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訂書肽的合成與應(yīng)用
瀏覽量:533 | 2024/5/30 15:11:52


摘 要 許多重要的生物過程的調(diào)節(jié)都通過蛋白⁃蛋白相互作用來實(shí)現(xiàn)的。一般,蛋白⁃蛋白作用的界面太大而不能被小分子藥物選擇性靶向,因此小分子藥物很難高效特異性地阻斷該類型的相互作用。此外,由于蛋白質(zhì)藥物很難透過細(xì)胞膜,它們也不能直接靶向細(xì)胞內(nèi)的相互作用。由于當(dāng)前藥物分子的限制,發(fā)展下一代既能進(jìn)入細(xì)胞膜又能特異性靶向蛋白⁃蛋白相互作用的分子成為新的研究熱點(diǎn)。為了克服上述藥物分子的缺點(diǎn),Verdine 等發(fā)展了一種全碳支架的具有 α⁃螺旋結(jié)構(gòu)的新型多肽,這種多肽被稱作訂書肽( stapledpeptides)。相比于天然多肽,訂書肽有更高的酶解穩(wěn)定性并且可以進(jìn)入細(xì)胞膜,從而提高了它的藥理性能。本文將從訂書肽的化學(xué)合成、生物物理性能的表征和其在癌癥和 HIV 治療、信號(hào)通路的調(diào)節(jié)和腫瘤激活蛋白的抑制方面的生物應(yīng)用詳細(xì)介紹訂書肽的最新進(jìn)展。


蛋白⁃蛋白相互作用(PPI)在許多生物過程中扮演著重要的角色,例如病毒的自組裝,細(xì)胞的增殖、生長、分化及程序性死亡。人類疾病中許多潛在的治療靶標(biāo)主要是蛋白⁃蛋白相互作用。由于大部分PPI 面比較大而且是不連續(xù)的平面,小分子試劑很難與其特異性緊密結(jié)合。目前,大約有 10% 的胞外疾病可以利用蛋白類藥物來治療。蛋白藥物最大的缺點(diǎn)是不能透過細(xì)胞膜,因而無法靶向于胞內(nèi)靶標(biāo)。基于小分子和蛋白類藥物的局限,發(fā)展能穿過細(xì)胞膜的多肽、蛋白質(zhì)和核酸逐漸成為藥物研究的前沿問題。最近生物大分子化學(xué)合成方面取得了一些新的進(jìn)展, 為研發(fā)這類藥物提供了有力的技術(shù)工具[1 ~ 21]。


最近研究表明,具有 α 螺旋結(jié)構(gòu)和富含正電荷的多肽[22 ~ 24]可以穿過細(xì)胞膜。因此,越來越多的研究開始關(guān)注含有 α 螺旋結(jié)構(gòu)的多肽的合成與應(yīng)用。然而,多肽一旦從母體上分離就不能保持原有的二級(jí)結(jié)構(gòu),由于構(gòu)象的不穩(wěn)定,多肽與作用蛋白的結(jié)合能力非常弱,而普通的線性多肽不能透過細(xì)胞膜,且易被蛋白酶水解[25]。基于此,人們不斷嘗試發(fā)展穩(wěn)定 α 螺旋結(jié)構(gòu)的方法,例如,利用二硫鍵或分子內(nèi)酰胺鍵作為支架。然而,這些支架在生理環(huán)境下均不能穩(wěn)定存在。2000 年,Verdine 等發(fā)展了一種用碳碳鍵作為支架來穩(wěn)定多肽 α 螺旋結(jié)構(gòu)的方法[26]。由 該 方 法 得 到 的 多 肽 稱 為 訂 書 肽 ( stapledpeptides)。訂書肽有著更高的 α 螺旋程度,與靶標(biāo)的結(jié)合能力增加 5 ~ 5 000 倍。此外,訂書肽能透過細(xì)胞膜,難被蛋白酶水解,在生物體內(nèi)的半衰期較長。本文將主要從合成方法、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能及前景展望來 4 個(gè)方面介紹訂書肽。表 1 為三種藥物分子優(yōu)缺點(diǎn)比較。

2 訂書肽的合成與修飾


訂書肽的合成策略如下,首先在固相合成多肽鏈過程中引入兩個(gè) α⁃甲基,α⁃烯基非天然氨基酸,然后通過烯烴復(fù)分解反應(yīng)(RCM) 環(huán)化,得到訂書肽[27]。
α⁃甲基,α⁃烯基非天然氨基酸因含有手性中心,需采用手性基團(tuán)誘導(dǎo)來合成。以 S⁃型 α⁃甲基,α⁃烯基非天然氨基酸的合成為例,我們簡單介紹合成該類物質(zhì)的一般方法,見圖 1。首先,在三乙胺催化下,手性輔基試劑(1R,2S)⁃2⁃胺基⁃1,2⁃二苯乙醇與2⁃溴丙酸乙酯發(fā)生親核取代反應(yīng),并采用(Boc)2O保護(hù)自由胺基;接下來,在對(duì)甲基苯磺酸的催化下,環(huán)狀的含有手性輔基的丙氨酸前體得以高效生成,在堿性催化劑和低溫下,烯基基團(tuán)高效立體選擇性地連接到氨基酸的 α⁃位。最后,在氨基鋰條件下脫去手性輔基,并采用 Fmoc 基團(tuán)保護(hù) α⁃胺基。

2.1 非天然氨基酸插入位點(diǎn)的選擇

為了使訂書肽與靶點(diǎn)蛋白質(zhì)的相互作用不受外加非天然結(jié)構(gòu)的影響,選擇非天然氨基酸的插入位點(diǎn)至關(guān)重要。通過對(duì)蛋白質(zhì)的核磁或晶體數(shù)據(jù)的分析,可以選擇與靶向蛋白相互用的 α 螺旋多肽片段為研究對(duì)象,同時(shí)選擇不參與靶向蛋白作用的氨基酸殘基作為非天然氨基酸插入的潛在位點(diǎn)。如果缺乏上述數(shù)據(jù),也可以首先合成一系列鎖定多肽,然后通過活性篩選的方法選出最優(yōu)結(jié)構(gòu)的訂書肽。通常,一對(duì)用于 RCM 反應(yīng)的非天然氨基酸的合成流程[28,29]及插入在多肽序列的 i,i + 3 位,i,i + 4 位或者 i,i + 7 位的位點(diǎn),如圖 1。一般而言,選擇合成的構(gòu)象鎖定 α 螺旋多肽的長度不超過 20 個(gè)氨基酸[30]。在設(shè)計(jì)多肽過程中,電荷也是影響訂書肽功能的重要因素,正電荷有利于多肽跨膜,而負(fù)電荷不利于跨膜。研究發(fā)現(xiàn),將正負(fù)電荷分別放在肽鏈的碳末端和氮末端可以產(chǎn)生額外的氫鍵結(jié)合,該結(jié)構(gòu)能中和訂書肽產(chǎn)生的大的偶極作用。


2. 2 訂書肽的合成
通常采用 Fmoc⁃固相多肽合成方法制備訂書肽。普通氨基酸的側(cè)鏈由對(duì)酸不穩(wěn)定的保護(hù)基保護(hù),α⁃氨基由被對(duì)堿不穩(wěn)定的 Fmoc 保護(hù)基保護(hù)。兩個(gè)用于構(gòu)象鎖定的氨基酸均為 α⁃甲基,α⁃烯基非天然氨基酸。這兩個(gè)非天然氨基酸間隔一般為兩個(gè)、三個(gè)或者六個(gè)氨基酸,其中 i, i + 3⁃位和 i, i + 4⁃位穩(wěn)定一個(gè) α⁃螺旋,i, i + 7⁃位穩(wěn)定兩個(gè) α⁃螺旋,如圖 1?梢愿鶕(jù)碳端官能團(tuán)來選擇樹脂,如需碳端保留羧基,可以選擇 2⁃cl⁃trt 樹脂或 Wang 樹脂;如需碳端為酰胺,可以選擇 Rink Amide⁃AM 樹脂。多肽合成完成后,采用釕作為催化劑進(jìn)行烯烴復(fù)分解反應(yīng)關(guān)環(huán),形成碳碳鍵支架。根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要,訂書肽可以在固相上進(jìn)行進(jìn)一步的修飾。最后,將目標(biāo)多肽從樹脂上切割下來進(jìn)行純化,圖 2 為 i, i + 4⁃位訂書肽合成的流程示意圖。

2.3 訂書肽的修飾
在從樹脂上切割下訂書肽之前,將多肽氮端去保護(hù),裸露出 α⁃氨基,繼而可以在該位置進(jìn)行不同的修飾。如果不需要氨基的電荷,可以進(jìn)行乙;揎;如果需要其他修飾,可以進(jìn)一步進(jìn)行修飾。訂書肽的修飾大致可以分為兩類:熒光素類標(biāo)簽(主要是熒光素)和親和類標(biāo)簽(主要是生物素)。圖 3為主要的訂書肽的修飾過程。訂書肽氮端修飾熒光素可以用來研究多肽的細(xì)胞吸收和生物物理性質(zhì);氮端修飾生物素可用來研究多肽的生物物理性質(zhì)和評(píng)價(jià)生物體內(nèi)的靶向反應(yīng)。當(dāng)修飾氮端的時(shí)候,必須考慮修飾的位置是否會(huì)影響訂書肽與靶向蛋白的結(jié)合能力。此外,也可以對(duì)訂書肽的碳端進(jìn)行修飾。2011年,Muppidi 等發(fā)展了在訂書肽的碳端修飾精氨酸的方法[31]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,碳端精氨酸修飾不僅增加了訂書肽的 α 螺旋程度,而且增強(qiáng)了訂書肽的細(xì)胞入膜性,并且無明顯的細(xì)胞毒性。

2.4 長鏈訂書肽的合成

一般認(rèn)為,由 30 個(gè)以上氨基酸殘基組成的訂書肽的合成不能通過固相合成一次高效合成,而需要多肽片段連接反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。2013 年, Pentelute 課題組, 用 “ 自 然 化 學(xué) 連 接 反 應(yīng) ” ( native chemicalligation,NCL) 的方法合成了長鏈非經(jīng)典的訂書肽(其側(cè)鏈為半胱氨酸與六氟化苯或十氟聯(lián)苯反應(yīng)關(guān)環(huán),而非 Verdine 型訂書肽)從而使訂書肽的得到更廣泛的應(yīng)用[19]。他們采用的連接方法為 Kent 發(fā)明的 NCL[1],它涉及氮端半胱氨酸肽段與碳端硫酯肽段。NCL 在蛋白質(zhì)合成與半合成中取得了廣泛的應(yīng)用,但是碳端硫酯的 Fmoc 化學(xué)合成還存在挑戰(zhàn)。近期的一個(gè)改進(jìn)方法是我們發(fā)展的利用碳端酰肼代替硫酯進(jìn)行多肽酰肼連接技術(shù)[6],該方法基本原理是在弱酸條件下多肽酰肼被亞硝酸氧化為酰基疊氮,并在芳基硫醇存在下原位轉(zhuǎn)化為硫酯后與 N 端Cys 肽實(shí)現(xiàn)化學(xué)選擇性連接反應(yīng)。與硫酯相比,碳端酰肼肽可以直接采用 Fmoc 法固相合成高效得到,且易于自動(dòng)化。此外,酰肼肽可以實(shí)現(xiàn)生物表達(dá),使酰肼法應(yīng)用范圍更加廣泛。


3 訂書肽生物物理性質(zhì)的表征


訂書肽的結(jié)構(gòu)和生物活性可以通過多種生物物理的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行表征,例如,圓二色光譜[32]、二維核磁共振譜、X 射線單晶衍射、熒光偏振和表面等離子體共振等。我們從以下 5 個(gè)方面來闡述該方面的進(jìn)展。


3.1 訂書肽結(jié)構(gòu)的表征
圓二色光譜、核磁共振譜和 X 射線單晶衍射均可以用來表征訂書肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。圓二色光譜可用來表征訂書肽的 α 螺旋的穩(wěn)定程度。在多肽中主要的光活性基團(tuán)是肽鏈骨架中的肽鍵、氨基酸的芳香殘基和二硫鍵。如果多肽含有不規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu),那么其圓二色光譜在 195 nm處將有一個(gè)強(qiáng)的吸收峰;如果多肽含有 α 螺旋結(jié)構(gòu),那么其圓二色光譜在 208 nm 和 222 nm 處均有吸收峰。已知多肽的濃度,可以根據(jù)圓二色光譜在222 nm 的吸收信號(hào)來定量訂書肽的 α 螺旋程度。通過對(duì)訂書肽在不同溫度下的圓二色光譜的測(cè)試,可以直觀研究多肽構(gòu)象的熱穩(wěn)定性。Baek 等用圓二色譜表征了 SAH⁃p53⁃8 的結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)了支架結(jié)構(gòu)能穩(wěn)定多肽的 α 螺旋[33]。

核磁共振譜和 X 射線單晶衍射可以直接模擬出訂書肽的實(shí)際結(jié)構(gòu),并可以確定訂書肽與靶蛋白的結(jié)合位點(diǎn),為進(jìn)一步的訂書肽的設(shè)計(jì)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Phillips 等設(shè)計(jì)了靶向雌激素受體的訂書肽[34]。通過對(duì)一系列鎖定多肽的核磁與單晶衍射結(jié)構(gòu)的表征,他們發(fā)現(xiàn)訂書肽的碳碳支架會(huì)影響其與疏水蛋白表面的相互作用。


3.2 訂書肽與靶蛋白結(jié)合能力表征

熒光偏振與表面等離子共振技術(shù)可以用于多肽與靶向蛋白結(jié)合能力的測(cè)定,并且能定量測(cè)量訂書肽結(jié)合常數(shù)[35 ~ 38]。


偏振熒光的強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān),與其受激發(fā)時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)速度呈反相關(guān)。在固相多肽合成的過程中將一個(gè)熒光基團(tuán)引入訂書肽,如異硫氰酸熒光素。在溶液中,靶向蛋白與訂書肽結(jié)合,可以產(chǎn)生熒光偏振,熒光偏振程度與多肽綁定在靶向蛋白的數(shù)量有關(guān)。通過測(cè)量偏振熒光,可以定量測(cè)定多肽與靶向蛋白的結(jié)合常數(shù)。另一種改進(jìn)的熒光偏振方法可以測(cè)定不含熒光基團(tuán)的訂書肽阻斷蛋白⁃蛋白相互作用的能力。在這種改進(jìn)的熒光偏振中,含有熒光修飾的線性天然多肽與不含熒光修飾的訂書肽混合在一起。通過對(duì)含有熒光標(biāo)記的天然多肽熒光偏振降低程度的測(cè)量,來測(cè)量訂書肽阻斷天然多肽與蛋白靶向的結(jié)合能力。2009 年,Bautista等[39]用熒光偏振的方法,分析了構(gòu)象鎖定的 β 多肽與 hDM2 之間的結(jié)合能力。他們發(fā)現(xiàn)構(gòu)象鎖定的 β多肽與靶蛋白的結(jié)合能力與引入構(gòu)象鎖定支架的位置相關(guān),有些位置可以明顯增強(qiáng)結(jié)合能力,有些位置卻會(huì)明顯降低結(jié)合能力。


在表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)中,首先將生物素修飾的訂書肽固定在生物傳感芯片上,然后將其暴露于靶向蛋白中。這樣訂書肽與靶向蛋白之間的相互作用可以被直接測(cè)定,并且可以得到結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過程。表面等離子體實(shí)驗(yàn)也可以用于測(cè)定訂書肽抑制蛋白復(fù)合物形成的程度。將蛋白復(fù)合物固定在生物傳感芯片上,然后將其暴露在訂書肽中,這樣可以測(cè)定訂書肽對(duì)多蛋白復(fù)合物的結(jié)合與解離動(dòng)力學(xué)影響。


3. 3 訂書肽酶解穩(wěn)定性的表征

從人工合成多肽到藥物,多肽的酶解穩(wěn)定性成為一個(gè)重要的指標(biāo),也是一個(gè)主要的障礙。由于蛋白水解酶水解酰胺鍵需要多肽有一個(gè)舒展的構(gòu)象,因此用支架來鎖定多肽的 α 螺旋結(jié)構(gòu)可以有效地抑制多肽被蛋白水解酶水解。為了評(píng)估多肽的體外酶解穩(wěn)定性,需要基于訂書肽的序列選擇蛋白水解酶。胰蛋白酶可以識(shí)別精氨酸 ( Arg) 和 賴 氨 酸(Lys),糜蛋白酶主要識(shí)別苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、亮氨酸(Leu)和甲硫氨酸(Met)。Bird 等[40]表征了 Bcl⁃2 域的訂書肽,并進(jìn)行了酶解穩(wěn)定性的測(cè)定。他們通過對(duì)比熒光素標(biāo)記的訂書肽與熒光素標(biāo)記的線性肽在胰蛋白酶存在下不同時(shí)間段的熒光強(qiáng)度變化來確定訂書肽的酶解穩(wěn)定性。對(duì)訂書肽進(jìn)行體內(nèi)或體外的血清穩(wěn)定性測(cè)定可以更加明確地表明多肽的酶解穩(wěn)定性。


3.4 訂書肽入膜性的表征

流式細(xì)胞計(jì)和共聚焦熒光顯微鏡這兩種方法可以利用熒光標(biāo)記訂書肽來研究多肽的細(xì)胞通透性[41]。單個(gè)含有熒光分子的細(xì)胞可以便捷地被流式細(xì)胞計(jì)篩選出,這樣可以精確了解訂書肽的入膜效果。但是,流式細(xì)胞計(jì)數(shù)不能觀察訂書肽在細(xì)胞中的具體位置。由于黏附在細(xì)胞表面的訂書肽會(huì)產(chǎn)生入膜的錯(cuò)誤信息,在分析訂書肽入膜性時(shí),必須用胰蛋白酶除去吸附細(xì)胞表面的訂書肽。共聚焦熒光顯微鏡法研究的細(xì)胞數(shù)量明顯要少于流式細(xì)胞計(jì)所研究的數(shù)目。需要指出的是,共聚焦熒光顯微鏡法可以研究訂書肽的入膜的更多細(xì)節(jié),如訂書肽在細(xì)胞內(nèi)的具體位置,但是共聚焦顯微鏡法只能定性的判斷多肽是否能進(jìn)入細(xì)胞。最近發(fā)展了一種可以定量測(cè)定多肽入膜性的熒光顯微鏡法,也可以直接定量比較多肽的入膜性差異,但不能提供可視化信息。


Muppidi 等[31]采用流式細(xì)胞計(jì)和共聚焦熒光顯微鏡研究了精氨酸修飾的訂書肽的入膜過程。通過流式細(xì)胞計(jì)的方法,他們發(fā)現(xiàn)精氨酸修飾的訂書肽可以明顯提高多肽的入膜性;利用共聚焦顯微鏡法,他們進(jìn)一步的確認(rèn)了該結(jié)果,并提出精氨酸修飾的訂書肽的入膜可能是通過內(nèi)吞機(jī)理實(shí)現(xiàn)的。


3.5 訂書肽生物活性的表征

理論計(jì)算結(jié)構(gòu)表明訂書肽中支架的局部穩(wěn)定作用比 α 螺旋程度對(duì)生物活性的影響可能更大,測(cè)定訂書肽的生物活性也成為必不可少的一步。體外免疫共沉淀可以測(cè)定訂書肽在細(xì)胞環(huán)境下與靶蛋白的結(jié)合能力[42 ~ 45]。訂書肽的免疫共沉淀過程可以簡述為用抗體將目標(biāo)蛋白特異性沉淀下來,同時(shí)與目標(biāo)蛋白結(jié)合的訂書肽也一起被沉淀。常用兩種訂書肽進(jìn)行該實(shí)驗(yàn),一種是利用熒光素標(biāo)記的訂書肽,另一種是利用生物素標(biāo)記的訂書肽。具體步驟主要為,在細(xì)胞裂解液中加入靶蛋白的特異性抗體,孵育一段時(shí)間后,加入與抗體特異性結(jié)合的瓊脂糖上的蛋白 A 或蛋白 G。當(dāng)訂書肽與靶蛋白結(jié)合時(shí),訂書肽也同時(shí)被沉降;沉淀復(fù)合物通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳又被分開;最后采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)構(gòu)象鎖定肽與靶蛋白結(jié)合。


訂書肽是否具有潛在的醫(yī)學(xué)應(yīng)用是通過活體內(nèi)其功能的測(cè)量來評(píng)估的。將訂書肽注入到活的患病動(dòng)物體內(nèi),觀察和測(cè)定動(dòng)物體內(nèi)各項(xiàng)生理指標(biāo)以確定訂書肽的生物活性。


4 訂書肽的生物醫(yī)學(xué)功能與應(yīng)用


到目前為止,國際上有許多課題組都在從事與訂書肽相關(guān)的研究,并取得了一定的成果。訂書肽在治療癌癥、抑制艾滋病和丙型肝炎以及調(diào)節(jié)信號(hào)通路等方面的應(yīng)用均有報(bào)道。下面主要將從這幾個(gè)方面簡單介紹一下訂書肽的醫(yī)學(xué)應(yīng)用。


4. 1 訂書肽在癌病防治中的應(yīng)用
4.1.1 調(diào)控 p53 基因
p53 基因是一種抑癌基因,是細(xì)胞生長周期中的負(fù)調(diào)節(jié)因子,與 DNA 的修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期的調(diào)控等生命過程有關(guān)。p53 的缺失和突變及相關(guān)蛋白酶體的降解會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生。修復(fù) p53的活性可以更加有效地治療癌癥。E3 泛素連接酶hDM2 直接結(jié)合在 p53 蛋白的反式激活域,靶向 p53蛋白進(jìn)行酶解如圖 4a 所示。hDM4 / hDMx 可以抑制p53 的活性。治療癌癥的一個(gè)有效的方法是尋找一種可以抑制 hDM2 / hDMx 與 p53 結(jié)合的活性分子; p53 序列而設(shè)計(jì)的多肽類抑制劑可以高效地結(jié)合 hDM2;但線性的多肽不能進(jìn)入細(xì)胞膜,且酶穩(wěn)定性差;诖耍 Bernal 等[35]利用碳碳支架設(shè)計(jì)合成構(gòu)象鎖定肽,明顯提高了多肽的入膜性和酶解穩(wěn)定性,訂書肽的結(jié)構(gòu)如圖 4b 與 4c 所示。含有 15 個(gè)氨基酸的構(gòu)象鎖定可以抑制 p53 蛋白與 hDM2 蛋白之間的相互作用。訂書肽的 α 螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)插入到hDM2 表面的疏水凹槽中從而抑制 p53 與之結(jié)合。該訂書肽中的三個(gè)氨基酸對(duì)于結(jié)合 hDM2 是必不可少的,分別是 19 位苯丙氨酸、23 位色氨酸和 26 位亮氨酸。SAH⁃p53 療法通過構(gòu)象鎖定肽 SAH 靶向轉(zhuǎn)錄過程激活 p53 達(dá)到抑制腫瘤。該策略的設(shè)計(jì)思路如下,首先,設(shè)計(jì)與 hDM2 相互作用的訂書肽,碳碳支架的位置盡量避開與 hDM2 結(jié)合的重要部位;其次,利用烯烴復(fù)分解反應(yīng)合成了 4 條 i,i + 7 位訂書肽(SAH⁃p53s 1 ~ 4);最后,對(duì)訂書肽 SAH⁃p53s 1~ 4 進(jìn)行生物物理實(shí)驗(yàn)表征。圓二色譜表明多肽的α 螺旋程度都有所增加;熒光偏振實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)訂書肽的親和力與天然多肽相近。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) SAH⁃p53s 1 ~ 4 均難以跨過細(xì)胞膜。在生理 pH 條件下,訂書肽 SAH⁃p53s 1 ~ 4 由于帶兩個(gè)負(fù)電荷而難以通過細(xì)胞膜。他們將天冬氨酸與谷氨酸分別替換為天冬酰胺與谷氨酰胺,發(fā)展了第二代多肽化合物 SAH⁃p53s 5 ~ 8。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明 SAH⁃p53 8 與 hDM2 有著高的親和性并可以跨過細(xì)胞膜。Western 印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí) SAM⁃p53 8 能恢復(fù) p53 的正常水平。該研究表明訂書肽可以用于阻斷蛋白⁃蛋白。

2010 年, Bernal 等[46] 對(duì) SAH⁃p53 8 調(diào)控 p53進(jìn)行 了 進(jìn) 一 步 的 研 究。hDMx 的 結(jié) 構(gòu) 分 析 發(fā) 現(xiàn)hDMx 抑制 p53 的反式激活的 α 螺旋與 hDM2 的模式極為相似。因而,他們測(cè)試 SAH⁃p53 8 對(duì) hDMx的靶向抑制作用,并且研究了 hDMx 被抑制后的體內(nèi) p53 功能變化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SAH⁃p53 8 可以有效地抑制 hDMx。SAH⁃p53 8 既可以靶向 hDM2 也可以靶向 hDMx,并且 SAH⁃p53 8 對(duì)于 hDMx 靶向能力比對(duì) hDM2 的靶向能力高 25 倍。SAH⁃p53 8 靶向細(xì)胞里的 hDMx,阻斷 p53⁃hDMX 復(fù)合物的形成,從而激活 p53 的腫瘤抑制通路。因此,對(duì) hDM2 和hDMx 雙靶向的抑制劑可以更好地用于治療癌癥。


4.1.2 對(duì)于 Bcl⁃2 蛋白家族的調(diào)控
B 淋巴細(xì)胞瘤⁃2 基因(B⁃cell lymphoma⁃2)簡稱Bcl⁃2,是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因之一。Bcl⁃2 基因是一種原癌基因,在抑制細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用。Bcl⁃2 家族蛋白是由 4 個(gè)保守的 Bcl⁃2 同源的區(qū)域組成,且每個(gè)同源域都包含一個(gè) α 螺旋結(jié)構(gòu)。根據(jù)在細(xì)胞凋亡過程中所起的功能不同,Bcl⁃2蛋白家族可以分為兩大類,一類具有抑制細(xì)胞調(diào)亡作用,如 Bcl⁃2、Bcl⁃XL、Bcl⁃1、Mcl⁃1 等;另一類具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用, 如 Bax、 Bcl⁃Xs、 Bak、 Bid 等。Bcl⁃2 家族蛋白構(gòu)成了一個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵點(diǎn)。最近研究發(fā)現(xiàn) Bcl⁃2 家族蛋白除了調(diào)控線粒體中凋亡因子的釋放外,還在生命活動(dòng)中扮演者許多新的角色,例如, 調(diào)節(jié)新陳代謝[47,48]、體內(nèi) Ca2 + 濃度[49]和線粒體形態(tài)[50]。Bcl⁃2 蛋白通過包含其中的 α 螺旋結(jié)構(gòu)的 BH3 片段來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的蛋白⁃蛋白相互作用,最終調(diào)節(jié)許多生物過程。
天然線性的短肽不能保持原有二級(jí)結(jié)構(gòu),難以進(jìn)入細(xì)胞膜,且對(duì)蛋白水解酶不穩(wěn)定。2004 年,Walensky 等[37]用碳碳支架來穩(wěn)定的短肽的構(gòu)象。通過模擬 Bid 的 BH3 區(qū)域,設(shè)計(jì)了一組具有穩(wěn)定 α螺旋結(jié)構(gòu)的訂書肽 SAHBs,如表 2 所示。通過對(duì)天然 BH3 與 SAHBs 的圓二色譜比較,他們發(fā)現(xiàn)天然多肽主要以不規(guī)則卷曲的形式存在,只有 16% 的 α螺旋程度;而 SAHBs 的 α 螺旋程度則提高到 35%到 87% 。酶解穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)證實(shí),與天然 BH3 相比,SAHBs 具有更高的酶解穩(wěn)定性以及血漿穩(wěn)定性。此外,他們還通過核磁實(shí)驗(yàn)分別研究 BH3 和SAHBA與 Bcl⁃XL 的相互作用。外加天然多肽 BidBH3 或者 SAHBA 于15 N 標(biāo)記的 BCL⁃XL 溶液后,采集 Bcl⁃XL 的二維15N⁃1H 異核單量子相關(guān)核磁共振譜( HSQC)。兩種 HSQC 譜圖極為相似, 這說明SAHBA和天然多肽 Bid BH3 與靶向蛋白 Bcl⁃XL 的相互作用模式相同。熒光偏振實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) SAHBA結(jié)合 Bcl⁃XL 的能力比天然多肽 Bid BH3 高 6 倍。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠的肝臟細(xì)胞中,SAHBA?xí)辜?xì)胞色素c 釋放增加,而天然多肽 Bid BH3 對(duì)細(xì)胞色素 c 釋放量幾乎沒有影響。這也進(jìn)一步證實(shí)了 SAHBA能夠激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。隨后的細(xì)胞入膜實(shí)驗(yàn)證明SAHBA可以進(jìn)入細(xì)胞膜。上述研究結(jié)果預(yù)示訂書肽SAHBs 有潛力成為治療癌癥或者其他疾病的藥物。

Bax 是 Bcl⁃2 家族蛋白中一個(gè)促凋亡因子。它位于細(xì)胞基質(zhì)中,其被激活后會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡。Bcl⁃2 等抗凋亡蛋白可以與 Bax 相互作用,抑制細(xì)胞的死亡。目前,科學(xué)家一致認(rèn)為細(xì)胞的凋亡是通過細(xì)胞凋亡蛋白與抗凋亡蛋白相互作用來調(diào)節(jié)的,然而在凋亡應(yīng)激反應(yīng)中激活 Bax 和 Bak 的機(jī)理仍然存在爭(zhēng)論。Gavathiotis 等發(fā)現(xiàn)訂書肽 SAHBs 可以直接激活 Bax 調(diào)節(jié)的線粒體凋亡[42]。通過 Bim SAHB與 Bax 復(fù)合物的二維15N⁃1H 異核單量子相關(guān)核磁共振譜與順磁弛豫增強(qiáng)核磁共振實(shí)驗(yàn),他們確定 Bax的激活位點(diǎn)與抗凋亡蛋白的典型模式完全不同。Bax 激活反應(yīng)引起了一系列動(dòng)態(tài)連續(xù)變化,包括構(gòu)象的改變與齊聚反應(yīng)。通過一系列訂書肽與 BAax結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),只要碳鏈支架不是位于結(jié)合位點(diǎn),Bim SAHB 均能有效地與 Bax 作用。該工作為癌癥的治療提供了一條新的思路,即建立細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的一個(gè)新的靶標(biāo),尋找訂書肽來激活癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡通路。


4.2 訂書肽在艾滋病治療中的應(yīng)用

人類免疫缺陷病毒(HIV)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒的一種。HIV 通過破壞人體的免疫能力,導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對(duì)抗原失去抵抗力,從而引發(fā)各種疾病包括癌癥。HIV⁃1 衣殼蛋白在病毒組裝中扮演著重要的角色,成為新型艾滋病療法的一個(gè)重要的靶標(biāo)。研究者曾報(bào)道一個(gè)含 12 個(gè)氨基酸的帶有 α 螺旋結(jié)構(gòu)的多肽(CAI) 可以在體外靶向衣殼的碳端區(qū)域( C⁃CA)阻斷病毒衣殼的組裝[51]。但是,該多肽因不能進(jìn)入細(xì)胞膜而在生物體內(nèi)不能發(fā)生作用,不適合作為抗病毒的藥物。CAI 在復(fù)合物 CAI⁃ C⁃CA 結(jié)合的結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過高分辨 X 射線晶體衍射法被解析[52]。Zhang 等[38] 通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化將 CAI 轉(zhuǎn)變成可以進(jìn)入細(xì)胞膜的訂書肽(NYAD⁃1)。首先,他們利用圓二色譜測(cè)試溶液中 NYAD⁃1 與 CAI 的二級(jí)結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)CAI 主要以無規(guī)則卷曲的形式存在,并無典型的 α螺旋結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果間接支持了結(jié)合誘導(dǎo) CAI 的構(gòu)象發(fā)生變化導(dǎo)致 CAI 與 C⁃CA 復(fù)合物的形成。不同的是,NYAD⁃1 有著明顯的 α 螺旋結(jié)構(gòu),其螺旋程度大約 為 80% 。通 過 核 磁 譜 圖 映 射, 他 們 發(fā) 現(xiàn)NYAD⁃1 和 CAI 分別與 C⁃CA 結(jié)合的化學(xué)位移非常相似,從而證明其結(jié)合方式也非常相似。通過共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn),證實(shí)訂書肽可以進(jìn)入細(xì)胞膜;通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),他們證實(shí)了 NYAD⁃1 可以抑制病毒的組裝。在病毒侵染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,NYAD⁃1 沒有任何活性,表明訂書肽對(duì)病毒進(jìn)入細(xì)胞膜的過程沒有抑制作用。這也進(jìn)一步確定 NYAD⁃1 通過直接結(jié)合在CA 上影響二聚界面的形成,阻礙成熟的和未成熟的病毒 衣 殼 的 形 成, 減 少 病 毒 感 染 人 體 內(nèi) 細(xì) 胞。NYAD⁃1 是對(duì)于抗 HIV⁃1 有著廣譜的抗病毒活性,有著被優(yōu)化成為一種新的治療艾滋病藥物的潛力。


許多鏈段長的多肽由于結(jié)構(gòu)的喪失和酶解穩(wěn)定性差而致使其生物利用性低。恩弗韋肽是由 36 個(gè)氨基酸組成的多肽,是第一個(gè)可以阻斷 HIV⁃1 進(jìn)入人體的膜融合抑制劑。它通過靶向病毒的融合片段來抑制 HIV⁃1 病毒的感染。但是,由于生物穩(wěn)定性差,不能口服,恩弗韋肽一直被限制成為補(bǔ)救型的醫(yī)療選擇。為了克服用作醫(yī)療多肽的酶解穩(wěn)定性差,Bird 等[53]設(shè)計(jì)并合成了碳碳骨架的構(gòu)象鎖定的恩弗韋肽(如表 3 所示),并對(duì)其進(jìn)行了生物物理和生物藥理學(xué)影響研究。他們選取恩弗韋肽(i,i + 4)的位置插入非天然氨基酸,經(jīng)過烯烴復(fù)分解形成構(gòu)象鎖定的恩弗韋肽。根據(jù) gp41 的晶體結(jié)構(gòu)選擇非天然氨基酸插入位點(diǎn)以確保訂書肽不會(huì)打斷 HR1 與HR2 直接相互作用的嚴(yán)格的疏水界面。經(jīng)過糜蛋白酶的酶解穩(wěn)定性測(cè)試,他們發(fā)現(xiàn)含有一個(gè)支架的恩弗韋肽的酶解穩(wěn)定遠(yuǎn)強(qiáng)于未修飾的恩弗韋肽;含有兩個(gè)支架的恩弗韋肽比一個(gè)支架的恩弗韋肽有著更強(qiáng)的酶解穩(wěn)定性?苟净钚詫(shí)驗(yàn)表明含有兩個(gè)支架的恩弗韋肽可以有效地抑制病毒的感染。此外,小鼠體內(nèi)酶解穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)具有兩個(gè)支架的訂書肽在體內(nèi)的半衰期有著顯著地提高,彌補(bǔ)了多肽類HIV⁃1 膜融合抑制劑的藥代動(dòng)力學(xué)缺陷。經(jīng)過小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)打兩個(gè)支架的恩弗韋肽有一定的口服利用度,在靈長類動(dòng)物中其潛在的口服利用度有待進(jìn)一步的研究。


4.3 訂書肽在信號(hào)通路中的應(yīng)用
4.3.1 調(diào)控 Notch 信號(hào)

Notch 信號(hào)通路是由局部細(xì)胞間相互作用而產(chǎn)生的,并與腫瘤形成和某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病有著密切的關(guān)系,具有復(fù)雜多樣的功能,如參與造血、T 細(xì)胞發(fā)育和血管生成等生理過程。Notch 蛋白參與一個(gè)保守的信號(hào)通路,可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和死亡。Notch 信號(hào)的持續(xù)時(shí)間跟強(qiáng)度被嚴(yán)格調(diào)控,在許多疾病中 Notch 蛋白功能喪失的突變已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。Notch 功能獲得性的突變與癌癥的發(fā)生有關(guān)。在急性 T 淋巴細(xì)胞白血病表達(dá)的 MAML1 的顯性抑制碎片( dnMAML1) 表明有著抑制 Notch 信號(hào)和細(xì)胞增殖的能力。一個(gè)構(gòu)象鎖定的 dnMAML1 碎片,可能抑制全長的 MAML1 與 ICN1⁃CSL 復(fù)合物的結(jié)合。區(qū)別于未修飾的多肽,訂書肽有著更高的結(jié)合靶向蛋白能力,更高的代謝穩(wěn)定性和血漿半衰期。


Moellering 等[36]根據(jù)人類 Notch1 四聚體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了一系列構(gòu)象鎖定的 α 螺旋的多肽(SAHMs),如表 4 所示。通過測(cè)試訂書肽的 α 螺旋程度、入膜性、與 ICN1⁃CSL 復(fù)合物與 MAML1 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力,他們篩選出理想的訂書肽 SAHM1。通過分析 Notch1 信號(hào)靶向基因的水平和 SAHM1 誘導(dǎo)的全表達(dá)譜,他們證實(shí)了 SAHM1 可以特異性抑制人體與小鼠的 Notch 信號(hào)通路,從而阻礙急性 T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的生成。該工作對(duì) SAHM1 存在潛在的醫(yī)療價(jià)值提供理論基礎(chǔ);SAHM1 是否可以成為醫(yī)療藥物仍需系統(tǒng)的研究。

4.3.2 調(diào)控 Wnt 信號(hào)
Wnt 信號(hào)通路可以調(diào)控細(xì)胞的形態(tài)、運(yùn)動(dòng)、增殖和分化。在胚胎發(fā)育、成人組織恒定和組織再生中,Wnt 信號(hào)通路扮演著重要的角色。異常的 Wnt 信號(hào)通路的活化與大多數(shù)的腫瘤發(fā)生有關(guān),然而該信號(hào)通路的抑制也會(huì)導(dǎo)致許多疾病,例如,骨質(zhì)疏松癥、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和朱伯特綜合癥。激活或者抑制 Wnt 信號(hào)通路可能提供一個(gè)有用的工具去了解干細(xì)胞的自我更新、分化和組織的形成。Axin直接與 β 連環(huán)蛋白作用,糖原合酶激酶 3β 調(diào)控Axin 的磷酸化和泛素化,如圖 5 所示。

最近,Cui 等[54]設(shè)計(jì)了可以激活 Wnt 信號(hào)通路的能入膜的訂書肽。該多肽旨在打破 Axin 與 β⁃連環(huán)蛋白之間的作用。他們化學(xué)合成了兩條訂書肽SAHPA1 與 SAHPA2;通過圓二色譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與線性的多肽 Axin 相比,兩條合成的訂書肽的 α 螺旋程度明 顯 提 高。體 外 pull⁃down 實(shí) 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) 表 明SAHPA1 結(jié)合 β 連環(huán)蛋白的結(jié)合能力比 SAHPA2 更強(qiáng)。細(xì) 胞 入 膜 性 實(shí) 驗(yàn) 和 免 疫 共 沉 淀 實(shí) 驗(yàn) 表 明SAHPA1 通過與 β⁃連環(huán)蛋白的結(jié)合可以有效地打破內(nèi)源的 Axin⁃β⁃連環(huán)蛋白復(fù)合物的生成。他們探索了對(duì)轉(zhuǎn)錄活性的影響,表明 SAHPA1 可以高度特異性地激活 Wnt 信號(hào)。


4.4 訂書肽在肝炎治療中的應(yīng)用
丙型肝炎是一種全球流行性傳染病,其主要病原體丙肝病毒(HCV)屬于黃病毒家族,是具有莢膜單股正鏈的 RNA 病毒。CD81 是 HCV 進(jìn)入宿主細(xì)胞的重要受體,因此如何阻斷丙肝病毒與 CD81 的相互作用成為研發(fā)丙肝病毒入膜抑制的重要靶標(biāo)。Cui 等[53]將構(gòu)象鎖定策略用于設(shè)計(jì) HCV 入膜抑制,他們合成了一系列可以模擬 CD81 的 LEL⁃helix D區(qū)的多肽,多肽結(jié)構(gòu)如表 5 所示。通過測(cè)試這些訂書肽抗 HCV 感染活性,他們發(fā)現(xiàn) SAHH5 對(duì) HCV 感染有 較 高 的 抑 制 活 性。在 HCVcc⁃JFH1、 HCVpp⁃JFH⁃1 和 HCVpp⁃con1 體系中,SAHH⁃5 對(duì) HCV 的半數(shù)抑制濃度分別為 39、17 和 35 μM。他們測(cè)試了訂書肽的抗蛋白酶解能力,發(fā)現(xiàn)訂書肽抗的蛋白酶解能力明顯高于線性的未修飾多肽。該工作是首次將構(gòu)象鎖定策略應(yīng)用到 HCV 入膜抑制劑領(lǐng)域,且成功找到高活性的訂書肽 SAHH⁃5,為 HCV 的治療提供了新的分子工具。

5 訂書肽的前景與展望


Verdine 等首次發(fā)明出碳碳鏈支架的訂書肽至今,從合成方法和生物應(yīng)用兩方面,均得到了快速的發(fā)展。傳統(tǒng)小分子體積過小不能有效地調(diào)節(jié)蛋白蛋白相互作用。訂書肽不僅可以作為一個(gè)潛在的醫(yī)療靶向,而且可以作為一個(gè)新的工具用于識(shí)別新的反應(yīng)位點(diǎn)及新的配體等。訂書肽比小分子有更多的選擇性,其價(jià)格又遠(yuǎn)低于抗體等生物制劑,而且可以入膜。同樣具有穩(wěn)定空間折疊結(jié)構(gòu)還有小蛋白(尤其是環(huán)蛋白)[56 ~ 65],這些分子的獨(dú)特性質(zhì),使得它們成為未來藥物發(fā)展值得探索的一個(gè)方向。隨著多肽連接技術(shù)的發(fā)展,大型訂書肽的合成成為現(xiàn)實(shí)。這將為發(fā)展新一代蛋白類藥物提供強(qiáng)有力的工具。我們有理由相信在未來幾年訂書肽類的藥物以及小蛋白藥物會(huì)不斷地投入到臨床,并獲得長足的發(fā)展。


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