摘 要 許多重要的生物過(guò)程的調(diào)節(jié)都通過(guò)蛋白⁃蛋白相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。一般，蛋白⁃蛋白作用的界面太大而不能被小分子藥物選擇性靶向，因此小分子藥物很難高效特異性地阻斷該類型的相互作用。此外，由于蛋白質(zhì)藥物很難透過(guò)細(xì)胞膜，它們也不能直接靶向細(xì)胞內(nèi)的相互作用。由于當(dāng)前藥物分子的限制，發(fā)展下一代既能進(jìn)入細(xì)胞膜又能特異性靶向蛋白⁃蛋白相互作用的分子成為新的研究熱點(diǎn)。為了克服上述藥物分子的缺點(diǎn)，Ｖｅｒｄｉｎｅ 等發(fā)展了一種全碳支架的具有 α⁃螺旋結(jié)構(gòu)的新型多肽，這種多肽被稱作訂書(shū)肽（ ｓｔａｐｌｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓ）。相比于天然多肽，訂書(shū)肽有更高的酶解穩(wěn)定性并且可以進(jìn)入細(xì)胞膜，從而提高了它的藥理性能。本文將從訂書(shū)肽的化學(xué)合成、生物物理性能的表征和其在癌癥和 ＨＩＶ 治療、信號(hào)通路的調(diào)節(jié)和腫瘤激活蛋白的抑制方面的生物應(yīng)用詳細(xì)介紹訂書(shū)肽的最新進(jìn)展。
蛋白⁃蛋白相互作用（ＰＰＩ）在許多生物過(guò)程中扮演著重要的角色，例如病毒的自組裝，細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化及程序性死亡。人類疾病中許多潛在的治療靶標(biāo)主要是蛋白⁃蛋白相互作用。由于大部分ＰＰＩ 面比較大而且是不連續(xù)的平面，小分子試劑很難與其特異性緊密結(jié)合。目前，大約有 １０％ 的胞外疾病可以利用蛋白類藥物來(lái)治療。蛋白藥物最大的缺點(diǎn)是不能透過(guò)細(xì)胞膜，因而無(wú)法靶向于胞內(nèi)靶標(biāo)�；谛》肿雍偷鞍最愃幬锏木窒蓿l(fā)展能穿過(guò)細(xì)胞膜的多肽、蛋白質(zhì)和核酸逐漸成為藥物研究的前沿問(wèn)題。最近生物大分子化學(xué)合成方面取得了一些新的進(jìn)展， 為研發(fā)這類藥物提供了有力的技術(shù)工具［１ ～ ２１］。
２ 訂書(shū)肽的合成與修飾
為了使訂書(shū)肽與靶點(diǎn)蛋白質(zhì)的相互作用不受外加非天然結(jié)構(gòu)的影響，選擇非天然氨基酸的插入位點(diǎn)至關(guān)重要。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的核磁或晶體數(shù)據(jù)的分析，可以選擇與靶向蛋白相互用的 α 螺旋多肽片段為研究對(duì)象，同時(shí)選擇不參與靶向蛋白作用的氨基酸殘基作為非天然氨基酸插入的潛在位點(diǎn)。如果缺乏上述數(shù)據(jù)，也可以首先合成一系列鎖定多肽，然后通過(guò)活性篩選的方法選出最優(yōu)結(jié)構(gòu)的訂書(shū)肽。通常，一對(duì)用于 ＲＣＭ 反應(yīng)的非天然氨基酸的合成流程［２８，２９］及插入在多肽序列的 ｉ，ｉ ＋ ３ 位，ｉ，ｉ ＋ ４ 位或者 ｉ，ｉ ＋ ７ 位的位點(diǎn)，如圖 １。一般而言，選擇合成的構(gòu)象鎖定 α 螺旋多肽的長(zhǎng)度不超過(guò) ２０ 個(gè)氨基酸［３０］。在設(shè)計(jì)多肽過(guò)程中，電荷也是影響訂書(shū)肽功能的重要因素，正電荷有利于多肽跨膜，而負(fù)電荷不利于跨膜。研究發(fā)現(xiàn)，將正負(fù)電荷分別放在肽鏈的碳末端和氮末端可以產(chǎn)生額外的氫鍵結(jié)合，該結(jié)構(gòu)能中和訂書(shū)肽產(chǎn)生的大的偶極作用。
一般認(rèn)為，由 ３０ 個(gè)以上氨基酸殘基組成的訂書(shū)肽的合成不能通過(guò)固相合成一次高效合成，而需要多肽片段連接反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。２０１３ 年， Ｐｅｎｔｅｌｕｔｅ 課題組， 用 “ 自 然 化 學(xué) 連 接 反 應(yīng) ” （ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｉｇａｔｉｏｎ，ＮＣＬ） 的方法合成了長(zhǎng)鏈非經(jīng)典的訂書(shū)肽（其側(cè)鏈為半胱氨酸與六氟化苯或十氟聯(lián)苯反應(yīng)關(guān)環(huán)，而非 Ｖｅｒｄｉｎｅ 型訂書(shū)肽）從而使訂書(shū)肽的得到更廣泛的應(yīng)用［１９］。他們采用的連接方法為 Ｋｅｎｔ 發(fā)明的 ＮＣＬ［１］，它涉及氮端半胱氨酸肽段與碳端硫酯肽段。ＮＣＬ 在蛋白質(zhì)合成與半合成中取得了廣泛的應(yīng)用，但是碳端硫酯的 Ｆｍｏｃ 化學(xué)合成還存在挑戰(zhàn)。近期的一個(gè)改進(jìn)方法是我們發(fā)展的利用碳端酰肼代替硫酯進(jìn)行多肽酰肼連接技術(shù)［６］，該方法基本原理是在弱酸條件下多肽酰肼被亞硝酸氧化為�；B氮，并在芳基硫醇存在下原位轉(zhuǎn)化為硫酯后與 Ｎ 端Ｃｙｓ 肽實(shí)現(xiàn)化學(xué)選擇性連接反應(yīng)。與硫酯相比，碳端酰肼肽可以直接采用 Ｆｍｏｃ 法固相合成高效得到，且易于自動(dòng)化。此外，酰肼肽可以實(shí)現(xiàn)生物表達(dá)，使酰肼法應(yīng)用范圍更加廣泛。
３ 訂書(shū)肽生物物理性質(zhì)的表征
訂書(shū)肽的結(jié)構(gòu)和生物活性可以通過(guò)多種生物物理的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行表征，例如，圓二色光譜［３２］、二維核磁共振譜、Ｘ 射線單晶衍射、熒光偏振和表面等離子體共振等。我們從以下 ５ 個(gè)方面來(lái)闡述該方面的進(jìn)展。
核磁共振譜和 Ｘ 射線單晶衍射可以直接模擬出訂書(shū)肽的實(shí)際結(jié)構(gòu)，并可以確定訂書(shū)肽與靶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，為進(jìn)一步的訂書(shū)肽的設(shè)計(jì)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Ｐｈｉｌｌｉｐｓ 等設(shè)計(jì)了靶向雌激素受體的訂書(shū)肽［３４］。通過(guò)對(duì)一系列鎖定多肽的核磁與單晶衍射結(jié)構(gòu)的表征，他們發(fā)現(xiàn)訂書(shū)肽的碳碳支架會(huì)影響其與疏水蛋白表面的相互作用。
熒光偏振與表面等離子共振技術(shù)可以用于多肽與靶向蛋白結(jié)合能力的測(cè)定，并且能定量測(cè)量訂書(shū)肽結(jié)合常數(shù)［３５ ～ ３８］。
偏振熒光的強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)，與其受激發(fā)時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)速度呈反相關(guān)。在固相多肽合成的過(guò)程中將一個(gè)熒光基團(tuán)引入訂書(shū)肽，如異硫氰酸熒光素。在溶液中，靶向蛋白與訂書(shū)肽結(jié)合，可以產(chǎn)生熒光偏振，熒光偏振程度與多肽綁定在靶向蛋白的數(shù)量有關(guān)。通過(guò)測(cè)量偏振熒光，可以定量測(cè)定多肽與靶向蛋白的結(jié)合常數(shù)。另一種改進(jìn)的熒光偏振方法可以測(cè)定不含熒光基團(tuán)的訂書(shū)肽阻斷蛋白⁃蛋白相互作用的能力。在這種改進(jìn)的熒光偏振中，含有熒光修飾的線性天然多肽與不含熒光修飾的訂書(shū)肽混合在一起。通過(guò)對(duì)含有熒光標(biāo)記的天然多肽熒光偏振降低程度的測(cè)量，來(lái)測(cè)量訂書(shū)肽阻斷天然多肽與蛋白靶向的結(jié)合能力。２００９ 年，Ｂａｕｔｉｓｔａ等［３９］用熒光偏振的方法，分析了構(gòu)象鎖定的 β 多肽與 ｈＤＭ２ 之間的結(jié)合能力。他們發(fā)現(xiàn)構(gòu)象鎖定的 β多肽與靶蛋白的結(jié)合能力與引入構(gòu)象鎖定支架的位置相關(guān)，有些位置可以明顯增強(qiáng)結(jié)合能力，有些位置卻會(huì)明顯降低結(jié)合能力。
在表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)中，首先將生物素修飾的訂書(shū)肽固定在生物傳感芯片上，然后將其暴露于靶向蛋白中。這樣訂書(shū)肽與靶向蛋白之間的相互作用可以被直接測(cè)定，并且可以得到結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。表面等離子體實(shí)驗(yàn)也可以用于測(cè)定訂書(shū)肽抑制蛋白復(fù)合物形成的程度。將蛋白復(fù)合物固定在生物傳感芯片上，然后將其暴露在訂書(shū)肽中，這樣可以測(cè)定訂書(shū)肽對(duì)多蛋白復(fù)合物的結(jié)合與解離動(dòng)力學(xué)影響。
從人工合成多肽到藥物，多肽的酶解穩(wěn)定性成為一個(gè)重要的指標(biāo)，也是一個(gè)主要的障礙。由于蛋白水解酶水解酰胺鍵需要多肽有一個(gè)舒展的構(gòu)象，因此用支架來(lái)鎖定多肽的 α 螺旋結(jié)構(gòu)可以有效地抑制多肽被蛋白水解酶水解。為了評(píng)估多肽的體外酶解穩(wěn)定性，需要基于訂書(shū)肽的序列選擇蛋白水解酶。胰蛋白酶可以識(shí)別精氨酸 （ Ａｒｇ） 和 賴 氨 酸（Ｌｙｓ），糜蛋白酶主要識(shí)別苯丙氨酸（Ｐｈｅ）、酪氨酸(Ｔｙｒ）、亮氨酸（Ｌｅｕ）和甲硫氨酸（Ｍｅｔ）。Ｂｉｒｄ 等［４０］表征了 Ｂｃｌ⁃２ 域的訂書(shū)肽，并進(jìn)行了酶解穩(wěn)定性的測(cè)定。他們通過(guò)對(duì)比熒光素標(biāo)記的訂書(shū)肽與熒光素標(biāo)記的線性肽在胰蛋白酶存在下不同時(shí)間段的熒光強(qiáng)度變化來(lái)確定訂書(shū)肽的酶解穩(wěn)定性。對(duì)訂書(shū)肽進(jìn)行體內(nèi)或體外的血清穩(wěn)定性測(cè)定可以更加明確地表明多肽的酶解穩(wěn)定性。
流式細(xì)胞計(jì)和共聚焦熒光顯微鏡這兩種方法可以利用熒光標(biāo)記訂書(shū)肽來(lái)研究多肽的細(xì)胞通透性［４１］。單個(gè)含有熒光分子的細(xì)胞可以便捷地被流式細(xì)胞計(jì)篩選出，這樣可以精確了解訂書(shū)肽的入膜效果。但是，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)不能觀察訂書(shū)肽在細(xì)胞中的具體位置。由于黏附在細(xì)胞表面的訂書(shū)肽會(huì)產(chǎn)生入膜的錯(cuò)誤信息，在分析訂書(shū)肽入膜性時(shí)，必須用胰蛋白酶除去吸附細(xì)胞表面的訂書(shū)肽。共聚焦熒光顯微鏡法研究的細(xì)胞數(shù)量明顯要少于流式細(xì)胞計(jì)所研究的數(shù)目。需要指出的是，共聚焦熒光顯微鏡法可以研究訂書(shū)肽的入膜的更多細(xì)節(jié)，如訂書(shū)肽在細(xì)胞內(nèi)的具體位置，但是共聚焦顯微鏡法只能定性的判斷多肽是否能進(jìn)入細(xì)胞。最近發(fā)展了一種可以定量測(cè)定多肽入膜性的熒光顯微鏡法，也可以直接定量比較多肽的入膜性差異，但不能提供可視化信息。
Ｍｕｐｐｉｄｉ 等［３１］采用流式細(xì)胞計(jì)和共聚焦熒光顯微鏡研究了精氨酸修飾的訂書(shū)肽的入膜過(guò)程。通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)的方法，他們發(fā)現(xiàn)精氨酸修飾的訂書(shū)肽可以明顯提高多肽的入膜性；利用共聚焦顯微鏡法，他們進(jìn)一步的確認(rèn)了該結(jié)果，并提出精氨酸修飾的訂書(shū)肽的入膜可能是通過(guò)內(nèi)吞機(jī)理實(shí)現(xiàn)的。
理論計(jì)算結(jié)構(gòu)表明訂書(shū)肽中支架的局部穩(wěn)定作用比 α 螺旋程度對(duì)生物活性的影響可能更大，測(cè)定訂書(shū)肽的生物活性也成為必不可少的一步。體外免疫共沉淀可以測(cè)定訂書(shū)肽在細(xì)胞環(huán)境下與靶蛋白的結(jié)合能力［４２ ～ ４５］。訂書(shū)肽的免疫共沉淀過(guò)程可以簡(jiǎn)述為用抗體將目標(biāo)蛋白特異性沉淀下來(lái)，同時(shí)與目標(biāo)蛋白結(jié)合的訂書(shū)肽也一起被沉淀。常用兩種訂書(shū)肽進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，一種是利用熒光素標(biāo)記的訂書(shū)肽，另一種是利用生物素標(biāo)記的訂書(shū)肽。具體步驟主要為，在細(xì)胞裂解液中加入靶蛋白的特異性抗體，孵育一段時(shí)間后，加入與抗體特異性結(jié)合的瓊脂糖上的蛋白 Ａ 或蛋白 Ｇ。當(dāng)訂書(shū)肽與靶蛋白結(jié)合時(shí)，訂書(shū)肽也同時(shí)被沉降；沉淀復(fù)合物通過(guò)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳又被分開(kāi)；最后采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)構(gòu)象鎖定肽與靶蛋白結(jié)合。
訂書(shū)肽是否具有潛在的醫(yī)學(xué)應(yīng)用是通過(guò)活體內(nèi)其功能的測(cè)量來(lái)評(píng)估的。將訂書(shū)肽注入到活的患病動(dòng)物體內(nèi)，觀察和測(cè)定動(dòng)物體內(nèi)各項(xiàng)生理指標(biāo)以確定訂書(shū)肽的生物活性。
４ 訂書(shū)肽的生物醫(yī)學(xué)功能與應(yīng)用
到目前為止，國(guó)際上有許多課題組都在從事與訂書(shū)肽相關(guān)的研究，并取得了一定的成果。訂書(shū)肽在治療癌癥、抑制艾滋病和丙型肝炎以及調(diào)節(jié)信號(hào)通路等方面的應(yīng)用均有報(bào)道。下面主要將從這幾個(gè)方面簡(jiǎn)單介紹一下訂書(shū)肽的醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
２０１０ 年， Ｂｅｒｎａｌ 等［４６］ 對(duì) ＳＡＨ⁃ｐ５３ ８ 調(diào)控 ｐ５３進(jìn)行 了 進(jìn) 一 步 的 研 究。ｈＤＭｘ 的 結(jié) 構(gòu) 分 析 發(fā) 現(xiàn)ｈＤＭｘ 抑制 ｐ５３ 的反式激活的 α 螺旋與 ｈＤＭ２ 的模式極為相似。因而，他們測(cè)試 ＳＡＨ⁃ｐ５３ ８ 對(duì) ｈＤＭｘ的靶向抑制作用，并且研究了 ｈＤＭｘ 被抑制后的體內(nèi) ｐ５３ 功能變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ＳＡＨ⁃ｐ５３ ８ 可以有效地抑制 ｈＤＭｘ。ＳＡＨ⁃ｐ５３ ８ 既可以靶向 ｈＤＭ２ 也可以靶向 ｈＤＭｘ，并且 ＳＡＨ⁃ｐ５３ ８ 對(duì)于 ｈＤＭｘ 靶向能力比對(duì) ｈＤＭ２ 的靶向能力高 ２５ 倍。ＳＡＨ⁃ｐ５３ ８ 靶向細(xì)胞里的 ｈＤＭｘ，阻斷 ｐ５３⁃ｈＤＭＸ 復(fù)合物的形成，從而激活 ｐ５３ 的腫瘤抑制通路。因此，對(duì) ｈＤＭ２ 和ｈＤＭｘ 雙靶向的抑制劑可以更好地用于治療癌癥。
Ｂａｘ 是 Ｂｃｌ⁃２ 家族蛋白中一個(gè)促凋亡因子。它位于細(xì)胞基質(zhì)中，其被激活后會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡。Ｂｃｌ⁃２ 等抗凋亡蛋白可以與 Ｂａｘ 相互作用，抑制細(xì)胞的死亡。目前，科學(xué)家一致認(rèn)為細(xì)胞的凋亡是通過(guò)細(xì)胞凋亡蛋白與抗凋亡蛋白相互作用來(lái)調(diào)節(jié)的，然而在凋亡應(yīng)激反應(yīng)中激活 Ｂａｘ 和 Ｂａｋ 的機(jī)理仍然存在爭(zhēng)論。Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ 等發(fā)現(xiàn)訂書(shū)肽 ＳＡＨＢｓ 可以直接激活 Ｂａｘ 調(diào)節(jié)的線粒體凋亡［４２］。通過(guò) Ｂｉｍ ＳＡＨＢ與 Ｂａｘ 復(fù)合物的二維１５Ｎ⁃１Ｈ 異核單量子相關(guān)核磁共振譜與順磁弛豫增強(qiáng)核磁共振實(shí)驗(yàn)，他們確定 Ｂａｘ的激活位點(diǎn)與抗凋亡蛋白的典型模式完全不同。Ｂａｘ 激活反應(yīng)引起了一系列動(dòng)態(tài)連續(xù)變化，包括構(gòu)象的改變與齊聚反應(yīng)。通過(guò)一系列訂書(shū)肽與 ＢＡａｘ結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只要碳鏈支架不是位于結(jié)合位點(diǎn)，Ｂｉｍ ＳＡＨＢ 均能有效地與 Ｂａｘ 作用。該工作為癌癥的治療提供了一條新的思路，即建立細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的一個(gè)新的靶標(biāo)，尋找訂書(shū)肽來(lái)激活癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡通路。
人類免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）屬于反轉(zhuǎn)錄病毒的一種。ＨＩＶ 通過(guò)破壞人體的免疫能力，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對(duì)抗原失去抵抗力，從而引發(fā)各種疾病包括癌癥。ＨＩＶ⁃１ 衣殼蛋白在病毒組裝中扮演著重要的角色，成為新型艾滋病療法的一個(gè)重要的靶標(biāo)。研究者曾報(bào)道一個(gè)含 １２ 個(gè)氨基酸的帶有 α 螺旋結(jié)構(gòu)的多肽（ＣＡＩ） 可以在體外靶向衣殼的碳端區(qū)域（ Ｃ⁃ＣＡ）阻斷病毒衣殼的組裝［５１］。但是，該多肽因不能進(jìn)入細(xì)胞膜而在生物體內(nèi)不能發(fā)生作用，不適合作為抗病毒的藥物。ＣＡＩ 在復(fù)合物 ＣＡＩ⁃ Ｃ⁃ＣＡ 結(jié)合的結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過(guò)高分辨 Ｘ 射線晶體衍射法被解析［５２］。Ｚｈａｎｇ 等［３８］ 通過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化將 ＣＡＩ 轉(zhuǎn)變成可以進(jìn)入細(xì)胞膜的訂書(shū)肽（ＮＹＡＤ⁃１）。首先，他們利用圓二色譜測(cè)試溶液中 ＮＹＡＤ⁃１ 與 ＣＡＩ 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ＣＡＩ 主要以無(wú)規(guī)則卷曲的形式存在，并無(wú)典型的 α螺旋結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果間接支持了結(jié)合誘導(dǎo) ＣＡＩ 的構(gòu)象發(fā)生變化導(dǎo)致 ＣＡＩ 與 Ｃ⁃ＣＡ 復(fù)合物的形成。不同的是，ＮＹＡＤ⁃１ 有著明顯的 α 螺旋結(jié)構(gòu)，其螺旋程度大約 為 ８０％ 。通 過(guò) 核 磁 譜 圖 映 射， 他 們 發(fā) 現(xiàn)ＮＹＡＤ⁃１ 和 ＣＡＩ 分別與 Ｃ⁃ＣＡ 結(jié)合的化學(xué)位移非常相似，從而證明其結(jié)合方式也非常相似。通過(guò)共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)，證實(shí)訂書(shū)肽可以進(jìn)入細(xì)胞膜；通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，他們證實(shí)了 ＮＹＡＤ⁃１ 可以抑制病毒的組裝。在病毒侵染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，ＮＹＡＤ⁃１ 沒(méi)有任何活性，表明訂書(shū)肽對(duì)病毒進(jìn)入細(xì)胞膜的過(guò)程沒(méi)有抑制作用。這也進(jìn)一步確定 ＮＹＡＤ⁃１ 通過(guò)直接結(jié)合在ＣＡ 上影響二聚界面的形成，阻礙成熟的和未成熟的病毒 衣 殼 的 形 成， 減 少 病 毒 感 染 人 體 內(nèi) 細(xì) 胞。ＮＹＡＤ⁃１ 是對(duì)于抗 ＨＩＶ⁃１ 有著廣譜的抗病毒活性，有著被優(yōu)化成為一種新的治療艾滋病藥物的潛力。
許多鏈段長(zhǎng)的多肽由于結(jié)構(gòu)的喪失和酶解穩(wěn)定性差而致使其生物利用性低。恩弗韋肽是由 ３６ 個(gè)氨基酸組成的多肽，是第一個(gè)可以阻斷 ＨＩＶ⁃１ 進(jìn)入人體的膜融合抑制劑。它通過(guò)靶向病毒的融合片段來(lái)抑制 ＨＩＶ⁃１ 病毒的感染。但是，由于生物穩(wěn)定性差，不能口服，恩弗韋肽一直被限制成為補(bǔ)救型的醫(yī)療選擇。為了克服用作醫(yī)療多肽的酶解穩(wěn)定性差，Ｂｉｒｄ 等［５３］設(shè)計(jì)并合成了碳碳骨架的構(gòu)象鎖定的恩弗韋肽（如表 ３ 所示），并對(duì)其進(jìn)行了生物物理和生物藥理學(xué)影響研究。他們選取恩弗韋肽（ｉ，ｉ ＋ ４）的位置插入非天然氨基酸，經(jīng)過(guò)烯烴復(fù)分解形成構(gòu)象鎖定的恩弗韋肽。根據(jù) ｇｐ４１ 的晶體結(jié)構(gòu)選擇非天然氨基酸插入位點(diǎn)以確保訂書(shū)肽不會(huì)打斷 ＨＲ１ 與ＨＲ２ 直接相互作用的嚴(yán)格的疏水界面。經(jīng)過(guò)糜蛋白酶的酶解穩(wěn)定性測(cè)試，他們發(fā)現(xiàn)含有一個(gè)支架的恩弗韋肽的酶解穩(wěn)定遠(yuǎn)強(qiáng)于未修飾的恩弗韋肽；含有兩個(gè)支架的恩弗韋肽比一個(gè)支架的恩弗韋肽有著更強(qiáng)的酶解穩(wěn)定性�？苟净钚詫�(shí)驗(yàn)表明含有兩個(gè)支架的恩弗韋肽可以有效地抑制病毒的感染。此外，小鼠體內(nèi)酶解穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)具有兩個(gè)支架的訂書(shū)肽在體內(nèi)的半衰期有著顯著地提高，彌補(bǔ)了多肽類ＨＩＶ⁃１ 膜融合抑制劑的藥代動(dòng)力學(xué)缺陷。經(jīng)過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)打兩個(gè)支架的恩弗韋肽有一定的口服利用度，在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中其潛在的口服利用度有待進(jìn)一步的研究。
Ｎｏｔｃｈ 信號(hào)通路是由局部細(xì)胞間相互作用而產(chǎn)生的，并與腫瘤形成和某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病有著密切的關(guān)系，具有復(fù)雜多樣的功能，如參與造血、Ｔ 細(xì)胞發(fā)育和血管生成等生理過(guò)程。Ｎｏｔｃｈ 蛋白參與一個(gè)保守的信號(hào)通路，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和死亡。Ｎｏｔｃｈ 信號(hào)的持續(xù)時(shí)間跟強(qiáng)度被嚴(yán)格調(diào)控，在許多疾病中 Ｎｏｔｃｈ 蛋白功能喪失的突變已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。Ｎｏｔｃｈ 功能獲得性的突變與癌癥的發(fā)生有關(guān)。在急性 Ｔ 淋巴細(xì)胞白血病表達(dá)的 ＭＡＭＬ１ 的顯性抑制碎片（ ｄｎＭＡＭＬ１） 表明有著抑制 Ｎｏｔｃｈ 信號(hào)和細(xì)胞增殖的能力。一個(gè)構(gòu)象鎖定的 ｄｎＭＡＭＬ１ 碎片，可能抑制全長(zhǎng)的 ＭＡＭＬ１ 與 ＩＣＮ１⁃ＣＳＬ 復(fù)合物的結(jié)合。區(qū)別于未修飾的多肽，訂書(shū)肽有著更高的結(jié)合靶向蛋白能力，更高的代謝穩(wěn)定性和血漿半衰期。
最近，Ｃｕｉ 等［５４］設(shè)計(jì)了可以激活 Ｗｎｔ 信號(hào)通路的能入膜的訂書(shū)肽。該多肽旨在打破 Ａｘｉｎ 與 β⁃連環(huán)蛋白之間的作用。他們化學(xué)合成了兩條訂書(shū)肽ＳＡＨＰＡ１ 與 ＳＡＨＰＡ２；通過(guò)圓二色譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與線性的多肽 Ａｘｉｎ 相比，兩條合成的訂書(shū)肽的 α 螺旋程度明 顯 提 高。體 外 ｐｕｌｌ⁃ｄｏｗｎ 實(shí) 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) 表 明ＳＡＨＰＡ１ 結(jié)合 β 連環(huán)蛋白的結(jié)合能力比 ＳＡＨＰＡ２ 更強(qiáng)。細(xì) 胞 入 膜 性 實(shí) 驗(yàn) 和 免 疫 共 沉 淀 實(shí) 驗(yàn) 表 明ＳＡＨＰＡ１ 通過(guò)與 β⁃連環(huán)蛋白的結(jié)合可以有效地打破內(nèi)源的 Ａｘｉｎ⁃β⁃連環(huán)蛋白復(fù)合物的生成。他們探索了對(duì)轉(zhuǎn)錄活性的影響，表明 ＳＡＨＰＡ１ 可以高度特異性地激活 Ｗｎｔ 信號(hào)。
５ 訂書(shū)肽的前景與展望
Ｖｅｒｄｉｎｅ 等首次發(fā)明出碳碳鏈支架的訂書(shū)肽至今，從合成方法和生物應(yīng)用兩方面，均得到了快速的發(fā)展。傳統(tǒng)小分子體積過(guò)小不能有效地調(diào)節(jié)蛋白蛋白相互作用。訂書(shū)肽不僅可以作為一個(gè)潛在的醫(yī)療靶向，而且可以作為一個(gè)新的工具用于識(shí)別新的反應(yīng)位點(diǎn)及新的配體等。訂書(shū)肽比小分子有更多的選擇性，其價(jià)格又遠(yuǎn)低于抗體等生物制劑，而且可以入膜。同樣具有穩(wěn)定空間折疊結(jié)構(gòu)還有小蛋白（尤其是環(huán)蛋白）［５６ ～ ６５］，這些分子的獨(dú)特性質(zhì)，使得它們成為未來(lái)藥物發(fā)展值得探索的一個(gè)方向。隨著多肽連接技術(shù)的發(fā)展，大型訂書(shū)肽的合成成為現(xiàn)實(shí)。這將為發(fā)展新一代蛋白類藥物提供強(qiáng)有力的工具。我們有理由相信在未來(lái)幾年訂書(shū)肽類的藥物以及小蛋白藥物會(huì)不斷地投入到臨床，并獲得長(zhǎng)足的發(fā)展。
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