摘要:氨基酸是生命之源, 其中L⁃精氨酸(L⁃Arg)是生物體進(jìn)行新陳代謝的一種重要氨基酸, 同時也是重要的腫瘤標(biāo)志物之一. 因此, 開發(fā)高選擇性的L⁃Arg檢測方法在生物分析領(lǐng)域十分重要. 本文在Uniprot數(shù)據(jù)庫29185個蛋白質(zhì)序列中篩選出特異性結(jié)合L⁃Arg的多肽序列(序列為 CFGHIHEGY), 經(jīng)ITC驗(yàn)證后, 將其作為識別元件固定在子彈形納米孔道尖端表面. 在納米空間限域效應(yīng)下, 利用多肽與L⁃Arg特異性結(jié)合前后構(gòu)象由伸展?fàn)顟B(tài)向蜷縮狀態(tài)的變化, 調(diào)控納米孔道離子輸運(yùn)特性變化, 從而實(shí)現(xiàn)對L⁃Arg的選擇性檢測. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 多肽修飾納米孔道對L⁃Arg具有高靈敏度和高選擇性, 線性范圍為1~100 nmol/L, 檢出限低至1 nmol/L. 該研究為氨基酸高選擇性、 高靈敏檢測提供了新方法, 同時也為多肽修飾仿生離子通道的構(gòu)建提供了新思路.
L⁃精氨酸(L⁃Arg)作為一種常見的氨基酸, 廣泛存在于生物體內(nèi), 是人體內(nèi)的一種必需氨基酸[1]. 對于人體來說, L⁃Arg在新陳代謝過程中起到了重要的作用, 尤其在心血管、 免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)中具有重要的生物調(diào)控功能[2~4], 能夠促進(jìn)傷口愈合、 調(diào)節(jié)血管張力、 促進(jìn)激素分泌和調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能[5]、 調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能[6]以及促進(jìn)腸道健康[7]. L⁃Arg也是保證人體內(nèi)T細(xì)胞活力的重要物質(zhì), T細(xì)胞內(nèi)L⁃Arg可以促進(jìn)細(xì)胞的氧化代謝, 增加細(xì)胞活性、 持久性和體內(nèi)抗腫瘤反應(yīng)[8]. 此外, L⁃Arg可為某些營養(yǎng)缺陷性腫瘤提供養(yǎng)分, 是重要的腫瘤標(biāo)志物[9];同時, L⁃Arg可用于治療多種疾病[10]. 因此, 人體內(nèi)L⁃Arg的檢測在臨床診斷、 治療和生物功能研究中具有重要意義.
迄今, 在生命健康領(lǐng)域中L⁃Arg的檢測主要通過高效液相色譜(HPLC)[11]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)[12]進(jìn)行. 這兩種方法雖然檢測精確, 但需要專門的設(shè)備且樣品制作繁瑣、 檢測成本高. 為了實(shí)現(xiàn)L⁃Arg的快速、 簡便檢測, 近年來已開發(fā)了許多新型檢測方法, 如熒光檢測法、 比色檢測法及電化學(xué)檢測法等[13~15], 這些方法雖然能夠?qū)崿F(xiàn)高度靈敏和快速的檢測, 但仍有許多需要改進(jìn)的地方, 如傳感器微型化、 實(shí)時響應(yīng)、 傳感探針的簡易制備和材料的生物相容性等.
1 實(shí)驗(yàn)部分
聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜(厚度 13 μm, 雙軸取向), 德國Goodfellow公司;多肽(序列為CFGHIHEGY), 純度98.85%;氯化鈉、 氫氧化鈉、 磷酸磷酸二氫鈉、 磷酸氫二鈉、 L⁃半胱氨酸和乙酸, 分析純, 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;一水合嗎啉乙磺酸, 分析純, 上海麥克林生化科技有限公司;L⁃精氨酸, 分析純, 日本Sigma-Aldrich公司;L⁃丙氨酸、 L⁃色氨酸、 L⁃酪氨酸、 L⁃甘氨酸、 L⁃高半胱氨酸、 L⁃苯丙氨酸、 L⁃賴氨酸、 L⁃絲氨酸、 L⁃蘇氨酸、 L⁃天冬氨酸、 L⁃組氨酸、 L⁃谷氨酸、 L⁃谷氨酰胺、 L⁃異亮氨酸和L⁃脯氨酸, 分析純, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;Dowfax 2A1表面活性劑, Dow Chemical Company;實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電阻率≥18.3 MΩ·cm).
CHI-760B型電化學(xué)工作站, 上海辰華儀器有限公司;Ag/AgCl電極, 上海仙仁儀器儀表有限公司;TESCAN MIRA LMS型掃描電子顯微鏡(SEM), 捷克泰思肯有限公司;K-Alpha型X射線光電子能譜儀(XPS), 美國賽默飛世爾科技公司.
采用離子徑跡刻蝕法制備多種形態(tài)納米孔道[28]. 首先使用Xe轟擊PET薄膜(8.98 MeV/u)獲得單個徑跡的PET薄膜, 隨后用紫外燈對PET薄膜進(jìn)行單側(cè)照射, 照射時長為12 h. 照射完成后, 在60 ℃下用6 mol/L NaOH和Dowfax 2A1混合溶液(體積分?jǐn)?shù)0.05%)對PET薄膜進(jìn)行不對稱刻蝕, 刻蝕4 min后得到子彈形納米孔道. 刻蝕完成后, 用蒸餾水清洗, 將其置于Milli Q超純水中靜置過夜.
圓錐形納米孔道的制備與子彈形納米孔道類似, 用紫外燈對 PET 薄膜的正反面進(jìn)行照射, 照射時長均為12 h. 照射完成后, 在分散槽中對PET薄膜進(jìn)行不對稱刻蝕得到圓錐形納米孔道(刻蝕液為 9 mol/L NaOH溶液, 停止液為1 mol/L KCl和1 mol/L醋酸溶液). 利用電化學(xué)工作站對開孔情況進(jìn)行監(jiān)測, 施加1 V的電壓, 用雙電極體系記錄電流隨時間的變化來表征納米孔道是否貫通. 當(dāng)電流上升到一定大。ǜ鶕(jù)所需尖端孔徑大小確定)時, 用停止液替換刻蝕液以停止刻蝕. 用超純水洗滌3遍, 然后將其置于超純水中靜置過夜.
對納米孔道進(jìn)行化學(xué)刻蝕后, 其表面會暴露大量的羧基(—COOH)基團(tuán). 利用這一特性, 在納米孔道中可以固定含氨基(—NH2)的識別原件. 將PET薄膜放置在50 mmol/L EDC和250 mmol/L NHS混合的MES溶液(0.1 mol/L, pH=4.7)中, 浸泡1 h后從混合液中取出, 使用超純水將PET 薄膜沖洗干凈. 隨后, 將多肽溶液(0.2 mg/mL, pH=7.4)加入至納米孔道孔徑較小一側(cè)對應(yīng)的聚四氟乙烯分散槽中, 孵育1 h后, 用超純水沖洗PET薄膜, 除去未固定的多肽. 最后, 用含有1 mol/L NaCl的PBS緩沖液(10 mmol/L, pH=7.4)為電解液, 測量電流-電壓(I⁃V)曲線, 檢測多肽是否已修飾.
錐形納米孔道尖端部分孔徑(d)根據(jù)與I⁃V曲線線性區(qū)域獲得的電導(dǎo)率(G)的依賴關(guān)系確定, 相關(guān)公式如下:
式中:G為電導(dǎo)率, 通過I-V曲線線性區(qū)斜率可算得;k為電解液的離子電導(dǎo)率;L為納米孔道長度 (13 μm);D為基底端孔徑, 其大小由刻蝕時間t計(jì)算得出, 關(guān)系式為D=5t(實(shí)驗(yàn)中使用多孔徑跡腐蝕膜確定系數(shù)為5).
通過檢測I⁃V曲線對制備的單孔PET薄膜進(jìn)行了表征. 使用兩電極體系[Scheme 1(A)]檢測納米孔兩端電流, 首先將單孔膜夾在兩個聚四氟乙烯分散槽之間, 在膜兩側(cè)加入 1 mol/L NaCl電解質(zhì)溶液. 隨后, 在兩側(cè)分散槽溶液中各放置1個Ag/AgCl電極, 使用電化學(xué)工作站測量穩(wěn)定電壓下單孔膜的離子電流. 在單孔膜兩側(cè)施加-1~1 V的電壓, 每0.1 V記錄對應(yīng)電流大小并繪制I⁃V曲線圖, 觀察離子電流大小及整流系數(shù)變化, 施加-60~60 mV的電壓, 每10 mV記錄對應(yīng)電流大小并繪制I⁃V曲線圖, 計(jì)算斜率得到納米孔道電導(dǎo)率.
使用Materials Studio軟件對多肽結(jié)合L⁃Arg過程進(jìn)行模擬. 首先構(gòu)建精氨酸和九肽分子的三維立體模型, 隨后在Forcite模塊中進(jìn)行幾何優(yōu)化, 擬合得到多肽識別L⁃Arg的構(gòu)象變化. 利用perl腳本將精氨酸從多肽分子N端移動到C端, 得到多種可能的構(gòu)象變化, 通過計(jì)算找出能量最低的構(gòu)象, 即為最穩(wěn)定的構(gòu)象.
2 結(jié)果與討論
納米孔道經(jīng)過化學(xué)刻蝕后, 孔道內(nèi)聚合物鏈段的酯鍵水解, 其表面被羧基覆蓋[31], 基于氨基和羧基的共價偶聯(lián), 利用EDC/NHS作為偶聯(lián)劑將多肽固定在納米孔道內(nèi)表面. 為了進(jìn)一步驗(yàn)證多肽已修飾在納米孔道的內(nèi)表面, 對未修飾納米孔道薄膜和多肽修飾納米孔道薄膜進(jìn)行了XPS表征. 如圖1(B) 所示, 未修飾的納米孔道薄膜(譜線a)只有O1s 和C1s 峰清晰可見, 這是PET薄膜材料自身所含元素. 在納米孔道薄膜修飾多肽后(譜線b), 除O1s 和C1s 峰外, 還存在N1s 峰(399 eV). 這表明在多肽修飾后, 納米孔道中引入了N元素, 由于多肽中含有氨基和肽鍵, 因此N元素的引入證明多肽已被固定.
為了驗(yàn)證多肽對L⁃Arg的特異性識別, 使用裸孔進(jìn)行了離子電流檢測. 如圖2(C)和(D)所示, 在加入L⁃Arg后, 裸孔的離子電流和電導(dǎo)率未發(fā)生明顯變化. 以上結(jié)果表明, 多肽修飾納米孔道在L⁃Arg識別過程中, 多肽是L⁃Arg的識別元件.
為了探究納米孔道中多肽修飾和L⁃精氨酸識別過程中孔道有效孔徑的具體變化, 使用圓錐形納米孔道替換子彈形納米孔道重復(fù)上述實(shí)驗(yàn). 圓錐形納米孔道形狀規(guī)整, 在不使用SEM表征孔徑大小的情況下, 可以通過電導(dǎo)率的大小估算出納米孔道的尖端孔徑[32]. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖S1(見本文支持信息)所示, 裸錐形孔的電導(dǎo)率G1為2.0 nS, 修飾多肽后電導(dǎo)率G2減少至0.9 nS, 加入1 nmol/L L⁃Arg后電導(dǎo)率G3增加至1.3 nS. 根據(jù)錐形納米孔道電導(dǎo)率與孔徑關(guān)系式, 計(jì)算得出裸孔的尖端孔徑d1為14.7 nm, 修飾多肽后尖端孔徑d2減小為6.6 nm, 加入L⁃Arg后尖端孔徑d3增大為9.5 nm. 上述數(shù)據(jù)表明, 納米孔道尖端內(nèi)表面的多肽及其周圍水分子組成的多肽膜厚度為4.1 nm, 加入L⁃Arg后多肽膜厚度變?yōu)?2.6 nm.
將多肽修飾納米孔道對L⁃Arg的檢測性能與其它方法檢測L⁃Arg的性能進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)(表S3, 見本文支持信息), 該方法具有更低的檢出限.
通過考察多肽修飾納米孔道對L⁃Arg和不同氨基酸混合物的響應(yīng)情況研究了其抗干擾性. 實(shí)驗(yàn)選擇L⁃半胱氨酸、 L⁃色氨酸、 L⁃酪氨酸、 L⁃高半胱氨酸、 L⁃苯丙氨酸和L⁃賴氨酸等17種氨基酸作為干擾物, 考察了加入50 nmol/L的L⁃Arg和500 nmol/L的干擾物混合物后, 納米孔道的電導(dǎo)率響應(yīng)情況. 如 圖4(B)所示, 加入干擾物后電導(dǎo)率響應(yīng)情況與單獨(dú)加入L⁃Arg一致, 且多肽修飾納米孔道對其余17種氨基酸的混合物無明顯電導(dǎo)率響應(yīng). 由此可知, 多肽修飾納米孔道可以在多種氨基酸混合物中選擇性識別L⁃Arg, 具有良好的抗干擾性, 可用于選擇性檢測L⁃Arg.
3 結(jié)論
基于多肽修飾的納米孔道開發(fā)了一種選擇性檢測L⁃Arg的新方法. 首先制備了子彈形納米孔道, 使用SEM對子彈形納米孔道的形貌進(jìn)行了表征. 通過納米孔道內(nèi)表面的羧基基團(tuán)及多肽自身的胺基基團(tuán)將多肽固定在納米孔道內(nèi)表面, 并使用XPS表征了修飾的多肽. 由于多肽對L⁃Arg的特異性識別與結(jié)合, 加入L⁃Arg后納米孔道的電導(dǎo)率會隨之變化, 以此可實(shí)現(xiàn)對L⁃Arg的定量分析. 該方法具有優(yōu)異的選擇性, 線性響應(yīng)范圍為1~100 nmol/L. 與其它方法相比, 該方法具有更低的檢出限, 且檢測時間短, 不需要昂貴的儀器. 同時, 由于納米孔道自身的微型尺寸, 在后續(xù)的研究中可以將納米孔道集成在微流控設(shè)備中, 為氨基酸傳感器的微型化、 柔性化提供了研究思路. 此外, 納米孔道的制備材料為PET薄膜, 對人體無害且具有柔性, 因此納米孔道傳感器在未來也可廣泛地應(yīng)用于可穿戴式傳感器領(lǐng)域.
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