摘要 構(gòu)建了一種近紅外二區(qū)成像探針, 能對(duì)腦部病變進(jìn)行近紅外二區(qū)熒光成像. 利用腦靶向肽 Angiopep-2 對(duì) Ag2S量子點(diǎn)進(jìn)行修飾, Ag2S 量子點(diǎn)和 Angiopep-2 多肽經(jīng) EDC 和 NHS 介導(dǎo), 通過(guò)氨基和羧基的縮合反應(yīng)進(jìn)行連接, 采用瓊脂糖電泳、動(dòng)態(tài)光散射及透射電鏡等方法對(duì)材料進(jìn)行表征, 并觀察了材料對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U87MG 的細(xì)胞毒性、材料在該細(xì)胞中的分布、攝取以及在實(shí)體瘤荷瘤鼠中的分布情況. 結(jié)果顯示, Ag2S 量子點(diǎn)水合粒徑約為 6 nm, 經(jīng)肽修飾后粒徑約為 8 nm, 表面 zeta 電位正電性增強(qiáng), 在瓊脂糖電泳中, 肽修飾后 Ag2S 遷移距離較 Ag2S 短, 表明 Angiopep-2 多肽修飾到了量子點(diǎn)上. 經(jīng)過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 修飾后的 Ag2S 量子點(diǎn)在 100 μg/mL 以下沒(méi)有細(xì)胞毒性, 腦膠質(zhì)瘤 U87MG細(xì)胞對(duì) Angiopep-2 多肽修飾的 Ag2S 較 Ag2S 具有更高的攝取. 經(jīng)過(guò)初步的實(shí)體瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), Angiopep-2 修飾的Ag2S 能在皮下瘤模型中出現(xiàn)分布和聚集, 說(shuō)明修飾后的 Ag2S 量子點(diǎn)具有一定腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的靶向性.
近年來(lái), 中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦腫瘤、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率和死亡率在不斷升高, 但是血腦屏障(blood brain barrier, BBB)系統(tǒng)的存在阻礙了診斷及治療藥物從血液向腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)[1,2], 幾乎 100%的大分子和 98%以上小分子不能通過(guò)血腦屏障系統(tǒng), 極大地限制了腦部疾病的診斷和治療[3～6]. 腦靶向分子的發(fā)現(xiàn)[7～9]和納米成像探針[10～15]的研究為腦部病變的診斷和藥物的腦靶向輸送帶來(lái)了新的契機(jī). Yan 等[16]利用 PAMAM 樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)特點(diǎn), 構(gòu)建了血腦屏障和腦腫瘤雙級(jí)靶向修飾的成像納米探針, 以光學(xué)和磁共振雙重模式對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行成像, 發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤的早期, 納米探針可以跨越血腦屏障在膠質(zhì)瘤內(nèi)聚集, 實(shí)現(xiàn)了早期膠質(zhì)瘤的雙模式成像. Bruun 等 [17] 將脂質(zhì)體表面用低密度脂蛋白配體(Angiopep-2)進(jìn)行修飾, 內(nèi)部包裹 siRNA, 跨越血腦屏障, 針對(duì)性地沉默膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的目的基因, 從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖. Kumar 等[18]將狂犬病毒糖蛋白(RVG)結(jié)合在 siRNA 上, RVG 成功將 siRNA 運(yùn)輸?shù)侥X部發(fā)揮作用. Li 等[19]將 Pep TGN 多肽連接到 PEG-PLGA 納米顆粒的表面, 利用 Pep TGN 多肽的腦靶向性, 攜帶納米顆粒穿過(guò)血腦屏障, 到達(dá)腦部. 納米材料為腦部成像探針的構(gòu)建和跨腦藥物輸送提供了有利的載體.
Ag2S QDs (quantum dots)是一種新型的近紅外二區(qū)(NIR, 1.0～1.4 μm)量子點(diǎn), 2010 年, 王等[20]首次報(bào)道了這種新型量子點(diǎn)的近紅外二區(qū)熒光特性, Ag2S 量子點(diǎn)發(fā)射熒光峰位于近紅外二區(qū), 作為新型的NIR-II 熒光納米探針具有高的量子效率, 高的熒光強(qiáng)度且不會(huì)淬滅, 表面經(jīng)過(guò)生物分子修飾后, 在細(xì)胞和動(dòng)物上均未見(jiàn)明顯的毒性[21,22], 因此在活體成像中的應(yīng)用研究倍受關(guān)注. 目前常用的熒光探針按照熒光發(fā)射的波長(zhǎng)可以分為可見(jiàn)光區(qū)(450～750 nm)、近紅外一區(qū)(NIR-I, 750～900 nm)、近紅外二區(qū)(NIR-II, 900～1400 nm)[22]. 可見(jiàn)光區(qū)的熒光探針會(huì)存在生物組織中的一些生物分子吸收或者散射, 導(dǎo)致成像的深度非常有限[23]. 近幾年在 NIR-I 成像染料和探針?lè)矫嬉踩〉昧丝上驳倪M(jìn)展, 如 Wang[24]、Ji[25]等利用聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)原理設(shè)計(jì)成像探針, 不僅使熒光強(qiáng)度增強(qiáng), 而且使其熒光發(fā)射峰落在近紅外波段, 可用于細(xì)胞的熒光成像和細(xì)胞內(nèi)炎癥過(guò)程動(dòng)態(tài)檢測(cè)等方面. 此外, 稀土摻雜的納米顆粒、新型的銅銦硫量子點(diǎn)以及粒徑小于 2 nm 的水溶性手性金納米團(tuán)簇都展示出了良好近紅外區(qū)的熒光性能[26～28]. 這些探針發(fā)射光譜多位于近紅外一區(qū), 在細(xì)胞成像方面取得了良好的成像效果, 而在動(dòng)物及組織成像方面, 會(huì)受組織穿透深度的限制. Ag2S QDs 具有優(yōu)良的 NIR-II 熒光特性, 與其他NIR-I 的熒光探針相比, NIR-II 熒光在整體動(dòng)物成像方面具備明顯的優(yōu)勢(shì): (1)具有更高穿透深度及高成像信噪比; (2)具有更高的分辨率和較低的自發(fā)熒光[22].
基于 Ag2S 量子點(diǎn)在活體成像中的優(yōu)勢(shì)[29,30], 在EDC/NHS 的介導(dǎo)下[31], 我們將 Ag2S 進(jìn)行腦部靶向分子 Angiopep-2 (ANG)多肽的修飾, Angiopep-2 多肽是由低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)配體抑肽酶 Kunitz 結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)演化而來(lái)的短肽(包含19個(gè)氨基酸殘基)[32], 在BBB 和膠質(zhì)細(xì)胞瘤中有大量 LRP1 表達(dá), Angiopep-2 能被 LRP1 特異性地識(shí)別、結(jié)合, 細(xì)胞膜內(nèi)陷形成內(nèi)化小泡, 穿透 BBB 進(jìn)入腦內(nèi), 對(duì)血腦屏障和膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U87MG)具有雙重靶向性. 相對(duì)于其它的腦靶性策略, 如轉(zhuǎn)鐵蛋白或其它小分子, 腦靶向肽類(lèi)具有容易合成、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合不明顯、免疫原性低及受體內(nèi)環(huán)境干擾小等優(yōu)點(diǎn), 其中 Angiopep-2 入腦效率要明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)鐵蛋白[33], 而且容易修飾, 因而被廣泛應(yīng)用于腦靶向材料的修飾中[34～45]. 因此, 本研究利用 Angiopep-2 多肽修飾 Ag2S量子點(diǎn)構(gòu)建具有腦靶向的近紅外二區(qū)分子成像探針, 并對(duì)其體內(nèi)外性質(zhì)進(jìn)行初步的探討.
2 結(jié)果與討論
2.1 Ag2S-ANG 量子點(diǎn)的表征
2.1.1 瓊脂糖凝膠電泳
從外觀看, 經(jīng)過(guò) ANG 多肽修飾后, 溶液的顏色和熒光性質(zhì)沒(méi)有明顯的變化, 電泳結(jié)果顯示, 修飾 ANG多肽的Ag2S量子點(diǎn)的條帶位置要比未修飾ANG多肽的Ag2S 量子點(diǎn)條帶距離上樣孔位置近(圖 1), 瓊脂糖電泳是根據(jù)分子量進(jìn)行分離的, 也就是說(shuō) Ag2S-ANG 量子點(diǎn)的分子量增加.
2.1.2 水合粒徑(DLS)和 zeta 電位
經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)發(fā)現(xiàn) Ag2S 量子點(diǎn)的水合粒徑約為 6 nm, Ag2S-ANG 的水合粒徑約為 8 nm, 修飾了 ANG多肽的 Ag2S 量子點(diǎn)的粒徑增大(圖 2a, 2b), 經(jīng)進(jìn)一步檢測(cè)材料的 zeta 電位發(fā)現(xiàn), Ag2S 量子點(diǎn)表面呈負(fù)電性,zeta電位是－11.47±1.56 mV, 而修飾了 ANG 多肽的 Ag2S量子點(diǎn)的電位是＋28.7±1.35 mV(圖 2c), 帶正電. ANG多肽的等電點(diǎn)是 10, 所以在該溶液中帶正電, 而修飾了ANG 多肽的 Ag2S 量子點(diǎn)帶正電.
2.1.3 透射電子顯微鏡(TEM)
利用 TEM 對(duì) Ag2S 和 Ag2S-ANG 量子點(diǎn)的粒徑進(jìn)行表征(圖 3), 隨機(jī)選取 50 個(gè)量子點(diǎn), 用 Gatan Digital Micrograph 軟件分別統(tǒng)計(jì) Ag2S 和 Ag2S-ANG 量子點(diǎn)的大小, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), Ag2S 量子點(diǎn)的粒徑約 5 nm, Ag2S-ANG量子點(diǎn)的粒徑約為 7 nm, 經(jīng)過(guò)修飾后粒徑增大. 結(jié)合電泳和 DLS 及 zeta 電位結(jié)果, 表明 ANG 短肽成功修飾在Ag2S 量子點(diǎn)上.
2.1.4 吸收及熒光發(fā)射光譜
為了考察肽修飾前后 Ag2S 量子點(diǎn)的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜是否有變化, 我們分別檢測(cè)了修飾前后的吸收和發(fā)射光譜, 從吸收譜看(圖 4a), Ag2S 量子點(diǎn)修飾前后沒(méi)有明顯變化. 從發(fā)射光譜看(圖 4b), 修飾多肽后熒光強(qiáng)度有明顯的增強(qiáng), 原因可能是修飾多肽后, 多肽分子較大, 包裹在量子點(diǎn)表面, 減少了量子點(diǎn)的表面缺陷, 使得熒光增強(qiáng).
2.2 細(xì)胞毒性
采用噻唑藍(lán)(MTT)法評(píng)價(jià) Ag2S 及 Ag2S-ANG 的細(xì)胞毒性. 其檢測(cè)的原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中, 而死細(xì)胞沒(méi)有此功能. 還原生成的 Formazan 結(jié)晶可被酸化的十二烷基磺酸鈉(SDS) (pH 3.0～4.0)溶解, 利用酶標(biāo)儀測(cè)定 570 nm 處的光密度 OD 值, 以反映出活細(xì)胞數(shù)目. 根據(jù) MTT 的結(jié)果顯示, Ag2S 和 Ag2S-ANG 量子點(diǎn)與 U87MG 細(xì)胞共孵育24 h 后, 在低于 100 μg/mL 時(shí), 細(xì)胞存活率接近 100%, 修飾前后對(duì)該細(xì)胞均未顯示明顯的毒性(圖 5).
2.3 ANG 多肽促進(jìn) U87MG 細(xì)胞對(duì) Ag2S 量子點(diǎn)的攝取
ANG 多肽是低密度脂蛋白受體的配體, 能夠靶向U87MG 細(xì)胞, 將 ANG 多肽修飾到 Ag2S 量子點(diǎn)的表面, 利用 ANG 多肽與 U87MG 細(xì)胞上的受體結(jié)合, 攜帶Ag2S 量子點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞, 通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行近紅外二區(qū)熒光成像可以看出, 經(jīng) ANG 修飾后的量子點(diǎn)在細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度較未修飾的量子點(diǎn)明顯增強(qiáng)(圖 6a), 進(jìn)一步用ICP-MS 分析細(xì)胞對(duì)修飾和未修飾 ANG 的 Ag2S 量子點(diǎn)的攝取情況發(fā)現(xiàn), Ag的含量比未修飾的量子點(diǎn)高出將近1 倍(圖 6b), 表明 ANG 的修飾增加了 U87MG 細(xì)胞對(duì)Ag2S 量子點(diǎn)的攝取.
2.4 Ag2S-ANG 量子點(diǎn)在荷瘤鼠中的分布及近紅外二區(qū)熒光成像
荷瘤鼠的皮下瘤長(zhǎng)到約 4～5 mm2 時(shí), 進(jìn)行近紅外二區(qū)成像(圖 7a). U87MG 細(xì)胞具有熒光素酶(luciferase)報(bào)告基因, 在近紅外二區(qū)成像前, 先注射 luciferase 的底物, 用生物發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)其腫瘤的大小及邊界, 然后經(jīng)尾靜脈注射 Ag2S 或 Ag2S-ANG 兩種量子點(diǎn), 在近紅外二區(qū)成像系統(tǒng)進(jìn)行腫瘤成像(圖 7b, 7c). 經(jīng)生物發(fā)光檢測(cè)皮下瘤已經(jīng)形成且在后肢大腿外側(cè), 近紅外二區(qū)成像中未檢測(cè)到 Ag2S 量子點(diǎn)在腫瘤部位的聚集, 而Ag2S-ANG 量子點(diǎn)在注射后 12 h, 在腫瘤部位檢測(cè)到比較明顯的聚集, 但同時(shí), 兩種量子點(diǎn)在肝、胃、脾、腎、肺、骨骼等部位具有較高的分布(圖 8).
進(jìn)行完近紅外二區(qū)熒光成像, 將小鼠的肝、心、脾肺腎等解剖 , 對(duì)臟器進(jìn)行稱(chēng)重 , 然后用消解液(HNO3/H2O2, V∶V＝7∶1)在 100 ℃下進(jìn)行消解 30 min, 消解完成后再將消解液稀釋到 2%, 用 ICP-MS 進(jìn)行 Ag元素的含量分析, Ag2S 和 Ag2S-ANG 兩種量子點(diǎn)主要分布在肝、脾等組織, 而修飾 ANG 的 Ag2S-ANG 量子點(diǎn)在腫瘤部位也有所聚集, 此外在骨骼和肝臟部位分布增加了近一倍, 在肺、脾、腎等部位分布量較 Ag2S 減少, 在腫瘤部位的分布增加, 表明 ANG 的修飾增加了 Ag2S對(duì)腦膠質(zhì)瘤的靶向, 減少了 Ag2S 在肺、脾、腎等臟器的分布, 為腦腫瘤的近紅外二區(qū)成像探針的設(shè)計(jì)提供了初步的思路, 如何使腫瘤部位有更高的攝取和滯留的同時(shí), 減少其在主要臟器(肝、脾等)的分布, 還需要后續(xù)通過(guò)摸索最佳的靶分子數(shù)量和最佳的成像時(shí)間等進(jìn)一步探討.
3 結(jié)論
設(shè)計(jì)合成了一種基于 Ag2S 量子點(diǎn)的近紅外二區(qū)的熒光成像探針 Ag2S-ANG, 該探針細(xì)胞毒性低, 在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中具有較高的攝取, 初步的荷瘤鼠實(shí)驗(yàn)也顯示其對(duì)膠質(zhì)瘤具有一定的靶向性, 在腦部病變的近紅外二區(qū)成像方面具有潛在的應(yīng)用前景.
4 實(shí)驗(yàn)方法
4.1 Ag2S QDs 的合成及表面修飾 ANG 多肽
4.1.1 表面修飾有羧基 (COOH) 的硫化銀量子點(diǎn)Ag2S-COOH 的合成
將 0.1 mmol 的二乙基二硫代氨基甲酸銀、10 g 十二硫醇混合置于燒瓶中, 在 N2 氣氛中升溫至 200 ℃保持1 h, 最后待溶液自然冷卻至室溫后, 加入50 mL無(wú)水乙醇, 經(jīng)離心、洗滌, 分散在環(huán)己烷中; 進(jìn)一步將 0.15 g硫辛酸加入上述環(huán)己烷中, 再加入同等體積的無(wú)水乙醇, 攪拌 48 h, 然后離心, 洗滌, 用去離子水分散得到羧基修飾的水溶性 Ag2S 量子點(diǎn).
4.1.2 Ag2S-COOH 量子點(diǎn)表面腦靶向肽 Angiopep-2 (ANG)修飾
在交聯(lián)劑 EDC/NHS 介導(dǎo)下, Ag2S 量子點(diǎn)的-COOH和 ANG 多肽的-NH2通過(guò)縮合反應(yīng)進(jìn)行連接, 再加入少量 NH3•H2O 保持溶液 pH 的穩(wěn)定, 利用 EDC 和 NHS 交聯(lián)反應(yīng)要優(yōu)于醛類(lèi)交聯(lián)劑, EDC 只是幫助分子的羧基和氨基之間形成酰胺鍵, 而本身并沒(méi)有成為實(shí)際交聯(lián)的一部分, EDC 首先是和羧基形成一個(gè) O-異�；褰Y(jié)構(gòu), 這一活化中間物并不穩(wěn)定, 而 NHS 通過(guò)形成更穩(wěn)定的酯而增強(qiáng)該活化中間物的穩(wěn)定性可以消除并被清洗掉[16]. 整個(gè)過(guò)程分為三步:
(1)稱(chēng)量 EDC (5.34 mg)、NHS (18.45 mg)、ANG (0.49 mg), 根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量將 EDC 和 NHS 配制成 2 mmol/L 的溶液, 將 ANG 配制成 200 μmol/L 的溶液.
(2)取 15 μL Ag2S-COOH (10 μmol/L)量子點(diǎn), 加入等體積的 ANG, 再加入等體積的 EDC/NHS, 此時(shí)溶液變渾濁, 再慢慢加入稀釋過(guò)的氨水, 待溶液變澄清后, 再將混合液在控溫振蕩器(300 r/min)震蕩 30 min.
(3)然后再加入三倍體積的 EDC/NHS 在控溫振蕩器(300 r/min)震蕩 8 h.
(4) 8 h 后, 將溶液轉(zhuǎn)移至超濾管, 在 3000 g 條件下離心 15 min, 然后倒置超濾管在 1000 g 條件下離心 10 min, 收集溶液.
4.2 Ag2S-ANG QDs 的表征
4.2.1 瓊脂糖凝膠電泳
取 0.3 g 瓊脂糖粉末置于燒杯中, 加入 15 mL TBE, 15 mL 去離子水, 混勻, 在微波爐中加熱使瓊脂糖全部溶解, 配成質(zhì)量濃度為 1%的瓊脂糖凝膠液, 然后倒入電泳槽中, 成膠后進(jìn)行電泳. 將Ag2S和Ag2S-ANG稀釋到同一濃度(1 mg/mL), 分別在不同的上樣孔中上樣 10 μL, 100 V 電泳 20 min, 取出膠置于近紅外二區(qū)成像儀中進(jìn)行成像, 同時(shí)拍攝白光照片.
4.2.2 Zeta 電位及水合粒徑表征
將 Ag2S 和 Ag2S-ANG 稀釋到同一濃度(20 μg/mL), 然后將稀釋后的溶液放入比色皿中, 分別置于納米粒度及電位分析儀中進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射和 ξ 電位分析, 每個(gè)樣品設(shè)三管重復(fù)樣, 進(jìn)行檢測(cè).
4.2.3 透射電子顯微鏡(TEM)表征
TEM 表征要事先制樣, 將 Ag2S 和 Ag2S-ANG 稀釋到相同的濃度, 每個(gè)樣品取10 μL, 滴在兩個(gè)銅網(wǎng)上, 讓其自然風(fēng)干, 然后置于 TEM 下進(jìn)行粒徑分析.
4.2.4 吸收光譜和熒光光譜檢測(cè)
將 Ag2S 和 Ag2S-ANG 量子點(diǎn)稀釋至相同的濃度, 置于紫外-可見(jiàn)光譜儀上進(jìn)行吸收光譜測(cè)定, 然后置于近紅外熒光光譜儀上進(jìn)行熒光發(fā)射光譜測(cè)定.
4.3 細(xì)胞毒性
細(xì)胞毒性采用的是 MTT 方法, 具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:
(1)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 U87MG 細(xì)胞用胰酶消化, 制成單細(xì)胞懸液, 以每孔 100 μL (1×104個(gè)細(xì)胞)的體積將單個(gè)細(xì)胞懸液接種于 96 孔板中, 置于 37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h.
(2)培養(yǎng) 24 h 后, 棄去 96 孔板中舊的培養(yǎng)基, 加入不同濃度的 ANG 多肽修飾的 Ag2S 量子點(diǎn)(終濃度分別為 100, 10, 1, 0.1 μg/mL), 與細(xì)胞共培養(yǎng) 24 h.
(3)共培養(yǎng)至 20 h, 向 96 孔板中加入 10 μL MTT 溶液(5 mg/mL), 其終濃度是 0.5 mg/mL, 繼續(xù)培養(yǎng)至 24 h.
(4)共培養(yǎng)至24 h, 每孔加入110 μL酸化的SDS (pH 3.0～4.0), 孵育過(guò)夜, 充分溶解.
(5)過(guò)夜后, 吸出 96 孔板中的溶液至 1.5 mL 離心管中, 14000 r/min 離心 15 min, 離心后, 取 200 μL 上清于新的 96 孔板中, 酶標(biāo)儀 570 nm 檢測(cè)各孔吸收值, 計(jì)算細(xì)胞存活率.
4.4 細(xì)胞攝取
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 U87MG 細(xì)胞, 胰酶消化后, 鋪到confocal 皿中, 每孔 5×104 個(gè)細(xì)胞, 設(shè)定 Ag2S 和Ag2S-ANG兩組, 每組3個(gè)平行樣, 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜后, 分別加入終濃度為 20 μg/mL 的 Ag2S 量子點(diǎn)和 Ag2S-ANG量子點(diǎn), 繼續(xù)培養(yǎng) 24 h.
(1)吸去舊培養(yǎng)基, PBS洗三次, 用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛溶液(PFA)固定細(xì)胞 30 min; 固定完成后 PBS洗3次; Hoechst染料染核10 min, 染核完畢PBS洗三次, 即可在顯微鏡下拍照.
(2)吸去舊培養(yǎng)基, 收集各個(gè)皿中的細(xì)胞, 再用 70%的濃硝酸消解, 然后稀釋硝酸到 2%, 利用 ICP-MS 進(jìn)行樣品中 Ag 含量測(cè)量.
4.5 荷瘤鼠近紅外二區(qū)成像
首先制備皮下瘤荷瘤鼠模型, 將對(duì)數(shù)期的腦膠質(zhì)瘤U87MG 細(xì)胞進(jìn)行消化, 離心收集細(xì)胞, 用 PBS 將細(xì)胞制成 2.5×107 個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液, 為了方便成像, 減少了裸鼠本身的一些組織的干擾, 腫瘤細(xì)胞接種于裸鼠左后肢外側(cè), 每只裸鼠注射的量為 200 μL 的細(xì)胞懸液, 細(xì)胞數(shù)量為 5×106. 接種腫瘤后 1～2 周即可生成肉眼可見(jiàn)的皮下瘤. 皮下瘤不宜過(guò)小, 否則成像強(qiáng)度不夠; 也不宜過(guò)大, 過(guò)大腫瘤組織可能會(huì)壞死, 影響成像, 待腫瘤長(zhǎng)到約 4～5 mm2 左右時(shí)進(jìn)行成像. 經(jīng)尾靜脈給荷瘤鼠注射濃度為 1 mg/mL 的 Ag2S 或 Ag2S-ANG 量子點(diǎn), 每只鼠注射 100 μL, 分別在注射后 5, 10, 15, 30 min, 1, 3, 6, 12, 24 h 在近紅外二區(qū)成像儀中進(jìn)行成像.
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