摘 要：隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，居民的生活方式和疾病譜不斷發(fā)生變化，吸煙、過量飲酒、缺乏鍛煉、不合理膳食等不健康生活方式普遍存在，其引發(fā)的慢性疾病問題不斷增加，進(jìn)而使人們對營養(yǎng)保健食品的關(guān)注和需求提高。功能多肽獨(dú)特的營養(yǎng)特性和生理功能，以及在生物代謝調(diào)控中的重要作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，特別是植物源多肽更因其天然、無毒副作用的特點(diǎn)受到國內(nèi)外研究者普遍關(guān)注。針對近年來蛋白功能多肽在食品和醫(yī)藥方面的研究新進(jìn)展，本文總結(jié)了植物源功能多肽的制備方法、生理活性以及在功能食品領(lǐng)域的應(yīng)用前景，為植物源功能多肽的開發(fā)和應(yīng)用提供理論參考。
改革開放以來，隨著工業(yè)化、城市化和人口老齡化進(jìn)程的加快，我國居民的生活方式不斷發(fā)生變化，吸煙、酗酒、缺乏鍛煉、飲食不合理等不健康的生活方式更加普遍，由此引發(fā)了許多疾病問題，患有心腦血管疾病、癌癥、呼吸系統(tǒng)疾病、糖尿病等慢性疾病的人數(shù)正在不斷上升。據(jù)統(tǒng)計，2019年，這些慢性非傳染性疾病死亡人數(shù)約占我國總死亡人數(shù)的88%[1]。
蛋白質(zhì)作為生物體的重要組成部分，是生命的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的許多生理和功能特性被認(rèn)為歸因于蛋白質(zhì)分子中的多肽[2-4]。肽可以維護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)人體生理功能[5]。大量研究表明，植物來源的多肽具有許多生物活性，包括抗氧化、抗高血壓、抗菌、抗癌、抗類阿片肽活性以及免疫調(diào)節(jié)作用[6-8]。近年來，隨著基因表達(dá)譜分析、純化、測序和表征等技術(shù)的飛速發(fā)展，多肽的功能也越來越清晰，已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[9]。為了解近年來功能多肽的研究新進(jìn)展以及在改善亞健康方面的作用，本文介紹了植物源功能多肽的制備方法、生理活性以及在功能食品方面的應(yīng)用前景。
1 植物多肽的制備方法
提取法是從生物體中直接提取天然多肽類物質(zhì)的方法。由于植物中存在的肽類物質(zhì)數(shù)量非常有限，直接提取手段很難滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要，且該方法提取成本高、產(chǎn)量低，因此應(yīng)用并不廣泛。提取法又可分為化學(xué)提取法和物理提取法�；瘜W(xué)提取法是將生物材料浸泡在適當(dāng)?shù)木彌_溶液中充分溶解，采用離心方法除去不溶性組分，調(diào)節(jié)溶液pH值或加入變性劑沉積蛋白質(zhì)，再次離心去除沉淀和其他雜質(zhì)，最后通過分子篩層析柱純化得到多肽[10]。Fan Xiaodan等[11]以兩步法策略從螺旋藻中提取多肽，其不僅改進(jìn)了原始亞臨界水提�。╯ubcritical water extraction，SWE）設(shè)備的萃取釜，而且將SWE與超聲耦合聯(lián)用并進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化，提取多肽的分子質(zhì)量分布結(jié)果表明，傳統(tǒng)的超聲+凍融方法提取的主要是蛋白質(zhì)，而新工藝超聲+SWE方法提取的主要是多肽，這是一種無需酶水解即可獲得多肽的方法。馮晴霞等[12]采用硫酸銨沉淀法從姬松茸蛋白酶解物中分離多肽組分，通過動物實驗研究表明，姬松茸多肽提取物可以對衰老模型小鼠產(chǎn)生延緩衰老的作用，這可能與多肽的抗氧化作用有關(guān)。物理提取法是一種新興的多肽制備方法[13]，無需借助于化學(xué)試劑，僅依靠超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀對動植物組織進(jìn)行裂解，從而得到小分子多肽。該方法能最大程度地保證多肽的生物活性，但是對設(shè)備要求高、單次處理量小、多肽得率低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
利用微生物發(fā)酵制備多肽具有成本低、安全性高、質(zhì)量穩(wěn)定、功能顯著等優(yōu)點(diǎn)，并且屬于一步法制備多肽工藝。該方法是利用微生物產(chǎn)生各種酶催化劑（如蛋白酶），在生長過程中微生物將其釋放到培養(yǎng)基，從而導(dǎo)致蛋白水解產(chǎn)生多肽。使用特定微生物進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程可持續(xù)數(shù)小時乃至數(shù)天（具體時間取決于微生物的類型和多肽產(chǎn)物的種類），在發(fā)酵結(jié)束時，產(chǎn)品可以直接使用，也可以純化后再利用[14]。Wang Xu等[15]以黃瓜種子為原料，通過枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)鈣結(jié)合肽，結(jié)果表明，這種含鈣螯合劑可用作一種新型鈣補(bǔ)充劑。He Rong等[16]通過枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵制備油菜籽肽（rapeseed peptides，RPs），并評估其抗氧化活性，結(jié)果表明，RPs具有作為天然抗氧化劑的潛力，且由于多肽中必需氨基酸的比例極高，RPs產(chǎn)品還可作為高營養(yǎng)價值食品。
水解法可分為酸水解、堿水解和酶水解。在食品領(lǐng)域，由于酸堿試劑的腐蝕性，單純的酸堿水解法不常被使用；相比之下，酶水解法具有專一性強(qiáng)、提取率高、成本低、產(chǎn)品安全性高、整個過程條件溫和、便于控制等特點(diǎn)，能很好地滿足實驗和生產(chǎn)的需求，因此成為制備活性肽應(yīng)用最廣泛的方法。酶解法通常是使用單個或多個特異性或非特異性蛋白酶，包括胃蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶等[17]。該法的關(guān)鍵點(diǎn)是選擇合適的酶和酶解條件，如pH值、溫度、時間等。Ugolini等[18]在葵花籽脫脂種子粉中使用Alcalase-Flavourzyme酶進(jìn)行兩步酶促水解，獲得了富含游離氨基酸和其他生物活性化合物的水解產(chǎn)物，該產(chǎn)品在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域可作為有效的生物刺激劑。Li Meiqing等[19]使用微波輔助Alcalase酶對黑大豆蛋白進(jìn)行水解，制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽，柱層析分離獲得4 個活性組分，其中餾分III表現(xiàn)出最高的抑制ACE活性。
在以上3 種方法中，提取法產(chǎn)品得率低、對設(shè)備要求高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。發(fā)酵法成本低、安全性高，存在著多肽分離和純化困難的問題，但是隨著基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，具有某種特異功效多肽的生物合成能為人類帶來更為豐富的多肽產(chǎn)品。盡管酶法提取多肽專一性強(qiáng)、提取率高、便于控制，但同時也存在酶催化劑被大量浪費(fèi)、混合肽中副產(chǎn)物多、最合適酶難以尋找及產(chǎn)率過低等制約該方法應(yīng)用的諸多不足之處。
2 植物源功能多肽的生理活性
抗氧化多肽能有效清除機(jī)體自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，保護(hù)機(jī)體免受損傷，是研究最為廣泛的一類多肽[23]。能夠獲得抗氧化肽的植物源材料很多，已從豆類、堅果、種子和樹葉中分離和鑒定出具有抗氧化作用的肽類物質(zhì)。為了提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值，研究人員探索了以西瓜種子、玉米面筋粗粉、花生粕和紫蘇粕等農(nóng)產(chǎn)品加工廢棄物作為抗氧化肽的來源[24]。Siddiqui等[25]制備了功能化的氧化石墨烯納米片（PAni-Ag-GONC），并將其作為載體以共價健固定胰蛋白酶，使胰蛋白酶保留了90%的抗氧化活性，而天然胰蛋白酶在4 ℃下貯存60 d后，僅保留了44%的活性，表明由納米復(fù)合物結(jié)合的胰蛋白酶產(chǎn)生的肽表現(xiàn)出較強(qiáng)的自由基清除活性。該策略為生物靶向催化藥物和功能食品的開發(fā)提供了一種新方法。施文衛(wèi)等[26]通過堿溶酸沉法制備鷹嘴豆分離蛋白，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化蛋白酶解條件，結(jié)果表明，在整個蛋白酶解過程中，得到的混合肽均具有明顯的抗氧化活性，這些抗氧化肽可以應(yīng)用到運(yùn)動飲料中減緩運(yùn)動員的疲勞感�？寡趸倪�具有極低的致敏性，可以應(yīng)用到嬰幼兒食品或一些針對敏感性人群的抗氧化食品。Liu Chunlei等[27]從榛子加工副產(chǎn)物中獲得的多肽顯示出優(yōu)異的抗氧化活性，該研究有助于榛子抗氧化肽功能性食品、抗氧化藥物制劑的開發(fā)。Lu Xin等[28]利用堿性蛋白酶和胰蛋白酶組合的雙酶系統(tǒng)水解芝麻蛋白，從水解物中分離并鑒定出7 種抗氧化肽，結(jié)果表明，芝麻蛋白水解物有望開發(fā)為治療慢性代謝疾病的功能性食品，但還需要進(jìn)一步證明芝麻肽的定量構(gòu)效關(guān)系及其作用機(jī)理，并研究環(huán)境因素對抗氧化活性的影響。Muhialdin等[29]研究了煮沸和發(fā)酵過程對苦豆肽抗氧化活性的影響，結(jié)果表明，苦豆在發(fā)酵過程中可產(chǎn)生具有很強(qiáng)抗氧化活性的生物活性肽。這些肽可用作功能性食品工業(yè)的天然食用抗氧化劑成分。
與其他植物相比，糧谷類原料中提取和鑒定出的抗氧化肽更多，這應(yīng)該與谷類具有較高含量蛋白質(zhì)有關(guān)。也有學(xué)者從植物葉片中分離抗氧化肽，植物葉片可能成為提取多肽的又一廉價原料。然而，當(dāng)前文獻(xiàn)中鑒定和報道的大多數(shù)抗氧化肽包含未修飾的氨基酸殘基，對由修飾殘基組成的抗氧化肽的鑒定可能會在未來引起研究者們更濃厚的興趣。
隨著社會生活水平的提高，世界范圍內(nèi)高血壓患者越來越多，其發(fā)病率也越來越高，尤其是在發(fā)達(dá)國家，更多油炸食品和營養(yǎng)食品的攝入導(dǎo)致國民的血壓指標(biāo)進(jìn)一步升高；因此，人們對降壓肽越來越感興趣。降血壓肽主要通過抑制ACE來預(yù)防和治療高血壓[30-31]。Zhang Peng等[32]評估了利用小麥面筋通過銅綠假單胞菌蛋白酶（Pseudomonas aeruginosa protease，PaproA）制備ACE抑制肽的可行性。結(jié)果表明，小麥肽在營養(yǎng)保健和功能食品中均具有較好應(yīng)用潛力，可成為預(yù)防和治療高血壓的成分。何榮[33]從菜籽蛋白質(zhì)堿性蛋白酶水解物和胃蛋白酶+胰酶水解物（尤其是分子質(zhì)量小于3 kDa的水解物）中獲得了降血壓肽。研究表明，蛋白酶水解菜籽蛋白可以有效地釋放具有腎素和ACE抑制活性的抗高血壓肽，利用膜分離或電滲析技術(shù)富集高活性的菜籽肽是可能的。Chen Jiwang等[34]從大米蛋白水解物中獲得ACE抑制肽，該肽可能成為治療高血壓很有前途的候選成分。此外，大米蛋白水解產(chǎn)物可以單獨(dú)用作營養(yǎng)保健品，或與其他有益健康的營養(yǎng)成分組合，用于預(yù)防或治療高血壓。馬超月[35]采用酶法獲得了燕麥多肽，并對其工藝進(jìn)行了優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，開展了燕麥多肽的降血脂和降血壓效果研究，為燕麥的深加工和燕麥多肽的應(yīng)用積累了理論基礎(chǔ)。Zheng Yajun等[36]在高壓預(yù)處理輔助下，用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶對棕櫚仁進(jìn)行順序消化，可得到具有高ACE抑制活性（80.24%）的棕櫚仁谷氨酸-2水解物，并且該肽對胃腸道酶消化具有相對較好的穩(wěn)定性，可用作控制ACE活性功能性食品的有效成分。
目前，國內(nèi)外降血壓肽的研究熱點(diǎn)主要集中在降血壓分子機(jī)制、體內(nèi)外生理活性檢測以及其構(gòu)效關(guān)系上，這有望為實現(xiàn)降血壓肽的工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。我國擁有十分豐富的原料來源，尤其是加工過程的一些副產(chǎn)物，如果可以利用其提取降血壓肽，將大大推動相關(guān)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。
免疫系統(tǒng)是細(xì)胞、組織和器官組成的巨大網(wǎng)絡(luò)，其作用是消除潛在的有害生物，如細(xì)菌、病毒、真菌和原生動物等，并能夠防止癌細(xì)胞生長[37]。但是，過度的免疫反應(yīng)會引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，長期處于炎癥狀態(tài)會激發(fā)腫瘤的發(fā)生，所以，免疫調(diào)節(jié)對維持機(jī)體健康至關(guān)重要[38]。Fang Yong等[39]利用堿法從富硒大米中提取含硒蛋白質(zhì)并將其水解，結(jié)果表明，獲得的含硒多肽具有很好的免疫調(diào)節(jié)能力，可以作為天然的免疫調(diào)節(jié)劑，然而，這類免疫活性肽在體內(nèi)發(fā)揮作用的機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。Yang Qian等[40]在太子參中提取對脾淋巴細(xì)胞具有增殖促進(jìn)作用的蛋白水解產(chǎn)物，并探究其作用機(jī)制，實驗結(jié)果表明，從太子參中提取的多肽可以顯著激活RAW264.7細(xì)胞分泌NO，激發(fā)活性氧和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），并通過與RAW264.7細(xì)胞表面表達(dá)的Toll樣受體結(jié)合激活核因子-κB信號通路。
李�，B等[41]初步探究了鷹嘴豆肽對免疫低下小鼠的體質(zhì)量、臟器指數(shù)、組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、外周血白細(xì)胞數(shù)量、外周血T淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子、骨髓有核細(xì)胞和DNA濃度的影響，結(jié)果表明，鷹嘴豆肽對環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的多項免疫功能均有顯著的改善作用，為鷹嘴豆肽的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。Hirai等[42]從小麥面筋中提取了焦谷氨酰肽，它能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的NO、TNF-α和白細(xì)胞介素的產(chǎn)生，抑制炎癥的免疫調(diào)節(jié)作用。焦谷氨酰亮氨酸由于不穩(wěn)定性或半衰期較短、容易水解且可用性有限，在體內(nèi)的有效性還需要進(jìn)一步研究。
近年來，酶解是目前國內(nèi)外制備免疫活性肽最有潛力的技術(shù)，而如何靶向肽鍵仍是制備免疫活性肽最困難的核心技術(shù)。靶向水解涉及肽鏈長度的控制和功能序列的保護(hù)，還需要進(jìn)一步研究以克服特殊蛋白酶切位點(diǎn)的暴露和隱藏等技術(shù)難題。
Preza等[46]確定了未發(fā)酵和半發(fā)酵（發(fā)酵24 h）可可豆肽對鼠淋巴瘤L5178Y模型的抗腫瘤作用，結(jié)果表明，這種抗腫瘤作用不是劑量依賴性的，具有非常好的應(yīng)用前景。此外，半發(fā)酵的可可豆蛋白具有非常顯著的抑制細(xì)胞生長作用，分析得知這種作用歸因于氨基酸譜，主要與半胱氨酸、亮氨酸、精氨酸和賴氨酸含量有關(guān)。Romy等[47]研究發(fā)現(xiàn)橄欖種子蛋白經(jīng)嗜熱菌素水解得到的多肽類物質(zhì)具有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞黏附能力、降低癌細(xì)胞遷移能力以及抑制S期細(xì)胞生長的作用，通過氨基酸組成分析后得到的合成肽LLPSY能顯著抑制前列腺癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的增殖。
與傳統(tǒng)的化療藥物相比，多肽類抗腫瘤藥物具有高選擇性和低毒性。然而，抗腫瘤肽的應(yīng)用和發(fā)展仍面臨著合成成本高、易酶解、易聚合、半衰期短等挑戰(zhàn)。為了解決多肽易水解的問題，可以用非天然氨基酸來替代天然氨基酸，如設(shè)計D-對映體肽、多肽環(huán)化等對抗腫瘤肽進(jìn)行修飾，結(jié)合傳統(tǒng)藥物能更好地發(fā)揮抗腫瘤肽的作用，這將成為抗腫瘤肽發(fā)展的一個重要方向。尋找更多來源的抗腫瘤肽和克服肽類藥物缺點(diǎn)的新方法對開發(fā)抗腫瘤治療藥劑具有重大意義。
糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，其發(fā)病率和死亡率都很高[48]。糖尿病的治療方法很多，包括口服1型和2型胰島素片，但目前還沒有有效的治療方法，國內(nèi)外一直在研究更有效、更安全的替代藥劑[49]。顏輝等[50]采用胰蛋白酶酶解麥胚蛋白得到麥胚蛋白多肽，動物實驗結(jié)果表明，麥胚蛋白酶解產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的半抑制質(zhì)量濃度為10.98 mg/mL，能夠緩解糖尿病小鼠的糖耐量異常。Wang Feng等[51]研究了燕麥球蛋白肽對人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco-2細(xì)胞）中抗糖尿病藥物靶標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)燕麥球蛋白肽對這些抗糖尿病藥物靶標(biāo)具有相反的調(diào)節(jié)作用，可以在體外有效地抑制二肽基肽酶-4（dipeptidylpeptidase 4，DPP4）的產(chǎn)生，且燕麥球蛋白肽可作用于調(diào)節(jié)血糖的多個靶點(diǎn)；但該多肽對體內(nèi)調(diào)節(jié)血糖靶標(biāo)的功效還需要進(jìn)行體內(nèi)研究。
Vilcacundo等[52]開展了胃腸消化藜麥蛋白質(zhì)產(chǎn)生抗糖尿病多肽的研究，評價了胃和十二指腸消化物和多肽對二肽基肽酶IV、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，結(jié)果表明，在十二指腸階段釋放的多肽顯示出較強(qiáng)的抑制作用，并具有抑制腸降血糖素降解和碳水化合物消化酶的酶解能力，但缺乏細(xì)胞培養(yǎng)和動物體模型實驗以進(jìn)一步驗證藜麥蛋白多肽的具體功效。Yuan Xiaoqing等[53]從苦瓜中提取蛋白，并制備獲得水溶性多肽MC2-1-5，結(jié)果表明，MC2-1-5可以明顯降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖水平，下一步在MC2-1-5完整氨基酸序列的確定及其降血糖機(jī)制上應(yīng)繼續(xù)深入研究。
3 結(jié) 語
植物源功能多肽已經(jīng)引起了世界各國科學(xué)家及政府的高度重視，功能多肽的結(jié)構(gòu)、制備方法以及藥理作用的研究得到快速發(fā)展[54]，眾多新型多肽被開發(fā)出，多肽的功能保健作用也越來越清晰，如大豆肽可降血脂、降血壓、降血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等，豌豆肽具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等生理活性，苦瓜肽是一種很好的降血糖物質(zhì)[55-57]。另外，藻類植物蛋白、食用菌蛋白、堅果籽粒蛋白以及人參蛋白經(jīng)過蛋白酶水解后，也可以分離出其他功能肽[58-61]。部分功能多肽已用于保健食品開發(fā)，實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。
然而，植物源功能多肽的研究才剛起步，還有許多研究工作需要開展。比如，酶提取法專一性強(qiáng)、提取率高、便于控制，但存在難以尋找最合適酶及產(chǎn)率過低等問題，是否可以考慮直接利用混合肽的作用效果；在某些氨基殘基上發(fā)現(xiàn)的各種修飾基團(tuán)的存在，可能為肽序列的鑒定帶來更多的研究方向。為了解決多肽易水解的問題，可用非天然氨基酸替代天然氨基酸，如設(shè)計D-對映體肽、多肽環(huán)化等對抗腫瘤肽修飾，這也將成為抗腫瘤肽發(fā)展的一個重要方向。隨著蛋白組學(xué)、基因組學(xué)和色譜質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，復(fù)雜多肽的組成鑒定和構(gòu)效關(guān)系研究也會變得越來越容易。
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