摘要：實現(xiàn)多肽藥物的口服利用，一直以來都是人們研究的熱點。然而由于胃腸道復(fù)雜的生理屏障，口服多肽藥物的生物利用度一直較低。本文歸納了阻礙多肽藥物口服吸收的主要屏障，并綜述了針對不同屏障所采取的相應(yīng)治療策略。與此同時，本文還列舉了目前應(yīng)用于多肽藥物口服遞送的新技術(shù)與新進展，這些新技術(shù)的發(fā)展將會為提高多肽藥物口服生物利用度帶來新希望。
相較于傳統(tǒng)化學(xué)藥物，多肽藥物具有以下幾點特性 ：①活性較高，較少的給藥劑量就能實現(xiàn)一定的治療效果 ；②對酶的抵抗性低，易被胃腸道消化酶及體液中的水解酶降解，從而失去活性 ；③相對分子質(zhì)量較大，且部分藥物極性較強 (logP<0)，較大的親水性使其很難被細胞攝取，無法有效穿過胃腸道的生理屏障。鑒于此，多肽藥物的口服生物利用度極低 [1]，臨床應(yīng)用困難重重。目前已開發(fā)了一些技術(shù) [ 如胃腸道滲透增強技術(shù) (GIPET®)、瞬態(tài)滲透性增強劑 (TPE®) 技術(shù)等 ] 用于口服遞送多肽藥物 [2—3]。本文結(jié)合人體胃腸道的生理學(xué)特征，綜述了多肽藥物面對不同的生理屏障時所應(yīng)用的針對性策略。
1 胃腸道的生理屏障
幾十年來，科學(xué)家們研究了多種技術(shù)以提高多肽藥物的口服生物利用度，包括使用酶抑制劑和滲透促進劑 (penetration enhancer，PE)、化學(xué)修飾、納米載體、油相基質(zhì)及結(jié)腸靶向等 [9—10]。然而，通常對于具有不同物理化學(xué)性質(zhì)的多肽，需要聯(lián)合應(yīng)用不同的技術(shù)。下面針對不同生理屏障的應(yīng)對策略進行綜述。
2 針對胃部酸屏障和酶屏障的應(yīng)對策略
文獻報道 [12]，多肽與高分子連接后 [ 如聚乙二醇 (PEG) 化 ] 能有效提高穩(wěn)定性，防止酶的降解，但同時也要注意高分子的加入有可能阻礙多肽與受體的結(jié)合，從而降低多肽的活性。
3 針對腸道屏障的應(yīng)對策略
小腸中的酶主要是胰蛋白酶、糜蛋白酶及羧肽酶等，這些酶系能將多肽藥物降解成片段，使其失去生理活性。對于這種酶屏障，最有效的手段就是加入酶抑制劑以保護多肽藥物的完整結(jié)構(gòu)。常用酶抑制劑包括抑肽酶、大豆蛋白酶抑制劑及亮肽素，它們能有效阻止多肽與酶的結(jié)合。酶抑制劑已被用于胰島素的口服遞送，如以色列 Oramed 公司設(shè)計的 ORMD-0801，系將蛋白酶抑制劑 ( 大豆蛋白酶抑制劑或抑肽酶 ) 與滲透促進劑 [ 乙二胺四乙酸(EDTA) 或 SNAC] 和多肽混懸在 omega-3 油酸中，進而裝載于腸溶膠囊中。臨床試驗證明，該膠囊具有較好的口服降糖效果，已處于Ⅲ期臨床試驗階段 [13]。KRAELING 等也證明抑酶肽的加入能有效提高胰島素的生物利用度 [14]。除胰島素外，酶抑制劑與吸收促進劑的組合還被用于降鈣素及甲狀旁腺激素 (PTH)(1-34) 的口服遞送 [15]。然而，頻繁使用酶抑制劑可能會導(dǎo)致過多蛋白酶的分泌，產(chǎn)生胰腺炎等不良反應(yīng)，因此其使用的安全性有待進一步觀察 [16]。
綜上所述，腸道酶屏障已有較好的解決方案。除了加入酶抑制劑外，納米載體及化學(xué)修飾等手段均能較好地保護多肽不受酶的降解。
腸上皮細胞表面附有凝膠狀的黏液層，其黏度較大且在不斷流動，能有效阻止外來顆�；蚣毦秩氲郊毎麑又�，有重要的保護作用，卻也導(dǎo)致藥物很難透過。黏液的不斷稀釋作用縮短了多肽藥物與小腸上皮細胞層的接觸時間，很難形成適宜藥物進行滲透的濃度差。因此，研究者找到了黏膜吸附材料來實現(xiàn)藥物的局部富集。材料與黏膜間的相互作用力主要有氫鍵、電荷間相互作用、疏水相互作用和范德華力。其中電荷間相互作用是一種有效且強度適中的作用力。由于黏液蛋白在腸道 pH 值條件下顯電負性，因此合適的陽離子高分子聚合物能通過電荷間作用力達到黏膜黏附的目的。DAMGÉ等將聚己內(nèi)酯 (PCL)與聚陽離子高分子聚合物(Eudragits RS) 混合，制備納米粒來口服遞送胰島素，結(jié)果該納米粒能通過電荷間相互作用緊密吸附在腸道黏膜上，最終實現(xiàn) 13.2％的口服生物利用度 [17]。
除了上述非共價作用力之外，硫代高分子也能與黏液中富含半胱氨酸的糖蛋白通過共價鍵結(jié)合產(chǎn)生較強的黏膜吸附作用。MARSCHÜTZ 等證明巰基化的聚丙烯酸高分子與新鮮的離體腸道黏膜的結(jié)合時間是未巰基化材料對照組的 25 倍以上 [18]；KAST 等制備了巰基化比例不同的殼聚糖材料，證明巰基化程度越高，材料與黏膜的吸附能力越強 [19]。這些結(jié)果均說明富含巰基的化合物或高分子聚合物能有效地與腸道黏膜吸附，以達到富集藥物的效果。
然而，僅實現(xiàn)黏膜吸附還無法使藥物通過與小腸上皮細胞接觸而被吸收，還需要使藥物具有一定的黏膜滲透性 [20]。為實現(xiàn)黏膜滲透，就需要進行一定的修飾和改性。PEG 修飾是一種較有效的增加黏膜滲透的方法，對粒子進行 PEG 包被能有效降低納米粒與黏膜之間的相互作用 [21]。但 PEG 的包被密度及其相對分子質(zhì)量大小都會影響納米粒的黏膜擴散能力，PEG 相對分子質(zhì)量過小 (<2 000) 或過大 (>10 000) 均會影響?zhàn)つB透效能，且 10％PEG 包被密度的納米粒相比于 20％及 5％時具有更好的擴散能力 [22—23]。
其他親水性高分子材料也可增加納米粒的黏膜內(nèi)擴散，SHAN 等將胰島素與細胞滲透肽進行混合，通過電荷間作用力形成內(nèi)核，之后在表面包被一層親水性的 N-(2- 羥丙基 ) 甲基丙烯酸共聚物 (pHPMA) 形成 170 nm 的納米粒 [24]。由于親水性外殼的作用，該粒子較易在黏膜中擴散，且粒子對黏膜的滲透效率也高于未包被親水性高分子的內(nèi)核。將 pHPMA 熒光標(biāo)記后檢測，可觀察到粒子在黏膜中的熒光強度快速下降。這是因為親水性外殼與內(nèi)核通過較弱的非共價鍵結(jié)合，所以親水外殼在擴散過程中就能較快脫落，在到達細胞層表面時僅剩下載藥內(nèi)核，不影響后續(xù)粒子的跨細胞轉(zhuǎn)運。TIAN 等設(shè)計了一款具有核殼結(jié)構(gòu)的納米粒，內(nèi)核由胰島素與 N-(2- 羥丙基 )-3- 三甲基氯化銨修飾的殼聚糖構(gòu)成，而外殼包被了巰基修飾的透明質(zhì)酸(HA-SH)[25]。通過巰基實現(xiàn)粒子的黏膜吸附效果，同時隨著粒子在黏液中的滲透，HA-SH 外殼不斷脫落，釋放出內(nèi)核，繼而實現(xiàn)對細胞的滲透。
綜上所述，目前提高藥物對黏液或黏膜滲透的主要方法可以概括為 ：增加與黏膜的接觸時間與局部藥物濃度 ( 黏膜吸附 )、提高藥物在黏液中的擴散 ( 黏膜滲透 ) 以及局部打開黏膜層 ( 黏液水解 )。
目前大多數(shù)的研究都集中在如何突破腸上皮細胞屏障，現(xiàn)有的實現(xiàn)細胞滲透的技術(shù)主要為多肽修飾 ( 化學(xué)改構(gòu) )、輔料添加 ( 如滲透促進劑 )、改變劑型 ( 納米粒、微乳 ) 等，或這些技術(shù)的聯(lián)合使用。
較高的 logP 值有助于藥物穿透細胞膜的磷脂雙分子層 [28]。因此，通過化學(xué)修飾提高多肽的親脂性能增強其細胞滲透能力。目前，提高多肽親脂性的化學(xué)方法為脂質(zhì)化修飾，又可細分為合成前藥與非前藥 2 種，二者的主要區(qū)別在于是否需要通過代謝釋放出活性藥物，本文對此不予細分。PARMENTIER 等利用二硫鍵將低分子殼聚糖與艾塞那肽結(jié)合，顯著提高了艾塞那肽的親脂性及口服降糖效果 [29]。脂肪酸修飾是應(yīng)用較廣泛的提高多肽親脂性的方法，其中的典型案例是口服索瑪魯肽制劑的成功開發(fā)。然而，并非所有的脂肪酸修飾都能起到增加多肽口服吸收的效果。TRIER 等分別進行了索瑪魯肽與利拉魯肽的口服給藥試驗，在相同處方的情況下，口服索瑪魯肽組出現(xiàn)了明顯的吸收效果，利拉魯肽則幾乎沒有吸收，這說明并非所有的脂質(zhì)化都能提高多肽的滲透性。在多肽穿透細胞的過程中存在著一種微妙的平衡，既要保證充足的與細胞膜間的相互作用，同時又不能由于膜插入程度過強而阻礙多肽的跨細胞轉(zhuǎn)運 [30]。對于索瑪魯肽來說，其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)為多肽與細胞膜的結(jié)合提供了合適的平衡點，換言之，有些親脂化修飾并不一定會提高多肽滲透的能力 [11]。
綜上所述，多肽的化學(xué)修飾目前主要從增加親脂性提高被動擴散以及修飾配體增加主動轉(zhuǎn)運兩方面進行研究，該技術(shù)的單獨應(yīng)用往往并不能達到理想的體內(nèi)吸收效果，需要與其他促滲方法聯(lián)合應(yīng)用。
降低腸上皮細胞外的鈣離子濃度能擾亂胞間緊密連接中的鈣離子依賴性黏著蛋白，從而打開緊密連接，增加多肽藥物的滲透。鈣離子螯合劑就是根據(jù)這一原理應(yīng)用于促進多肽藥物滲透的研究，EDTA 是其中最常用的鈣離子螯合劑。Oramed 公司在艾塞那肽中加入滲透促進劑 EDTA 與大豆蛋白酶抑制劑制備腸溶制劑，實現(xiàn)了艾塞那肽的口服吸收，并在 Beagle 犬模型中取得了明顯的口服降糖效果 [41]。一些細菌毒素能特異性地破壞緊密連接中的黏著蛋白 (E-cadherin) 及密閉蛋白 (claudine) 等，以增加多肽對上皮細胞層的滲透，如產(chǎn)氣莢膜桿菌腸毒素 (CPE)[40]。FASANO 等將封閉小帶毒素(ZOT) 應(yīng)用于胰島素口服制劑的設(shè)計，結(jié)果證明加入 ZOT 顯著增強了胰島素的滲透效率，比不加ZOT 的對照組提高了 10 倍，并且能保持小腸上皮細胞層的完整性 [42]。但打開緊密連接可能會導(dǎo)致一些致病微生物也跟隨著多肽藥物進入血液循環(huán)造成全身感染，因此具有一定的安全性風(fēng)險。
綜上所述，由于制備工藝簡單、促滲功能較好、工藝放大容易等優(yōu)點，目前滲透促進劑已得到廣泛研究，相信未來將會有更多的生物大分子有望通過該技術(shù)實現(xiàn)口服給藥。
滲透促進劑增加生物利用度的作用有限，目前較難通過該法達到 10％以上的生物利用度，因此科研人員將關(guān)注點放在了納米載體上，希望能利用納米載體提高多肽的吸收。納米載體提高多肽吸收的優(yōu)勢在于：①納米粒能阻止胃腸道酶對多肽的降解，起到保護多肽的作用 ；②通過調(diào)整粒徑、電荷及表面性質(zhì)等手段，可增加胃腸道上皮細胞對粒子的攝取 ；③對粒子表面進行主動靶向配體的修飾，能使粒子與細胞膜表面的受體或轉(zhuǎn)運體特異性結(jié)合，從而完成受體介導(dǎo)的跨細胞膜轉(zhuǎn)運，并且與直接將配體修飾在藥物上的方法相比，不存在降低多肽活性的風(fēng)險 ；④通過對納米粒的制備工藝及載體材料的優(yōu)化，可控制藥物的釋放位置及釋放速率，從而有助于藥物的定位、定量釋放 [ 48]�；谇拔乃隹缟掀ぜ毎D(zhuǎn)運的 5 個途徑，納米載體實現(xiàn)藥物吸收主要通過以下 3 種手段 ：①利用載體材料的親脂特性，增強與細胞膜的親和力 ；②利用各種配體 (Tf、VB12、膽酸等 )、CPP 及 Fc 片段等對載體表面進行主動靶向修飾，提高主動轉(zhuǎn)運效率 ；③利用上皮細胞層上的特殊細胞 ( 如 M 細胞或杯狀細胞 ) 進行主動轉(zhuǎn)運。
脂類材料制成的納米粒主要包括固體脂質(zhì)納米粒 (SLN) 及脂質(zhì)體，因此利用這 2 種納米載體進行多肽藥物遞送的研究較多。脂質(zhì)體作為一種經(jīng)典載體，也被應(yīng)用到口服多肽藥物遞送的研究中。Diasome 公司設(shè)計了一款肝靶向的胰島素脂質(zhì)體(HDV-1)，系將胰島素包載進入粒徑小于 150 nm的脂質(zhì)體中，并在表面進行靶向修飾，使其能直接靶向肝臟，從而重建胰島素在肝臟部位的正常生理響應(yīng)，以達到口服降糖效果 [49]。KISEL 等開發(fā)了一款以二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺 (DPPE) 為材料的脂質(zhì)體，該材料與傳統(tǒng)蛋黃磷脂相比具有更高的熔點，因此制備的脂質(zhì)體更穩(wěn)定 ；體內(nèi)試驗證明該脂質(zhì)體能實現(xiàn)胰島素的有效遞送，具有口服降糖效果 [50]。
除脂質(zhì)體外，另一種具有代表性的脂類載體SLN 也受到廣泛關(guān)注。但 SLN 只對疏水性藥物具有較高的載藥量，因此在包載親水性多肽藥物時就要先將藥物與相應(yīng)的表面活性劑通過電荷間相互作用結(jié)合，形成疏水性復(fù)合物，以提高粒子的載藥量。CHEN 等利用復(fù)乳法以硬脂酸及棕櫚酸甘油酯為原料制備了降鈣素 SLN，藥動學(xué)試驗證明其口服生物利用度高達 13％ [51]。CHEN 等先將艾塞那肽與膽酸鈉制成膠束，再將膠束包裹在 SLN 中，這樣能達到 97.7％的包封率以及 12％的口服生物利用度 [52]。
此外，還有很多天然或合成高分子材料被用于多肽藥物口服遞送的研究，如殼聚糖、海藻酸鹽、聚乳酸 - 羥基乙酸共聚物 (PLGA)、葡聚糖等 [53]。其中殼聚糖被證明能打開緊密連接，因此應(yīng)用廣泛。在中性條件下，殼聚糖顯正電性，能與帶負電荷的高分子形成納米粒。SONAJE 等在 pH 6.0 下將殼聚糖與聚 γ- 谷氨酸混合形成納米粒用來負載胰島素，凍干后裝入腸溶膠囊，能達到 20％的口服生物利用度 [54]。也有人對殼聚糖納米粒表面進行改性，將鈣離子螯合劑乙二醇雙 (2- 氨基乙基醚 ) 四乙酸(EGTA) 修飾到納米粒表面，或通過在表面修飾硫醇基團以增加黏膜吸附性等手段來促進粒子經(jīng)細胞間轉(zhuǎn)運 [55]�？傊�，殼聚糖作為一種具有良好生物相容性的材料，有望在多肽藥物口服遞送中發(fā)揮重要作用。除上述納米粒外，Nod 公司設(shè)計了一款具有生物黏附性的磷酸鈣納米粒，處方中包含艾塞那肽、磷酸鈣及膽鹽或中鏈脂肪酸 (C8 ～ C10)，能有效增加艾塞那肽的口服吸收，目前正在進行Ⅰ期臨床試驗 [56]。
在納米粒表面進行配體修飾，可促進納米粒通過主動轉(zhuǎn)運途徑進行吸收，也是研究熱點之一。PRIDGEN 等以聚乳酸 (PLA)-PEG 為材料制備了包載胰島素的納米粒，并在表面修飾了 IgG 抗體的 Fc片段，通過該片段與上皮細胞表面的 Fc 受體 (FcRn)特異性結(jié)合，介導(dǎo) IgG 抗體的跨上皮細胞轉(zhuǎn)運，從而實現(xiàn)受體介導(dǎo)的納米粒攝取 [57]。FAN 等在包載胰島素的殼聚糖 - 聚乙醇酸 (PGA) 納米粒表面修飾去氧膽酸，通過上皮細胞表面鈉離子依賴性膽酸轉(zhuǎn)運體完成多肽轉(zhuǎn)運 [58]。ZHANG 等制備了帶有生物素靶頭的脂質(zhì)體，并證明該納米粒的吸收是通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑完成的 [59]。
在小腸細胞中，除了占多數(shù)的刷狀上皮細胞外，還有一些具有特殊功能的細胞，如 M 細胞。M 細胞表面的糖蛋白較少、水解酶活性較低，因此具有較高的跨細胞膜轉(zhuǎn)運能力，可轉(zhuǎn)運細菌、病毒、抗原及納米粒等 [60]。凝集素具有較好的 M 細胞靶向能力，是一類能與細胞膜上的糖脂或糖蛋白上的糖基進行特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。在納米粒表面進行凝集素修飾能增加 M 細胞對粒子的攝取。M 細胞表面存在的一些病原體識別受體也可被用作靶標(biāo)，實現(xiàn)對 M 細胞的靶向作用。除靶向 M 細胞外，JIN等還報道了一種能靶向杯狀細胞的殼聚糖納米粒，該納米粒上修飾了一段靶向肽 (CSK 肽 )，在其作用下能靶向上皮細胞層中的杯狀細胞，利用特定細胞實現(xiàn)藥物的吸收 [61]。
以上介紹的是目前常用且被廣泛證明有效的一些技術(shù)。隨著研究的不斷深入，一些新技術(shù)也被應(yīng)用于大分子藥物的遞送研究。離子溶液 (ionic liquids) 是一種僅由離子構(gòu)成、熔點小于 100 ℃的鹽。離子溶液的形成原理類似于固體的鹽和共晶，是通過離子鍵或氫鍵等作用力形成的一種常溫或正常體溫下為液體的一種物質(zhì)。此外，離子溶液具有增加難溶性藥物溶解度等作用，因此也被廣泛應(yīng)用于小分子藥物的遞送 [62—63]。近年來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)了離子溶液在遞送生物大分子方面的潛力。BANERJEE 等利用由膽堿和香葉酸 (CAGE)組成的離子溶液制備了口服胰島素給藥體系，體外Caco-2 細胞模型試驗說明 CAGE 離子溶液對胰島素的遞送具有濃度依賴性，因此推斷是該制品通過打開緊密連接、增加胞間轉(zhuǎn)運實現(xiàn)遞送 [64]。同時體內(nèi)試驗也說明該 CAGE 離子溶液具有較好的降糖效果，且口服 5 u/kg 的胰島素能產(chǎn)生與皮下注射2 u/kg 相似的吸收效果。
為實現(xiàn)胰島素的跨膜運輸，Rani 公司開發(fā)了一款基于微針技術(shù)的智能遞送系統(tǒng) [15]。這款智能膠囊具有一種“氣球狀”充氣結(jié)構(gòu)，當(dāng)進入小腸后，外層腸溶衣殼開始溶解，觸發(fā)枸櫞酸和碳酸氫鈉的反應(yīng)，釋放出二氧化碳，使膠囊內(nèi)部結(jié)構(gòu)膨脹，將微針刺入到小腸腸腔上，從而實現(xiàn)胰島素的跨小腸上皮細胞釋放。這種智能膠囊直接穿透了腸壁的物理屏障，因此遞送效率也得到較大提高，生物利用度可達到 50％以上，成為一種遞送多肽藥物的新式“武器”。
4 結(jié)論
多肽藥物口服遞送面臨著眾多的生物屏障，無論是酸屏障、酶屏障，還是腸壁細胞層屏障，目前都已找到了較好的解決手段。然而目前上市的口服多肽產(chǎn)品有限，大部分研究仍然處在臨床前或臨床試驗階段。酶抑制劑與滲透促進劑的組合在臨床試驗中被證明是一種有效的遞送手段，但該法對于生物利用度的提高并不十分理想。較低的生物利用度往往會浪費較多藥物，導(dǎo)致成本提高。而納米粒雖能達到較高的生物利用度，但面臨著產(chǎn)業(yè)化難度大、批間差異顯著等缺陷，較難實現(xiàn)臨床應(yīng)用。一些新技術(shù) ( 離子溶液、微針 ) 的應(yīng)用讓人們看到了多肽藥物口服給藥的新希望。
由于多肽的物理化學(xué)性質(zhì)千差萬別，每一種多肽藥物都應(yīng)有其最適合的遞送方式。SNAC 能有效遞送索瑪魯肽但卻無法實現(xiàn)利拉魯肽的口服吸收這一實例提醒我們，針對不同性質(zhì)的藥物要選擇不同的口服遞送策略 [11]。現(xiàn)有的策略均有其一定的局限性，或是無法實現(xiàn)生物利用度的更大提升，或是無法在工藝水平上實現(xiàn)量產(chǎn)。
隨著人們對多肽藥物在胃腸道生理環(huán)境下行為的深入研究及遞送藥物技術(shù)的不斷進步，在多肽藥物口服遞送領(lǐng)域中的嘗試會越來越多，相信將來會有更多能提高患者順應(yīng)性的口服多肽產(chǎn)品問世，為慢性病患者帶來福音。
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