼠體內(nèi)分別克隆得到了編碼 NPFFΠAFΠSF 的基因 (pro2NPFFA 前體的基因)[39 ,40 ] 。與此同時(shí) ,Hinuma 等(2000 年) 和 Liu 等(2001 年) 還分別利用表達(dá)序列標(biāo)簽 ( ESTs ,expressed sequence tags) 在Gen2Bank 數(shù) 據(jù) 庫 中 尋 找 新 的 RF2NH2 相 關(guān) 肽(FaRPs) ,在此過程中 ,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的 NPFF 的前體 ———pro2NPFFB 前體[41 ,42 ] 。進(jìn)一步的分離鑒定發(fā)現(xiàn) ,在不同的種屬中 ,NPFF 的兩個(gè)前體蛋白的結(jié)構(gòu)和酶切方式也有所不同 ,從而得到了一系列 NPFF相關(guān)肽。前體 pro2NPFFA 經(jīng)酶切后得到兩種不同序列的神經(jīng)肽 : (1) 含有 NPFF(FLFQPQRF2NH2) 序列的肽 ; (2) 含有 NPSF (SLAAPQRF2NH2) 序列的肽。而pro2NPFFB 前體也能生成兩種類型的 RF2NH2 肽 : (1)含有 LPQRF2NH2 序列的神經(jīng)肽 ; (2) 含有 LPLRF2NH2 序列的神經(jīng)肽[43 —45 ] 。這些神經(jīng)肽的具體序列結(jié)構(gòu)如表 1 所示 ,但表中所列出的一些肽的酶切位點(diǎn)仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
雖然較早就發(fā)現(xiàn)了 NPFF ,但受到早期研究手段的限制 ,對(duì) NPFF 受體的研究相對(duì)比較滯后。最初 ,只能用放免結(jié)合實(shí)驗(yàn)尋找 NPFF 的結(jié)合位點(diǎn)來研究其受體的可能分布區(qū)域[46 ,47 ] 。2000 年 ,利用分子生物學(xué)技術(shù) ,日本、英國和美國的 3 家實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn) 了 NPFF 的 兩 種 不 同 的 G 蛋 白 偶 聯(lián) 受 體(GPCR) ,即 NPFF1 和 NPFF2 受體 (具體見表 2) ,且NPFF1 與 NPFF2 間 只 有 50 % 的 氨 基 酸 序 列 相同[42 ,48 ,49 ] 。原位雜交實(shí)驗(yàn)表明它們?cè)隗w內(nèi)的分布也存在一定的差異 ,其中 NPFF1 受體主要分布于丘腦的束旁核上 ,而 NPFF2 受體卻主要分布于脊髓和丘腦的外側(cè)區(qū)域[41 ] 。
與已鑒定的 GPCRs 相比較 ,發(fā)現(xiàn) NPFF 受體與一些介導(dǎo)攝食功能的 GPCRs 結(jié)構(gòu)相類似 ,如 NPFF1受體與人類的 26RFa 的受體 ( GPR103 ,也被命名為SP9155ΠAQ27 , 49 %)[50 ] 、食 欲 素 受 體 1 ( orexin1 ,37 %) 、食欲素受體 2 (orexin2 ,35 %) 、神經(jīng)肽 Y Y2 受體 (NPY Y2 , 34 %) 、膽囊收縮素 A 受體 (CCKA ,34 %) 、神經(jīng)肽 Y Y1 受體(NPY Y1 ,32 %) 、促乳腺素釋放肽受體( GPR10 ,32 %) 和神經(jīng)肽 Y Y4 受體(NPYY4 ,31 %) 等受體之間都具有一定的同源性[49 ] 。有趣的是 ,最近新發(fā)現(xiàn)的孤兒 GPCRs 也能被 NPFF相關(guān)肽結(jié)合并激活 ,如最近新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)在哺育動(dòng)物體內(nèi)特異性表達(dá) Mrgs (mas2relatedgenes) 受體家族 (2001 年) ,包含有 50多種孤兒 GPCRs ,它們都特異性地分布于人和鼠的背根神經(jīng)節(jié)小神經(jīng)元和三 叉 神 經(jīng) 元 等 感 覺 神 經(jīng) 元 細(xì) 胞上[51 ,52 ], 而 表 達(dá) MrgA1、MrgA4 和MrgC11 受體的 HEK 細(xì)胞能被 NPFF和 FMRFa 激活[52 —54 ] 。
通過放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn) ,發(fā)現(xiàn)NPFF 與兩種受體有著較高的親合力 ,但不同的 NPFF 相關(guān)肽對(duì)兩個(gè)受體的親合力有所不同[41 ,45 ] 。利用放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)和體外功能性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)初步研究發(fā)現(xiàn) ,由 pro2NPFFA 前體酶切得到的 NPFF 相關(guān)肽 (如 :NPA2NPFF ,NPAF , EFW2NPSW) 與 NPFF2 受體有較高的親合性 ,并具有一定的選擇性(約 100 倍) ;相反 ,由 pro2NPFFB 前體剪切而來的 NPVF 對(duì) NPFF1 受體具有輕微的選擇性(35 倍左右)[45 ] 。
2 神經(jīng)肽 FF 化學(xué)修飾
NPFF 作為一種重要的內(nèi)源性阿片調(diào)節(jié)肽 ,其藥理學(xué)作用及其機(jī)制的研究對(duì)于揭示阿片系統(tǒng)的作用機(jī)制也有著極其重要的地位。然而 ,迄今仍缺乏研究 NPFF 受體的有效藥理學(xué)工具。特別是NPFF1 和 NPFF2 受體出現(xiàn)后 ,這兩種受體的高選擇性激動(dòng)劑和拮抗劑將成為闡釋 NPFF 及其受體藥理學(xué)作用的有力工具。雖然已有的 NPFF 及其相關(guān)肽的構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)了一些 NPFF 受體的肽類和非肽類的配體[55 ],但仍缺乏對(duì)于 NPFF1 和 NPFF2 受體具有高選擇性且高親合力的理想配體 ,特別是高選擇性的拮抗劑。
NPFF的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有 20 多年的歷史 ,但其構(gòu)效關(guān)系方面的研究相對(duì)有些緩慢 ,其原因是多方面的 ,如缺乏 NPFF 受體的突變和晶體結(jié)構(gòu)等受體構(gòu)效關(guān)系的數(shù)據(jù) ,這些阻礙了配體和受體結(jié)合關(guān)系的研究 ;NPFF 受體的發(fā)現(xiàn)相對(duì)滯后 ;并且已有的 NPFF 構(gòu)效關(guān)系研究也相對(duì)有限。在此文中將按照肽類激動(dòng)劑和拮抗劑設(shè)計(jì)的一般思路 ,將已報(bào)道的 NPFF 的構(gòu)效關(guān)系數(shù)據(jù)做一初步的歸納和分析 ,希望有助于設(shè)計(jì)和篩選出新的 NPFF 受體高效的肽類和非肽類配體。
對(duì)于 NPFF ,每刪除 N 末端的一個(gè)氨基酸殘基 ,它與 NPFF1 和 NPFF2 受體的親合力及其體外藥理學(xué)活性就出現(xiàn)相應(yīng)的降低 ,在刪除第 1 位 Phe 后其受體親合力和生物活性未受明顯的影響 ,但是刪至第 3 位和第 4 位氨基酸時(shí) ,其受體親合力和生物活性都出現(xiàn)明顯的降低。令人詫異的是 NPVF 刪除 N末端的第一個(gè)氨基酸殘基后 ,它與 NPFF1 和 NPFF2受體的親合力和生物活性反而都出現(xiàn)了升高 ,并且刪掉第 2 位和第 3 位氨基酸后 ,它的受體親合力和生物活性都下降得不太顯著。而第 4 位的 Leu 的刪除會(huì)導(dǎo)致其對(duì) NPFF1 受體的親合力和生物活性的大大降低。這些數(shù)據(jù)表明 NPFF 和 NPVF 的 N 末端四肽結(jié)構(gòu)是影響它們結(jié)合并激活 NPFF1 和 NPFF2受體的關(guān)鍵區(qū)域 ,其中決定它們受體選擇性的是NPFF 的 Phe3 和 Gln4,NPVF 的 Leu4 。
兩種 NPFF 受體亞型的出現(xiàn) ,必然給構(gòu)效研究帶來新的問題 :是否存在 NPFF 受體的選擇性配體 ?初步的研究發(fā)現(xiàn) ,由不同前體酶切而來的 NPFF 相關(guān)肽對(duì) NPFF1 和 NPFF2 受體的選擇性也有所不同。此外 ,從 NPFF1 和 NPFF2 受體的序列結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn) ,它們胞外環(huán)形結(jié)構(gòu)上的氨基酸殘基差異性較大 ,而跨膜區(qū)域的結(jié)構(gòu)相對(duì)保守 ,從而提示了 NPFF1 和NPFF2 受體的配體結(jié)構(gòu)不同 ,或者同一配體對(duì)兩種受體的結(jié)合能力存在差別。
此外 ,由 NPFF 的兩個(gè)前體衍生而來的一系列NPFF相關(guān)肽 ,通過檢測(cè)它們與 NPFF1 和 NPFF2 受體的親合能力 ,可以推測(cè)出 NPFF 相關(guān)肽的 N 末端區(qū)域的氨基酸序列結(jié)構(gòu)決定了它分別與 NPFF1 和NPFF2 受體親合力的不同 ,從而造成了它對(duì) NPFF 受體亞型選擇性的差異。NPFF、NPSF 和 NPVF 為 3 個(gè)結(jié)構(gòu)類似的八肽 ,它們具有相同的 C 末端四肽結(jié)構(gòu) ,但是它們與 NPFF1 和 NPFF2 受體的親合力存在很大的不同[45 ,58 ] 。對(duì)于 NPSF 肽 ,可以通過延長其 N末端氨基酸序列來提高其結(jié)合 NPFF2 受體的能力 ,而結(jié)合 NPFF1 的能力改變不大 ,從而使得由 NPSF的 N 末端延長而來的 QFW2NPSF 和 EFW2NPSF 能選擇性地結(jié)合 NPFF2 受體。同樣延長 NPFF 的 N 末端也能選擇性地提高其結(jié)合 NPFF2 受體的能力 ,因此由 NPFF 的 N 末端延長的 NPA2NPFF、SQA2NPFF 和SPA2NPFF 對(duì) NPFF2 受體也具有較高的選擇性[45 ,58 ] 。值得注意的是 ,NPAF 也可以看作 NPFF 的 N 末端延長而來的十八肽 ,但是其 N 末端的延長不僅沒有提高它結(jié)合 NPFF2 受體的能力 ,反而使它結(jié)合 NPFF1受體的能力降低了[45 ,58 ] 。這些推論仍需運(yùn)用系統(tǒng)的構(gòu)效關(guān)系研究來進(jìn)一步探討。
由于早期的親合數(shù)據(jù)主要是采用勻漿后的大鼠脊髓細(xì)胞膜為材料來檢測(cè)的 ,而已有的研究表明大鼠脊髓主要分布的是 NPFF2 受體 ,因此這些親合數(shù)據(jù)主要反映的是替換后的類似物與 NPFF2 受體的親合力 ,從而缺乏這些類似物與 NPFF1 受體的結(jié)合數(shù)據(jù)。這些氨基酸替換修飾的研究結(jié)果與前一部分構(gòu)效關(guān)系的結(jié)論基本一致。通過分析 NPFF 的 N 末端化學(xué)修飾的構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn) ,雖然NPFF(5 —8) 仍具有一定的結(jié)合和激動(dòng)活性 ,但 NPFF的 N 端區(qū)域的構(gòu)象改變 ,能直接影響它對(duì) NPFF 受體的親合性和選擇性 ,因此 ,N 末端的氨基酸殘基位點(diǎn)是決定 NPFF 類似物對(duì) NPFF1 和 NPFF2 受體親合力和選擇性的關(guān)鍵區(qū)域。
同樣 ,表 6 中所列出的親合數(shù)據(jù)不能反映出這些類似物對(duì)兩種不同的 NPFF 受體的選擇性。但是從這些構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果可以推測(cè)出 NPFF 的 C 末端的 RF2NH2 結(jié)構(gòu)為其“信使域”,是決定它結(jié)合并激活 NPFF 受體的關(guān)鍵位點(diǎn) ,即影響 NPFF 類似物效能的重要區(qū)域。已有的 NPFF 受體肽類拮抗劑的設(shè)計(jì)和化學(xué)改造也主要集中于此結(jié)構(gòu)區(qū)域 ,具體將在后面部分作詳細(xì)的介紹。
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià) NPFF 的 C 末端的 RF2NH2 結(jié)構(gòu)對(duì)其藥理學(xué)活性的影響。基于 NPFF 的 C 末端的四肽結(jié)構(gòu) ,并在 N 末端引入丹�；揎梺碓鰪�(qiáng)其受體親合能力 ,我們實(shí)驗(yàn)小組設(shè)計(jì)合成了 4 個(gè)具有熒光活性的 NPFF 類似物 :C 末端中含有“2RF2NH2”結(jié)構(gòu)的 dansyl2PQRF2NH2 和 dansyl2GSRF2NH2 ; 以及 C末端 以“2R2NH2 ”結(jié) 構(gòu) 結(jié) 尾 的 dansyl2PQR2NH2 和dansyl2GSR2NH2 。通過一系列體外和體內(nèi)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地探討了其化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化對(duì)其藥理學(xué)功能的效能和效價(jià)的影響 ,研究進(jìn)一步驗(yàn)證了 NPFF 的 C末端2RF2NH2 結(jié)構(gòu)決定了其類似物效能 ,還發(fā)現(xiàn)2RF2NH2Π2R2NH2 的 N 末端的氨基酸殘基對(duì)其效價(jià)的大小也具有一定的影響。此外 ,還發(fā)現(xiàn)新設(shè)計(jì)的dansyl2GSRF2 NH2 為一種高效的、具有熒光活性的NPFF 受體激動(dòng)劑[59 ,60 ] 。
在此構(gòu)效研究的工作基礎(chǔ)上 ,同時(shí)用 Pro1 和Phe2 來替換 FMRFa 而獲得的四肽結(jié)構(gòu) PFRFa 為NPFF 受體的假定激動(dòng)劑 ,利用結(jié)構(gòu)限制性的 Tic 來替換這個(gè)激動(dòng)劑 4 位的 Phe 得到了一個(gè)新的 NPFF類似物 PFR(Tic)2NH2 ,并且此類似物在大鼠整體血壓的測(cè)定中能使大鼠平均動(dòng)脈壓下降 ,它在阿片成癮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出弱拮抗劑的活性[62 ,63 ] 。但是最近的離體功能測(cè)定實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) , PFR ( Tic)-NH2 表現(xiàn)為NPFF1 和 NPFF2 受體的一個(gè)“超激動(dòng)劑”[64 ,65 ] 。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià) PFRFa 的結(jié)構(gòu)改變對(duì)其心血管活性的影響 ,我們用一系列 Phe 的類似物來替換其 Phe4,藥理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn) C 末端 Phe 側(cè)鏈的空間伸展方向和芳香環(huán)上的電子云分布的改變都對(duì)其心血管調(diào)節(jié)作用產(chǎn)生一定的影響(待發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果) 。
3 神經(jīng)肽 FF 受體拮抗劑的研究進(jìn)展
通過構(gòu)效關(guān)系研究先后發(fā)現(xiàn)了一些 NPFF 受體的激動(dòng)劑 ,而 NPFF 受體拮抗劑的研究進(jìn)展相對(duì)緩慢。最近 NPFF 受體的選擇性拮抗劑 RF9 的發(fā)現(xiàn)使此方面的研究工作取得了突破[66 ], 但是 RF9 對(duì)NPFF1 和 NPFF2 受體的選擇性不強(qiáng) ,因此 ,迄今為止仍缺乏 NPFF1 和 NPFF2 受體的專一性的拮抗劑。在此將 NPFF 受體拮抗劑的發(fā)展作一簡述。已報(bào)道的 NPFF 受體的拮抗劑或假定拮抗劑主要分為肽類和非肽類兩大類。
NPFF 受體的肽類拮抗劑都是基于其母體或母體的 C 末端四肽的序列結(jié)構(gòu)而衍生出來的 ,但是已報(bào)道的這類拮抗劑都對(duì) NPFF 的“信使域”做了一定的化學(xué)修飾 ,它們與 NPFF 受體的親合力一般都較低 ,并且這些肽類拮抗劑都是通過藥理學(xué)活性實(shí)驗(yàn)篩選出的 ,都缺乏生化鑒定的數(shù)據(jù)支持。
早期的研究表明 ,NPFF 的 C 末端的 RF2NH2 是決定 NPFF 激動(dòng)活性的關(guān)鍵位點(diǎn) ,因此研究人員設(shè)計(jì)肽類拮抗劑的思路主要是通過刪掉 NPFF 及其激動(dòng)劑的 C 末端的 Phe 而使它們從激動(dòng)劑轉(zhuǎn)化成拮抗劑。最早報(bào)道的 NPFF 的假定拮抗劑為 daY8Ra(desaminotyrosyl2Phe2Leu2Phe2Gln2Pro2Gln2Arg2NH2) ,其對(duì)應(yīng)的激動(dòng)劑為 daY9Fa ,進(jìn)一步的藥理學(xué)活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)它在大鼠脊髓細(xì)胞膜上的親合力 Ki =840 nmolΠL ,并且它能減弱嗎啡的耐受 ,減輕高劑量的NPFF 在正常大鼠上引起阿片成癮戒斷樣反應(yīng)[67 —69 ] 。最近的研究還發(fā)現(xiàn)靜脈注射 daY8Ra 對(duì)大鼠的平均動(dòng)脈壓無影響 ,但它能有效地減弱 NPFF所引起的升壓作用[70 ] 。在隨后的構(gòu)效研究工作中又發(fā)現(xiàn)脂溶性的類似物 dansyl2PQRF2NH2 具有 NPFF樣的激動(dòng)活性。在 daY8Ra 的設(shè)計(jì)思路的啟示下 ,設(shè)計(jì)并合成了 NPFF 受體的可能的脂溶性假定拮抗劑dansyl2PQR2NH2[71 ] 。在隨后的活性檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)它能與 NPFF 受體有一定的結(jié)合 ( Ki = 1316μmolΠL) ,并且它在阿片成癮和環(huán)境位置偏愛(CPP) 實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出拮抗劑的活性[63 ,72 ] 。最新的報(bào)道還發(fā)現(xiàn)靜脈注射dansyl2PQR2NH2 能引起一明顯的降壓作用 ,并且它能減弱 NPFF 所引起的升壓作用[59 ,70 ] 。以 dansyl2PQR2NH2 為化學(xué)模板 ,利用組合化學(xué)的方法通過保留 Arg 殘基而分別替換 Pro 和 Glu 殘基 ,從化合物庫篩選優(yōu)化得到一個(gè)親合性更高的類似物 ———dansyl2GSR2NH2 ( Ki = 114μmolΠL)[68 ] 。
NPFF受體非肽類拮抗劑都是在 NPFF 的 C 末端 RF2NH2 的基礎(chǔ)上通過化學(xué)修飾而得到的 ,目前已報(bào)道的主要有以下系列 : (1) BIBP3226 及其衍生物 ; (2) RF 系列化合物(圖 1) 。
BIBP3226 最初是作為 NPY Y1 受體的選擇性拮抗劑而被發(fā)現(xiàn)[73 ,74 ],最近的研究表明它也能結(jié)合NPFF 受體 ,特別是 NPFF1 受體 ,并且在體外的檢測(cè)中表現(xiàn)出拮抗活性[45 ,49 ,64 ,75 ] 。我們進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn) BIBP3226 在一系列的體外和體內(nèi)藥理學(xué)活性實(shí)驗(yàn)中都能拮抗 NPFF 和 NPVF 所引起的激動(dòng)活性[76 ,77 ] 。有趣的是 ,NPY受體的一些其它非肽類配體也能有效地結(jié)合 NPFF 受體 ,如 NPY Y1 受體的選擇性拮抗劑 BIBO3304 和 NPY Y1 受體拮抗劑/Y4 受體激動(dòng)劑 GR231118 , 并有報(bào)道表明 BIBO3304 和GR231118 在體外的功能實(shí)驗(yàn)中分別表現(xiàn)為 NPFF 受體的拮抗劑和激動(dòng)劑[45 ,75 ] 。此外 ,為了進(jìn)一步優(yōu)化BIBP3226 來尋找 NPFF 受體的選擇性拮抗劑 ,設(shè)計(jì)合成了一系列 BIBP3226 類似物 ,雖然部分類似物對(duì)NPFF1 和 NPFF2 受體具有一定的選擇性 ,但遺憾的是 ,它們同時(shí)也與 NPY Y1 受體結(jié)合從而限制了它們?cè)谒幚韺W(xué)功能鑒定中的廣泛使用[45 ] 。
最近的報(bào)道表明 ,根據(jù) NPFF 的 C 末端的關(guān)鍵位點(diǎn) RF2NH2 結(jié)構(gòu) ,以 RF2NH2 為模板 ,通過其 N 端連接不同的衍生基團(tuán)而獲得了近百個(gè)非肽類的化合物 ,并通過活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這些類似物中的 RF2、RF9和 RF48 對(duì)于 NPFF 受體有較好的親合力[65 ] 。RF9對(duì)于 NPFF1 和 NPFF2 受體的親合力最高 ,而且其對(duì)于阿片受體和其他的 RF 家族相關(guān)受體都沒有結(jié)合 ,因此 RF9 是一個(gè)對(duì)于 NPFF 受體具有選擇性的高效拮抗劑。在體的研究表明 ,RF9 本身不影響大鼠的血壓和心率 ,卻可以抑制 NPFF 引起的大鼠平均動(dòng)脈壓和心率升高 ,所以 NPFF 對(duì)于血壓和心率的調(diào)節(jié)是直接通過其受體作用的。使用 RF9 本身不影響大鼠的基礎(chǔ)痛閾 ,而 RF9 可以通過阻斷 NPFF的受體有效地抑制長期注射海洛因引起的痛敏和耐受[65 ] 。因此 ,NPFF 受體高效拮抗劑的發(fā)現(xiàn)對(duì)于提高嗎啡治療慢性痛的效果有重要的藥用價(jià)值。我們還發(fā)現(xiàn) RF9 能有效地拮抗 NPFF 在體溫和痛覺調(diào)節(jié)中的激動(dòng)活性(待發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果) 。
此外 ,藥物公司利用一些有機(jī)小分子來模擬NPFF 的 C 末端化學(xué)結(jié)構(gòu) ,從而發(fā)現(xiàn)了部分有機(jī)小分子也具有較好的 NPFF 拮抗活性[55 ] 。
4 結(jié)語
隨著近年來內(nèi)源性阿片調(diào)節(jié)肽在阿片的耐受和依賴中的作用越來越受到人們的關(guān)注 ,NPFF 藥理學(xué)功能的研究也備受重視。與此同時(shí) ,最近幾年來RFa 肽家族新成員的出現(xiàn) ,RFa 肽相關(guān)的論文也不斷增多 , 特別是去年國際多肽領(lǐng)域的知名刊物Peptides 專門出版了一期以 RFa 肽為主題的特刊 ,這也給 NPFF 的研究帶了新的發(fā)展機(jī)遇。揭示 NPFF1和 NPFF2 受體ΠNPFF 系統(tǒng)的藥理學(xué)功能及其作用機(jī)制必將成為 NPFF 及 RFa 肽研究的熱點(diǎn)問題之一。發(fā)展 NPFF1 和 NPFF2 受體的選擇性拮抗劑和激動(dòng)劑 ,對(duì)于促進(jìn) NPFF 的研究具有十分重要的意義。
利用多肽化學(xué)生物學(xué)等研究手段進(jìn)一步系統(tǒng)地研究 NPFF 的構(gòu)效關(guān)系對(duì)于探討 NPFF 的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系具有重要的促進(jìn)作用 ,這將為 NPFF受體的選擇性激動(dòng)劑和拮抗劑的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù) ,并進(jìn)一步為 NPFF 相關(guān)肽及其受體的研究提供有效的藥理學(xué)工具。此外 ,設(shè)計(jì)、優(yōu)化和篩選 NPFF1和 NPFF2 受體專一性的有機(jī)小分子配體也是尋找有效的 NPFF 藥理學(xué)研究工具的捷徑 ,并且這些高效的配體都具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
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