摘要 環(huán)二肽由兩個氨基酸通過肽鍵環(huán)合形成, 在氫鍵相互作用驅動下具有較強的自組裝傾向. 本工作研究了 c-SF, c-SY, c-SH 及 c-DF 等四種環(huán)二肽的自組裝行為和組裝體的熒光特性. 實驗結果表明, c-SH 為無規(guī)卷曲而其他三種環(huán)二肽均采取 β-sheet 二級結構, 且除 c-SH 未形成明顯組裝體外, 其他三種環(huán)二肽均形成不同尺寸的納米纖維. 熒光光譜檢測發(fā)現(xiàn)環(huán)二肽在不同波長的激發(fā)下存在多個不同的熒光發(fā)射峰; 對于 c-SH, 側鏈咪唑基官能團與 Zn(II)配位可以增大熒光發(fā)射的強度; 對于 c-SY, 側鏈酚羥基的氧化也可以增強熒光強度. 推測在氫鍵作用的驅動下環(huán)二肽分子可以逐個堆疊形成納米纖維, 自組裝導致的分子聚集和分子的側鏈結構均可使環(huán)二肽具有可調變的熒光性能.
在生命體系中, 多肽、蛋白質、RNA、DNA、磷脂等分子是各種生物功能的物質基礎, 這些分子可以聚集組裝形成高級有序結構, 由此產生新的性質和功能[1～3]. 多肽分子可以在氫鍵作用、疏水作用以及靜電相互作用等多種非共價作用力的驅動下自組裝成各種納米結構,并由此產生種種新性質以及在生物醫(yī)學、材料學、光學等領域的新功能[4～11].
環(huán)肽是指氨基酸殘基的 N 端和 C 端以酰胺鍵依次連接成環(huán)狀的多肽分子. 環(huán)肽的結構同大環(huán)超分子, 如冠醚、環(huán)糊精、杯芳烴等有所相似, 容易形成氫鍵網絡, 此外環(huán)肽還存在內在構象約束, 已經在超分子化學及分子識別方面引起了人們的注意[12]. 環(huán)二肽(CDPs), 又名2,5-二氧哌嗪或 2,5-二酮哌嗪, 由兩個氨基酸通過肽鍵環(huán)合形成, 是最小的環(huán)肽. 天然的 CDPs 一般由 α-氨基酸(常為 L-氨基酸)形成穩(wěn)定的六元環(huán), 存在于動植物中, 微生物發(fā)酵和食品加工過程也有 CDPs 形成[13]. CDPs 的兩個酰胺鍵存在四個氫鍵位點(兩個供體和兩個受體), 獨特的氫鍵作用模式使 CDPs 具有高度的自組裝傾向, 分子聚集體具有優(yōu)異的結構剛性、酶穩(wěn)定性和生物活性[14,15]. 除 2,5-二酮哌嗪環(huán)之間的氫鍵作用外, CDPs 側鏈官能團之間的其他非共價鍵相互作用, 如芳香環(huán)的π-π 相互作用、范德華力、靜電作用和離子配位作用也會影響其組裝聚集行為[16], 這主要取決于氨基酸的類型和 α-碳原子上的立體化學構型. CDPs 分子可通過形成一維的分子鏈或二維的分子層來促進自組裝和復雜超分子結構的構建[17～21].
相對于線性短肽, CDPs 能夠抵抗在生理條件下的快速酶促降解, 其在生物醫(yī)學領域的應用具有一定優(yōu)勢[13,22]. CDPs 是次生代謝產物, 存在于從細菌到人類等各種生物體中, 并且在進化過程中得到保護[22]. CDPs及其衍生物是一類具有生物功能的重要活性分子, 如細菌群體感應功能[23]、抗菌[24]和抗癌性能[25,26]等. CDPs 的生物學性能與氨基酸側鏈官能團密切相關, 可通過改變氨基酸殘基種類來改變和調節(jié). 除生物學功能外, CDPs 的聚集和自組裝產生的量子限制效應和光致發(fā)光特性, 賦予了其材料學功能. Tao 等研究了含 F 的環(huán)二肽的光吸收和能量傳遞功能, 提出組裝體可用于構建半導體材料[27]. 基于 W 的芳香環(huán)二肽可自組裝成二聚體量子點(QD), 通過調節(jié)激發(fā)光波長可使其發(fā)光波長覆蓋大部分可見光到近紅外波長區(qū)域[28]. 這為體內生物成像材料提供了新的選擇.
目前 CDPs 自組裝研究的工作大都采用有機溶劑體系[29～31], 為使其有更廣泛的應用, 我們在水溶液中研究了 CDPs 的自組裝行為, 并考察了溶液條件、金屬離子配位等因素的影響. 多肽材料熒光發(fā)光一般來自于所含氨基酸側鏈的芳香環(huán)[32]、分子聚集發(fā)光[33]或形成 QD[28], 我們也基于此考察了 CDPs 的熒光性能. 所研究的四種含有不同氨基酸殘基的 CDPs 可組裝成納米纖維或厚度均勻的分子層, 在不同的激發(fā)波長下分別具有不同的熒光發(fā)光特性, 其熒光性能來自于二酮哌嗪結構.
2 結果與討論
為考察不同類型氨基酸對 CDPs 自組裝行為的影響, 我們設計 c-SF、c-SY、c-DF 及 c-SH 等四種 CDPs, 如圖 1 所示. 通過絲氨酸側鏈羥基極性的加入來增加CDPs在水中的溶解度, 而CDPs中的另一個氨基酸殘基分別為非極性的苯丙氨酸(F)、極性氨基酸酪氨酸(Y)、正電性組氨酸(H)以及負電性天冬氨酸(D), 藉此考察氨基酸殘基的帶電性和親疏水性對 CDP 自組裝行為的影響. 通過熒光光譜儀考察了 CDPs 及其組裝體的熒光性能.
2.1 CDPs 的自組裝及其熒光性能
由于 CDPs 中含有兩個酰胺鍵即四個氫鍵位點, 其在水溶液中易于氫鍵作用力的驅動下發(fā)生有序聚集. 我們通過圓二色光譜(CD)考察了環(huán)二肽自組裝體的二級結構, 如圖 2 (a)所示. CD 結果表明, 在 pH 7.0, 濃度為2.0 mmol/L 的不帶有電荷的 c-SF 和 c-SY 均在 195 nm處有正峰, 在212 nm左右處存在負峰, 為典型的β-sheet的二級結構. 這是由于 CDPs 的二酮哌嗪環(huán)所包含的四個氫鍵位點之間產生了較強的氫鍵相互作用, 從而使得二酮哌嗪環(huán)逐個相互平行堆疊形成 β-sheet 二級結構. FTIR 譜圖在 1640 cm－1處的酰胺 I 帶吸收峰也證實了其β-sheet 二級結構[圖 S1 (a)和 S1 (b)]. 在酸性條件下, c-SH 的組氨酸側鏈官能團發(fā)生質子化, 帶有較強的正電荷, 由此帶來的靜電排斥作用使得 c-SH 的二酮哌嗪環(huán)無法平行地堆疊形成 β-sheet二級結構[圖 2 (a)和圖 S1 (d)]. 我們嘗試通過改變溶液的 pH 將 c-SH 中的咪唑環(huán)去質子化以消除靜電斥力影響, 雖然在 pH 為 7.0 和 9.0時, CD 結果負峰發(fā)生了明顯的紅移, 但仍然沒有形成β-sheet 結構, 如圖 2 (b)所示. 我們初步推斷去質子化的咪唑環(huán)也可能與二酮哌嗪環(huán)產生氫鍵相互作用從而阻礙了 β-sheet 二級結構的形成.
通過 AFM 表征了 CDPs 的組裝體形貌并跟蹤了c-SF 和 c-SY 在不同時間段形貌的變化. 實驗結果表明, c-SH 在水溶液中所有 pH 下都不能形成有序組裝體, c-SF 和 c-SY 自組裝形成了細小的短棒狀納米纖維, 長度約為 100 nm, 直徑約為 0.5～1.0 nm[圖 3 (a)和圖 3 (d)]. 結合 CD 結果, 可以初步推斷 CDPs 納米纖維是由二酮哌嗪環(huán)有序地堆疊形成的. 由圖 3 (b)可知, 7 d 后, c-SF 自組裝形成的納米纖維數(shù)量略有增加, 但長度仍為100 nm, 并且直徑也較為均勻地分布在 1.0 nm 左右, 與一個 c-SF 環(huán)二肽分子的直徑相符, 也說明 c-SF 的自組裝體為單分子堆積. 進一步延長組裝時間到 15 d, c-SF組裝體的形狀無明顯變化[圖 3 (c)]. 對于 c-SY, 7 d 后的組裝體納米纖維尺度有所增大, 長度約為 300～500 nm, 直徑為 2.0～3.0 nm[圖 3 (e)]. 靜置 15 d 后, 納米纖維長度和直徑進一步增加, 長度為 800～1000 nm, 直徑為3.5～5.0 nm; 并且納米纖維之間發(fā)生一定程度的聚并和纏繞, 形成了三維網狀結構[圖 3 (f)]. 我們推測 c-SY 的初級自組裝體可在側鏈芳香環(huán)基團 π-π 堆積作用和酚羥基氫鍵相互作用的驅動下進一步分級自組裝, 形成高級有序結構. 同時為證實二酮哌嗪環(huán)在自組裝過程中的作用, 與對應的線性二肽 NH2-FS-COOH(FS)和 NH2-YSCOOH(YS)進行了對比, AFM 實驗表明兩種線性二肽均未發(fā)生自組裝現(xiàn)象. 也進一步證實了 CDPs 中的二酮哌嗪環(huán)所提供的氫鍵相互作用是 CDPs 分子自組裝的主要驅動力.
由于 CDPs 中二酮哌嗪環(huán)是穩(wěn)定的六元環(huán), 分子具有一定剛性, 并且 CDPs 中帶有芳香環(huán)結構, 因此 CDPs應該具有熒光性能. 熒光光譜也表明, c-SF 在 350 nm 激發(fā)波長下在 437 nm 處有熒光發(fā)射峰, 在 520 nm 激發(fā)波長下在 560 nm 處有熒光發(fā)射峰; c-SY 在 283 nm 激發(fā)波長下發(fā)射光譜特征峰位于 305 nm 處, 在 350 nm 和 565 nm 激發(fā)波長下, 發(fā)射光譜特征峰分別位于 439 nm 和600 nm 處. 我們同樣考察了對應線性二肽 FS 和 YS 以及游離苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)的熒光性能. 如圖 4 (a),4 (b)和 4 (c)所示, 游離苯丙氨酸在 260 nm 激發(fā)光下在285 nm 處有熒光發(fā)射峰, 但 c-SF 和 FS 在此波長激發(fā)下不存在熒光發(fā)射峰. 在 350 nm 激發(fā)光下, c-SF, FS 和 F在437 nm附近發(fā)射峰強度的大小順序為: c-SF＞＞FS＞F. 使用 520 nm 激發(fā)時, 三種分子在 560 nm 處的熒光發(fā)射峰強度近似, 但都較弱. 同樣對于均含有 Y 的 c-SY, YS 和 Y 三種分子, c-SY 在紫外區(qū)熒光發(fā)射強度和紅色熒光發(fā)射強度弱于線性二肽或游離氨基酸, 但所發(fā)射藍色熒光的強度明顯大于另外兩者[圖 4 (d), 4 (e), 4 (f)]. CDPs 在藍色區(qū)域的熒光發(fā)射強度較大與二酮哌嗪環(huán)中酰胺鍵影響側鏈芳環(huán)結構的電子云排布, 使得其電子躍遷能級落在藍色區(qū)域有關. 我們將 c-SF 和 c-SY 的濃度縮小 30 倍至 0.1 mmol/L(此時 CDPs 為未組裝的游離狀態(tài)), 在熒光光譜中發(fā)現(xiàn)同一 CDP 在 3 mmol/L 的組裝體的熒光強度遠大于 0.1 mmol/L 時游離分子熒光強度的30 倍(圖 S2). 這一結果證實了組裝體的形成可以增強CDPs 的熒光性能. 此外, 實驗考察了組裝體的濃度對其熒光強度的影響, 發(fā)現(xiàn)隨組裝體濃度的增加, 其發(fā)藍色熒光的強度逐漸增強(圖 S2).
為進一步驗證 CDP 中二酮哌嗪環(huán)對熒光性能的作用, 我們對比了 c-DF, c-SF, FS, FD 和氨基酸 F 的熒光性能與其自組裝行為. 如圖4 (b)和圖5 (b)所示, 在350 nm波長激發(fā)下c-DF的熒光發(fā)射強度較c-SF小一個數(shù)量級, 這可能與 c-DF 所帶負電荷導致部分熒光猝滅有關. 然而, c-SF 和 c-DF 在 350 nm 激發(fā)下的熒光發(fā)射峰強度都遠大于線性二肽 FS 和 FD 以及氨基酸 F. 在 365 nm UV燈照射下, 同等濃度(3.0 mmol/L)的 c-SF, c-DF, FS, F 溶液中, 只有 c-SF 可以發(fā)出肉眼可見的藍綠色熒光[圖 5 (a)]. 這說明CDPs分子中二酮哌嗪環(huán)狀結構可以使芳香環(huán)帶來的熒光發(fā)射強度大幅度提高. 與 c-SF 類似, CD和 FTIR 結果顯示 c-DF 同樣在水溶液中采取 β-sheet 二級結構, 自組裝形成直徑 1.0～2.0 nm、長度約為 1 μm的納米纖維結構[圖 2 (a), S1 (c), S3 (b)]. 雖然天冬氨酸殘基側鏈的 β-COOH 的帶電性受 pH 影響, 但在所考察的 pH 范圍內 c-DF 的 β-sheet 二級結構并未受到 pH 值的影響[圖 S3 (a)], 說明了二酮哌嗪環(huán)結構氫鍵作用力的穩(wěn)定性. 與之相比, 線性二肽 FS 和 FD 則不能形成有序組裝體.
2.2 Zn(II)對 CDPs 自組裝及其熒光性能的影響
金屬離子對多肽自組裝行為有著顯著的影響, 可以改變多肽二級結構并進一步影響其組裝形貌及功能, 且特定金屬離子的存在可以使熒光材料的熒光性能顯著增強[28,34～37]. 考慮到組氨酸側鏈咪唑官能團與金屬離子有很強的配位作用, 我們研究了 Zn(II)離子對 c-SH 自組裝行為及熒光性能的影響.
實驗發(fā)現(xiàn), pH 3.0 時, 等物質的量 Zn(II)的加入對c-SH 二級結構、組裝形貌及熒光性能沒有明顯影響. c-SH 側鏈咪唑基帶電狀態(tài)受 pH 影響, 在去質子化狀態(tài)下易于和Zn(II)發(fā)生配位. UV-Vis結果表明, 當pH由3.0升高到7.0和9.0時, 在305 nm處出現(xiàn)了新的吸收峰, 說明發(fā)生了配位作用(圖 S4). 如圖 6 (a)和圖 6 (b)所示, pH 9.0 時, Zn(II)和 c-SH 配位形成單分子膜狀結構, 高度約為 0.7 nm; 而不加 Zn(II)時, c-SH 無序聚集為納米球狀形貌. 采用橢圓偏振光譜測定了薄膜厚度隨時間的變化, 發(fā)現(xiàn) 30 min 內分子層的厚度穩(wěn)定在 0.7 nm 左右[圖 S5 (a)], 這也證明了 c-SH 與 Zn(II)的配合物可以形成穩(wěn)定的厚度均勻的單分子層膜狀結構.
如前所述, 隨pH升高, c-SH的CD負峰發(fā)生了紅移. 我們也同樣考察了 pH 對 c-SH 熒光發(fā)射強度的影響. 如圖6 (c)所示, 3.0 mmol/L的c-SH在330 nm激發(fā)下在405 nm 處有熒光發(fā)射峰, 且強度隨 pH 的增大而增強, 這說明熒光發(fā)射強度與咪唑基去質子化的程度有關. 在 pH為 9.0 時, c-SH 和 Zn(II)配位后的熒光發(fā)射強度遠大于c-SH 的熒光發(fā)射強度[圖 6 (d)], 證明金屬離子 Zn(II)與c-SH 的配位可以顯著提高組裝體的熒光發(fā)射強度. 且固定 c-SH 的濃度為 4.0 mmol/L, 改變與其配位的 Zn(II)的濃度從 0 mmol/L 到 32.0 mmol/L 發(fā)現(xiàn), 隨 Zn(II)濃度的升高配合物的熒光發(fā)射強度逐漸增強. 在 Zn(II)為 8.0 mmol/L 時有最大熒光發(fā)射強度, 當 Zn(II)濃度再次升高時熒光強度開始降低, 這可能與 c-SH 和 Zn(II)的配位方式有關[圖 S5 (b)].
2.3 氧化劑對 CDPs 組裝體的影響
由于酪氨酸的側鏈酚羥基容易被氧化, 例如在 UV燈照射下, 酪氨酸在富氧和無氧條件下分別被氧化成黑色素和雙酪氨酸[38]. 我們也考察了酪氨酸氧化對 c-SY組裝和熒光性能的影響. 將 3.0 mmol/L 的 c-SY 溶液 pH調至 9.0, 并向溶液里加入 1.3 倍過量的 H2O2. UV-Vis 結果表明在 290 nm 處出現(xiàn)了新的吸收峰[圖 S6 (b)], 說明c-SY 確被氧化. 靜置 7 天后進行 AFM 表征, 被氧化后的 c-SY 自組裝體的形貌沒有發(fā)生明顯變化, 依舊為直徑約 1.0～2.0 nm、長度 250 nm 左右的納米纖維[圖 7 (a)]; 靜置 15 天后, 組裝體的形貌及尺寸也未發(fā)生明顯變化[圖 S6 (a)]. 熒光光譜表明在 350 nm 的激發(fā)光下被氧化后的 c-SY 在 439 nm 的熒光發(fā)射強度得到明顯提高[圖 7 (b)]. 我們也分別考察了溫度和 pH 對 c-SY 氧化后熒光性能的影響, 結果發(fā)現(xiàn)溫度對 c-SY 氧化后熒光發(fā)射強度無影響[圖 S6 (d)], 但其氧化后的熒光發(fā)射強度會隨 pH 的升高而增強, 這可能是由于 H2O2在堿性條件下對酚羥基氧化能力更強, c-SY 被氧化的程度增加[圖S6 (c)]. 以上結果說明酪氨酸的氧化可以在一定程度上增強 c-SY 的熒光發(fā)射性能.
3 結論
CDPs 的二酮哌嗪環(huán)結構所提供的四個氫鍵位點是其自組裝的重要驅動力. 在自組裝過程中, CDPs 采取β-sheet 的二級結構, 二酮哌嗪環(huán)中兩個酰胺鍵形成分子間氫鍵, 分子逐個堆疊形成納米纖維, 纖維直徑為單個CDP 分子尺寸. 在其他非共價相互作用, 如酚羥基之間的氫鍵作用下, CDPs 初級組裝體可以發(fā)生有序的二次聚集, 形成尺寸較大的組裝體. 熒光發(fā)射光譜表明CDPs 的二酮哌嗪環(huán)結構和自組裝聚集行為均可以使其熒光發(fā)射能力增強. c-SH 中咪唑基和 Zn(II)發(fā)生配位作用后, 會促進二維單分子層納米片結構的形成, 并且配位作用還可以明顯提高熒光性能. 酪氨酸的氧化也可提升 c-SY 的熒光發(fā)光性能. 因 CDPs分子量小且不易被酶降解, 其自組裝體納米結構為生物細胞成像材料的研發(fā)提供了新的可能.
4 實驗部分
4.1 溶液的配制
使用超純水(≥18.2 MΩ•cm)配制所需濃度的環(huán)肽溶液, 渦旋震蕩后室溫下超聲 30 min 使其充分溶解, 用0.1 mol/L 的 NaOH 和 0.1 mol/L 的 HCl 將溶液調至設定的 pH 值, 在室溫下保存.
4.2 圓二色光譜(CD)實驗
配制濃度為 2.0 mmol/L 的多肽溶液, 并將其 pH 調至特定值, 使用 Bio-Logic MOS-450 圓二色光譜儀進行測試. 數(shù)據采集的波長范圍為 190 nm 至 260 nm, 采集步長為1.0 nm, 使用光程為0.1 mm的石英比色皿, 溫度為室溫, 每個樣品均采集至少 5 次, 數(shù)據扣除背景后取平均并平滑, 得到的橢圓率(θ)數(shù)據通過公式(1)轉換為摩爾殘基橢圓率([θ]):
其中, [θ]—摩爾殘基橢圓率, 單位為 deg•cm2•dmol－1; θ—橢圓率, 單位為毫度(milidegree); n—多肽殘基數(shù); c—多肽溶液濃度, 單位為 mol/L; l—光程, 單位為 cm.
4.3 紫外-可見光譜(UV-Vis)實驗
配制所需 pH 值且濃度稀釋至 1.0 mmol/L 的多肽溶液, 使用紫外-可見光譜儀(Shimadzu UV-2450)測試其紫外-可見光譜. 石英比色皿光程為 1.0 cm, 實驗溫度為室溫, 測定波長范圍為 190～800 nm.
4.4 原子力顯微鏡(AFM)實驗
取15.0 μL溶液(3.0 mmol/L)滴到剛剝離的新鮮云母片表面, 常溫下吸附 15～20 min, 隨后在氮氣氣流下輕輕吹掃云母片表面至干燥. 干燥后的樣品使用 Nanoscope IVa Multi Mode (Digital Instruments, Santa Barbara, CA)進行掃描, 使用輕敲模式(Tapping Mode)及 TESP硅探針, 掃描角度為 0, 掃描速率為 1 Hz, 圖像分辨率為 512×512.
4.5 熒光光譜表征
將待測樣品(3.0 mmol/L)加入到 3 mm 的石英比色皿 中 , 選擇掃描模式為 Emission, 數(shù)據模式為Fluorescence, 設置激發(fā)波長, 狹縫寬度為 2.5 nm, 室溫下測定樣品的熒光光譜.
4.6 橢圓偏振光譜儀實驗
首先用5%(V/V)的Decon 90溶液及去離子水交替清洗單晶硅片, 并利用橢圓偏振光譜儀測量三個位置的厚度, 確保硅片上無雜質. 待測的溶液(3.0 mmol/L)盛放在液體池中, 入射偏振光以 70°角照進液體池, 收集偏振光在硅片表面上的反射, 測量電壓為 2～4 eV. 采用Jobi-Yvon 的 DeltaPsi 2 軟件擬合實驗數(shù)據, 得出樣品在固體表面的吸附厚度.
4.7 傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)實驗
先用D2O配制4.0 mmol/L的肽溶液, 常溫自組裝一周后進行表征. 實驗設置參數(shù): 掃描波長范圍為 4000～400 cm－1, 掃描次數(shù)為 256 次, CaF2池子厚度為 0.2 mm. 實驗前先扣除 D2O 背景再對樣品進行掃描.
免責聲明：本文為行業(yè)交流學習，版權歸原作者及原雜志所有，如有侵權，可聯(lián)系刪除。文章標注有作者及文章出處，如需閱讀原文及參考文獻，可閱讀原雜志。
