摘 要: 細(xì)胞穿透環(huán)肽能夠穿透細(xì)胞膜，特異性地靶向細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)，并具有較好的體內(nèi)穩(wěn)定性，因而具備很好的成藥性，并受到研究者越來越多的關(guān)注。目前，主要有兩種方式獲得細(xì)胞穿透環(huán)肽，即從天然產(chǎn)物中獲得和對已有的環(huán)肽或線性肽進行化學(xué)修飾。本文主要對上述兩方面進行簡要綜述，重點介紹兩類細(xì)胞穿透環(huán)肽天然產(chǎn)物以及通過化學(xué)修飾方法得到細(xì)胞穿透環(huán)肽的策略，并探討細(xì)胞穿透環(huán)肽的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系及其細(xì)胞穿透機理。
多肽類藥物是新興的生物藥物研發(fā)熱門領(lǐng)域，全世界已經(jīng)獲批上市的多肽類藥物超過 50 個。與小分子藥物比較［1，2］，多肽類藥物具有結(jié)合面更大、作用靶向性更強、更安全、副作用更小、很少引起嚴(yán)重的免疫反應(yīng)等優(yōu)點［3，4］，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于癌癥、心血管病、代謝類和傳染性病等各類疾病的治療。
但是，常見的多肽分子存在無法跨越細(xì)胞膜，酶解穩(wěn)定性差和口服生物利用度低等問題［5］，導(dǎo)致大多數(shù)具有治療作用的多肽藥物很難進入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效，且容易在體內(nèi)降解［6］，因此，多肽藥物在實際應(yīng)用中受到了極大的限制。為了克服多肽藥物存在的問題，人們發(fā)現(xiàn)并發(fā)展了一類細(xì)胞穿透環(huán)肽分子，它們具有穿過細(xì)胞膜的能力，并能特異性地靶向細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)，體內(nèi)穩(wěn)定性高，口服生物利用度好，更具成藥前景。另一方面，蛋白化學(xué)合成領(lǐng)域取得的一系列重要進展［7 ～ 15］，促進研究者發(fā)展了一系列化學(xué)合成環(huán)肽的方法［16 ～ 20］，為研究和改造環(huán)肽從而得到細(xì)胞穿透環(huán)肽奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，有效解決了細(xì)胞穿透環(huán)肽分子的獲取問題。
本文重點介紹目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞穿透環(huán)肽及其透膜機理，同時也簡述各種獲得細(xì)胞穿透環(huán)肽的化學(xué)修飾策略，最后討論該領(lǐng)域存在的問題，并展望細(xì)胞穿透環(huán)肽的應(yīng)用前景。
2 天然產(chǎn)物中的細(xì)胞穿透環(huán)肽
環(huán)肽是自然界中一類廣泛存在的天然產(chǎn)物，可以通過核糖體或非核糖體途徑合成，具有抗菌、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗免疫等生理作用。其中，某些環(huán)肽具有穿透細(xì)胞膜的能力，即本文所述的細(xì)胞穿透環(huán)肽環(huán)孢素( cyclosporine A)和植物環(huán)肽( cyclotides)。
研究表明，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的植物環(huán)肽來源的 4 個細(xì)胞穿透環(huán)肽的跨膜機理各不相同。MCoTI-Ⅱ通過細(xì)胞主動攝取的方式進入細(xì)胞。熒光成像跟蹤技術(shù)表明，MCoTI-Ⅱ出現(xiàn)在吞噬小體中，并且細(xì)胞攝取過程對溫度敏感，說明 MCoTI-Ⅱ 的跨膜過 程 是 主 動 過程，需要消耗能量［36］。MCoTI-Ⅰ的跨膜機理則較為復(fù)雜，是流體相內(nèi)吞作用( fluid-phase endocytosis)、依賴脂質(zhì)的內(nèi)吞作用和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用等共同作用的結(jié)果［35］。而植物環(huán)肽 kalata B1 有細(xì)胞毒性，超過一定濃度時會導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，引起細(xì)胞死 亡。實 驗 發(fā) 現(xiàn)，kalata B1 和 磷 脂 酰 乙 醇 胺( POPE ) 有 相 互 作 用，可 以 引 起 POPE 外 翻( transbilayer movement)，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜兩側(cè)的不對稱。Craik 等猜測 kalata B1 通過與細(xì)胞膜的相互作用，改變細(xì)胞膜的曲率，從而引起細(xì)胞的內(nèi)吞作用［36］。另一方面，kalata B1 與細(xì)胞膜的親和性與脂筏相關(guān)，帶負(fù)電的膽堿并不是細(xì)胞膜與 kalata B1 發(fā)生強相互作用的原因［37］。
植物環(huán)肽細(xì)胞穿透過程的研究還處于較初級的階段。一方面，其結(jié)構(gòu)在跨膜過程中的作用還不夠明確。在研究植物環(huán)肽的跨膜過程時，實驗條件的差異會導(dǎo)致不同的實驗結(jié)果。比如實驗中選擇的細(xì)胞系對內(nèi)吞方式的偏好程度不同、所用植物環(huán)肽的濃度不同等，都會對結(jié)果產(chǎn)生影響。同時，當(dāng)前只能通過改變殘基的方式來探究各個位點對整個跨膜過程的貢獻，還無法實時監(jiān)測環(huán)肽的構(gòu)象變化對跨膜過程的影響。另外，對跨膜過程中的細(xì)胞吞噬行為的理解十分有限。除對網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的吞噬作用和細(xì)胞膜窩樣內(nèi)陷( caveolae) 介導(dǎo)的吞噬作用理解較多外，生物學(xué)家對其他類型的細(xì)胞內(nèi)吞行為的理解并不深入。這也阻礙了研究者對植物環(huán)肽跨膜過程的進一步理解。因此，發(fā)展新型技術(shù)研究植物環(huán)肽跨膜特性的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系仍是一個尚待解決的科學(xué)問題。
3 人工改造的細(xì)胞穿透環(huán)肽
細(xì)胞穿透環(huán)肽具有很好的成藥前景，這促使研究者利用化學(xué)合成手段對多肽分子進行改造，以期獲得兼具強生理活性和跨膜能力的環(huán)肽分子，甚至環(huán)肽庫。下面將從 CSA 的改造、植物環(huán)肽的改造和線性肽環(huán)化等三方面策略進行介紹。
基于 CSA 的細(xì)胞穿透環(huán)肽的設(shè)計思路包括調(diào)節(jié)環(huán)肽的構(gòu)象和多肽骨架酰胺 N-甲基化兩方面。
為了更加定量地研究并預(yù)測環(huán)肽被動擴散跨膜的能力，Lokey 和 Jacobson 等提出了一種新的預(yù)測方法［42］。假設(shè)環(huán)肽在細(xì)胞膜中的構(gòu)象(低介電環(huán)境構(gòu)象 low-dielectric conformation，LDC) 只有一種，他們指出，經(jīng)典的擴散模型 Pe = KpD / d 中的 Kp應(yīng)理解為 LDC 在細(xì)胞膜和水相中的分配系數(shù)，而不是通常實驗所測得的所有構(gòu)象下的平均值。他們提出，可以通過分子動力學(xué)計算得到 ΔGI ( 利用公式 ΔGI =－ ＲTlnKp )，從而可以理論計算出滲透率。他們指出，這個模型的預(yù)測能力比預(yù)測氫鍵數(shù)目和預(yù)測極性表面積更加準(zhǔn)確。盡管他們計算出的 ΔGI和實驗測得的 lnPe呈線性關(guān)系，但比例系數(shù)卻并不一致，因為計算中沒有考慮熵效應(yīng);另外，環(huán)肽分子尺寸和形狀等因素也沒有考慮在內(nèi)，并且實驗驗證量很小，其模型的正確性還有待檢驗。
對經(jīng)被動擴散跨膜的環(huán)肽而言，預(yù)測并通過化學(xué)修飾的方法改變 LDC 構(gòu)象，從而減小環(huán)肽從水相向細(xì)胞膜遷移中的吉布斯自由能變是研究的關(guān)鍵點。所以，認(rèn)識化學(xué)修飾對環(huán)肽構(gòu)象的影響是其中重要的科學(xué)問題。然而，在現(xiàn)有的被動擴散跨膜的環(huán)肽實例中，其殘基基本都是不帶電荷并且是非極性的，說明這種跨膜策略對氨基酸殘基的要求較高，對極性和帶電荷的殘基的容忍度較低。針對這個問題，可以適當(dāng)引入容忍度較大的非天然氨基酸以提高被動擴散策略下環(huán)肽的多樣性;另一方面，可以利用細(xì)胞內(nèi)外 pH 或酶活性的差異，設(shè)計 pH 響應(yīng)或酶響應(yīng)殘基，在細(xì)胞外其極性被掩蔽，在細(xì)胞內(nèi)去掩蔽，激活環(huán)肽的正常生理活性。
除了多肽構(gòu)象變化對跨膜能力有貢獻，多肽骨架的酰胺 N-甲基化對跨膜能力也有影響。骨架酰胺 N-甲基化修飾在天然產(chǎn)物中很常見。在特定位置引入 N-甲基可以增強多肽與受體間的相互作用、增強多 肽 對 靶 標(biāo) 的 選 擇 性 或 改 變 蛋 白 的 聚 集 行為［43 ～ 45］。
以上工作表明，N-甲基化可以通過改變環(huán)肽在水相中的構(gòu)象來提高其跨膜能力。在前人工作的基礎(chǔ)上，Kessler 等系統(tǒng)地研究了 N-甲基化對環(huán)肽構(gòu)象的影響［50］。他們選擇環(huán)六肽 cyclo( -D-Ala-Ala5 -) 作為研究對象，分析不同 N-甲基化衍生物在水相中的二維核磁結(jié)構(gòu)。他們認(rèn)為 N-甲基化會從以下三方面影響環(huán)肽 β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的形成，從而導(dǎo)致跨環(huán)分子內(nèi)氫鍵的出現(xiàn): ( 1 ) 肽鍵的順、反式; ( 2 ) 對骨架上N—H 氫鍵的掩蔽作用;(3 ) 扭曲環(huán)肽原本的結(jié)構(gòu)。他們發(fā)現(xiàn)，實驗中所得到的一些典型的 β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)在前人 發(fā) 現(xiàn) 的 N-甲 基 化 細(xì) 胞 穿 透 環(huán) 肽 中 有 對 應(yīng)物［22，4 6 ，47］。另外，他們指出某些結(jié)構(gòu)特殊的氨基酸可以起到在環(huán)肽中引入 N-甲基化或 D-型構(gòu)象的作用，例如 α-N 甲基化的脯氨酸和具有對稱性的甘氨酸。
以上這些發(fā)現(xiàn)對細(xì)胞穿透環(huán)肽的設(shè)計有指導(dǎo)作用，但是其中仍存在一些問題。比如，研究系統(tǒng)多是環(huán)六肽，所以無法知曉當(dāng)環(huán)增大后，跨環(huán)氫鍵與 N-甲基化之間具有怎樣的協(xié)同或其他相互影響。同時，其他位置 N-甲基化對 β-轉(zhuǎn)角的形成有怎樣的影響也不明了;同時，環(huán)增大后，基于篩選的 N-甲基化策略將變得更為困難，因為需要合成的衍生物數(shù)量呈指數(shù)上升。所以，需要發(fā)展可以快速得到大量細(xì)胞穿 透 環(huán) 肽 的 N-甲 基 化 修 飾 方 法。Jacobson 和Lokey 等［49］報道的選擇性甲基化的工作對此具有一定啟發(fā)性，但是距離目標(biāo)實現(xiàn)還有較大差距。
雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些植物環(huán)肽可以通過細(xì)胞膜，并且其中的某些環(huán)肽如 MCoTI 和 Kalata B 作為多肽骨架被用于嫁接多肽的研究，但是由于植物環(huán)肽的跨膜方式多為細(xì)胞主動攝取，需要消耗能量，并且過程復(fù)雜，機理不明。同時，其過程不像被動擴散一樣廣泛存在于小分子藥中。因此，植物環(huán)肽跨膜效率仍不明確，對不同細(xì)胞的耐受度也不清楚。故而，需要進一步搞清介導(dǎo)植物環(huán)肽跨膜的分子機制;同時，還需要系統(tǒng)地研究可以進入細(xì)胞膜的植物環(huán)肽在人體內(nèi)的藥代動力學(xué)，搞清其跨膜效率及在體內(nèi)的分布狀況。在對植物環(huán)肽的跨膜結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和藥代動力學(xué)認(rèn)識深入后，可利用化學(xué)手段優(yōu)化環(huán)肽結(jié)構(gòu)，使其在體內(nèi)的行為更符合成藥的要求。
為使線性肽環(huán)化后得到環(huán)肽具有細(xì)胞穿透能力，通常使用的策略包括側(cè)鏈環(huán)化的“訂書肽”策略和在環(huán)肽中引入細(xì)胞穿透序列。
細(xì)胞穿透肽 ( cell penetrating peptides，CPP) 是一 類 能 夠 穿 過 細(xì) 胞 膜 的 線 性 肽，包 括 穿 膜 肽( penetratin )［60］、轉(zhuǎn) 錄 激 活 因 子 ( trans-activator oftranscription，Tat ) 片 段［61］、Pep-1［62］、多 精 氨 酸( polyarginines)［63］ 等。CPP 可 以 通 過 細(xì) 胞 主 動 攝�。�64］或非能量依賴的轉(zhuǎn)運過程［65，66］進入細(xì)胞，并能將與之共價或非共價連接的蛋白或核酸運入細(xì)胞。細(xì)胞穿透肽常帶有相當(dāng)多的精氨酸，表面帶正電，能夠與細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷發(fā)生靜電作用，增強與細(xì)胞膜的相互作用。這類多精氨酸的 CPP ( arginine richpeptides，ＲＲP) 通過與細(xì)胞膜相互作用使細(xì)胞膜變薄，產(chǎn)生瞬時孔從而穿過細(xì)胞膜。利用 CPP 能夠?qū)⑴c其共價連接的分子帶入細(xì)胞的特點，Pei 等將 CPP共價地連接到環(huán)肽分子上，成功實現(xiàn)了環(huán)肽分子跨膜［67］。但是，直接修飾的 ＲＲP 分子細(xì)胞穿透能力差，有時具有細(xì)胞毒性，引起細(xì)胞壞死［68 ～ 70］。
4 結(jié)論
與普通線性多肽相比，細(xì)胞穿透環(huán)肽具有較好體內(nèi)穩(wěn)定性，并能夠穿過細(xì)胞膜而特異性結(jié)合細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)，具備很好的成藥性，因此細(xì)胞穿透環(huán)肽已經(jīng)成為當(dāng)前藥物研究的新熱點。本文從天然產(chǎn)物來源和人工改造來源兩方面綜述了細(xì)胞穿透環(huán)肽領(lǐng)域的研究進展及發(fā)展前景。在化學(xué)合成獲得所需環(huán)肽分子的基礎(chǔ)上，我們?nèi)匀恍枰M一步理解環(huán)肽分子的跨膜機理、環(huán)肽分子與受體或膜間相互作用的分子機制和具體過程，以設(shè)計、改造得到具有細(xì)胞穿透活性的環(huán)肽藥物。
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