摘要：骨架環(huán)肽是線性肽的C端和N端通過(guò)酰胺鍵進(jìn)行首尾環(huán)合而形成的環(huán)狀分子. 研究者從細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了大量的骨架環(huán)肽. 這種首尾環(huán)合的結(jié)構(gòu)，使得骨架環(huán)肽具有很好的酶穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，部分骨架環(huán)肽具有細(xì)胞膜通透性. 骨架環(huán)肽分子異常的穩(wěn)定性和高效的生物活性，使得其成為目前藥物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn). 為了更深入地研究它們的結(jié)構(gòu)和功能，骨架環(huán)肽的制備成為一個(gè)重要問(wèn)題. 概述了化學(xué)合成骨架環(huán)肽的一些方法，包括：（1）固相環(huán)合策略；（2）液相環(huán)合策略；（3）分子內(nèi)自然化學(xué)連接策略，并對(duì)這些方法的特點(diǎn)和效率進(jìn)行了討論比較.
骨架環(huán)肽(Backbone cyclized peptides)是線性多肽的頭尾通過(guò)酰胺鍵相連而形成的環(huán)狀分子. 與線性多肽相比, 骨架環(huán)肽具有較為剛性的環(huán)骨架結(jié)構(gòu)特征, 因而對(duì)蛋白水解酶穩(wěn)定性顯著提高, 甚至部分骨架環(huán)肽具有獨(dú)特的細(xì)胞膜通透性. 正是這一原因, 骨架環(huán)肽成為當(dāng)今國(guó)際藥物領(lǐng)域的重要研究對(duì)象[1～7]. 早在第二次世界大戰(zhàn)期間, 蘇聯(lián)科學(xué)家高斯就發(fā)現(xiàn)由 10 個(gè)氨基酸組成頭尾環(huán)合而成的短桿菌肽具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的功能[8]. 它是二戰(zhàn)期間治療傷病人傷口感染的主要藥物, 挽救了無(wú)數(shù)人的生命. 短桿菌肽的發(fā)現(xiàn)成為環(huán)肽研究的重要?dú)v性事件. 隨后, 研究者在細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)環(huán)肽, 其中許多不乏藥物功能. 例如, 由 11 個(gè)氨基酸組成的環(huán)孢素可用于器官移植中防止免疫反應(yīng); 含有多個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的乳酸鏈球菌肽可用于防止食品腐敗; 多粘素可用于治療腸胃疾病等[9].
骨架環(huán)肽的天然功能是宿主防御作用, 即通過(guò)抑制外來(lái)生物的生長(zhǎng)來(lái)保護(hù)本物種的生存和延續(xù). 通過(guò)活性實(shí)驗(yàn), 研究者發(fā)現(xiàn)骨架環(huán)肽還具有一些獨(dú)特生物功能,可用于治療人類疾病. 如存在于植物中的環(huán)多肽(Cyclotide)具有助子宮收縮活性、抗菌性、抗 HIV 活性以及抗腫瘤活性[10]. 然而, 從生物中得到的骨架環(huán)肽可能對(duì)人體產(chǎn)生生物毒性, 因此多數(shù)不能直接用于臨床試驗(yàn) , 而需要對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造 . 例 如 , 為了降低Cyclotide 的生物毒性, 研究者需要對(duì)其個(gè)別位點(diǎn)進(jìn)行突變或者通過(guò)“嫁接”的方式將具有生物活性的外源功能肽融合于 Cyclotide 中[11].
骨架環(huán)肽可以通過(guò) 3 種途徑獲得: 從生物體中分離、基因重組技術(shù)和化學(xué)從頭合成. 從生物體內(nèi)純化骨架環(huán)肽的方法存在分離難度大、效率低和工作量大的缺點(diǎn). 由于骨架環(huán)肽存在特殊的頭尾環(huán)合的酰胺鍵結(jié)構(gòu), 傳統(tǒng)基因重組表達(dá)技術(shù)也不能直接用于骨架環(huán)肽的制備, 需要對(duì)菌種進(jìn)行再改造, 因而該方法技術(shù)難度相對(duì)較高. 骨架環(huán)肽對(duì)菌種的毒性也會(huì)常常導(dǎo)致基因重組表達(dá)失敗. 此外, 生物表達(dá)含有非天然修飾的骨架環(huán)肽的能力十分有限. 相比前兩種方法, 化學(xué)從頭合成骨架環(huán)肽具有優(yōu)勢(shì), 如可以任意改變氨基酸的序列, 可以實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)的任意突變, 以及可以任意非天然氨基酸的嵌入等.
從環(huán)化反應(yīng)的特點(diǎn)來(lái)看, 骨架環(huán)肽的化學(xué)合成經(jīng)歷了二個(gè)階段. 早期骨架環(huán)肽的合成是以側(cè)鏈官能團(tuán)全保護(hù)的線性肽為底物, 頭尾通過(guò)縮合試劑而環(huán)化. 該方法存在許多缺點(diǎn). 例如, 需要預(yù)制部分或全部保護(hù)的線性多肽; 反應(yīng)位點(diǎn)手性中心不能保持和容易發(fā)生多聚化副反應(yīng). 上世紀(jì)末本世紀(jì)初, 研究者發(fā)展出化學(xué)選擇性連接環(huán)化反應(yīng)制備骨架環(huán)肽的方法, 成功解決了傳統(tǒng)縮合法的缺陷. 雖然歷史上有不少關(guān)于環(huán)肽方面的綜 述[12～17], 但是多數(shù)是籠統(tǒng)介紹骨架環(huán)肽、側(cè)鏈環(huán)肽和環(huán)肽類似物的進(jìn)展, 專門介紹骨架環(huán)肽的合成的綜述文章仍很少. 基于國(guó)際上最近涌現(xiàn)許多課題組利用新型的多肽連接反應(yīng)制備骨架環(huán)肽, 我們將著重從化學(xué)合成角度綜述骨架環(huán)肽的最新進(jìn)展.
1 固相環(huán)化策略
固相環(huán)化指多肽頭尾成酰胺鍵反應(yīng)在樹脂上完成. 該策略有兩個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn), 如降低分子間碰撞幾率, 減少分子間多聚化副反應(yīng); 減少合成中的分離和純化的次數(shù). 一般來(lái)說(shuō), 多肽可采用兩種方式固定于樹脂上, 即利用側(cè)鏈官能基團(tuán)錨定樹脂和利用 C 端羧基固定于樹脂. 前者在固相上完成多肽序列的拼接后, 脫去 N 端和C 端保護(hù)基游離出自由氨基和羧基, 再在固相上完成 C端羧基和N 端氨基的縮合環(huán)化. 后者則利用主鏈 C端羧基錨定樹脂, 在多肽序列拼接完成后, 活化多肽的 C 端, 并隨之與N 端自由氨基發(fā)生分子內(nèi)胺解環(huán)合反應(yīng). 第二種方法環(huán)化和多肽的固相切割是同時(shí)進(jìn)行的, 且不需要側(cè)鏈固定, 因而比第一種方法更具優(yōu)勢(shì). 需要指出, 固相環(huán)化反應(yīng)不能保證反應(yīng)位點(diǎn)的構(gòu)型完全保持, 對(duì)于易消旋的氨基酸具有潛在的危險(xiǎn).
1.1 側(cè)鏈固定樹脂
利用氨基酸側(cè)鏈官能團(tuán)固定樹脂, 線性多肽 N 端氨基和 C 端羧基通過(guò)縮合反應(yīng)生成環(huán)肽是固相合成骨架環(huán)肽的常用方法. 該方法需要正交的保護(hù)基用于保護(hù)多肽側(cè)鏈功能團(tuán)、N 端氨基和 C 端羧基. 側(cè)鏈功能團(tuán)一般采用對(duì)酸敏感的保護(hù)基; N 端氨基可采用 Fmoc; C 端羧基常用對(duì) Pd 敏感的烯丙酯結(jié)構(gòu). 具體的操作如圖 1 所示. 首先, 第一個(gè)氨基酸利用側(cè)鏈官能團(tuán)和樹脂上官能團(tuán)反應(yīng)固定于樹脂; 該氨基酸的α-氨基以Fmoc保護(hù), C-端羧基采用烯丙酯保護(hù). 接下來(lái), 按照傳統(tǒng) Fmoc 固相合成完成目標(biāo)序列的拼接后, 分別用 Pd(PPh3)4、哌啶試劑解除 C 端烯丙酯和 N 端 Fmoc 保護(hù)基. 最后, 線性多肽首尾通過(guò)縮合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)環(huán)化, 并在 TFA 作用下與樹脂分離, 最終得到天然結(jié)構(gòu)的環(huán)肽. 常用側(cè)鏈固定樹脂的氨基酸為 Asp, Glu[18], His[19]或者 Lys[20]. 2011 年, Veerman 等[21]利用 Glu 側(cè)鏈錨定樹脂, 合成出環(huán)狀人體唾液中的組胺素, 并證明其活性是天然線性組胺素的1000 倍. 需指出, 該策略在固相合成中常常會(huì)有二酮哌嗪副反應(yīng), 且環(huán)化反應(yīng)不能確保反應(yīng)中心的手性保持.
1.2 C 端磺酰胺固定樹脂
在 Fmoc 法固相多肽合成中, 多肽 C 端羧基不能直接采用活化酯或活化酰胺的形式來(lái)固定樹脂. 這是因?yàn)镕moc 多肽固相合成操作過(guò)程需要使用強(qiáng)堿性親核性試劑——哌啶. 在采用 C 端固定樹脂方式合成骨架環(huán)肽過(guò)程中, 多肽 C 端連接臂必需對(duì)哌啶穩(wěn)定, 且在線性肽固相拼接后可被高效轉(zhuǎn)化為活化氧酯或活化酰胺, 以實(shí)現(xiàn)與 N 端自由氨基發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng). 磺酰胺結(jié)構(gòu)滿足該要求, 可以用于 C 端錨定樹脂固相合成骨架環(huán)肽. 磺酰胺對(duì)哌啶試劑非常穩(wěn)定, 而經(jīng)過(guò)烷基化后能轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨０? 可以與裸露自由氨基發(fā)生高效的胺解反應(yīng). 具體操作如圖 2 所示. 首先在完成多肽固相拼接后將 N 端氨基保護(hù)基Fmoc轉(zhuǎn)化為對(duì)酸敏感的Trt保護(hù)基, 接下來(lái)分別用碘化乙腈處理磺酰胺樹脂和弱酸解除 N 端 Trt 保護(hù)基以及用有機(jī)堿催化首尾固相環(huán)合反應(yīng), 最后利用強(qiáng)酸 TFA 解除側(cè)鏈保護(hù)基得到天然結(jié)構(gòu)的骨架環(huán)肽. 1999年, Morriello 等[22]在 Merck 公司首次利用 Kenner’s 磺酰胺樹脂成功合成了骨架環(huán)肽和環(huán)羧酚酸肽. 2005 年, Ganesan 等[23]采用該法合成了海洋天然產(chǎn)物骨架環(huán)肽kahalalide A 及類似物, 并系統(tǒng)研究了該天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系. 此外, 磺酰胺樹脂還用于多粘菌素[24]、鏈陽(yáng)霉素等[25,26]環(huán)肽的化學(xué)合成.
1.3 C 端芳基酰基肼固定樹脂
芳基�；驴梢酝ㄟ^(guò)脫氫氧化轉(zhuǎn)化為活化酰胺, 氨基可以與活化酰胺發(fā)生成酰胺鍵反應(yīng). 氧化過(guò)程對(duì)多數(shù)氨基酸不造成副反應(yīng), 因而原理上可用于多肽的 C 端固相活化制備骨架環(huán)肽. 該反應(yīng)早在 1970 年被 Birr 等[27]發(fā)現(xiàn), 但是長(zhǎng)期以來(lái)并沒(méi)有被多肽研究者所關(guān)注. 直到1997 年, Langner 等[28]首次利用 C 端芳基酰基肼合成了骨架環(huán)七肽, 并證明該方法制備骨架環(huán)肽的效率比傳統(tǒng)液相縮合高. 2001 年, Waldmann 等[29]利用該法也成功制備了骨架環(huán)六肽, stylostatin, 如圖 3 所示. 此外, Janda 等[30]并將該方法用于多種骨架環(huán)肽分子的構(gòu)建. 值得一提, 2004 年, Camareo 等[31]利用芳基肼氧化活化反應(yīng)發(fā)展了 Fmoc 硫酯的合成方法. 通過(guò)結(jié)合自然化學(xué)連接反應(yīng), Camareo 等[32]最近實(shí)現(xiàn)了防御素的化學(xué)合成. C 端芳基�；禄罨h(huán)合以商業(yè)化的苯肼樹脂為載體進(jìn)行固相合成, 完成多肽拼接后, 利用 NBS 獲銅試劑氧化芳基�；聦�(shí)現(xiàn) N 端氨基與 C 端的固相環(huán)化反應(yīng). 需注意, 該方法對(duì)位阻比較敏感, 適合于反應(yīng)位點(diǎn)位阻比較低的氨基酸的環(huán)化, 且氧化條件可能造成 Met 和 Trp 側(cè)鏈的氧化副反應(yīng)發(fā)生.
2 液相環(huán)化策略
固相環(huán)化策略不適合鏈比較長(zhǎng)的骨架環(huán)肽合成. 這是由于隨著肽鏈的增長(zhǎng), 固相反應(yīng)的效率會(huì)顯著降低. 因此, 對(duì)于長(zhǎng)鏈的骨架環(huán)肽高效的合成方法仍為液相縮合. 傳統(tǒng)的液相縮合是以側(cè)鏈全保護(hù)的線性肽為原料, 通過(guò)縮合反應(yīng)而完成多肽的頭尾環(huán)合. 側(cè)鏈全保護(hù)肽的溶解性受序列和鏈長(zhǎng)度影響大, 因此縮合前需對(duì)有機(jī)溶劑進(jìn)行優(yōu)化[16,17]. 為降低分子間縮合副反應(yīng), 液相縮合的濃度一般要求嚴(yán)格控制. 而且, 傳統(tǒng)縮合反應(yīng)位點(diǎn)立體保持性差, 一般適用于 C 端為 Gly 和 Pro 的骨架環(huán)合反應(yīng)[33]. 隨著肽鏈對(duì)接技術(shù)的發(fā)展, 化學(xué)選擇性反應(yīng)成為骨架環(huán)肽合成的新興方法. 相比傳統(tǒng)縮合反應(yīng), 化學(xué)選擇性反應(yīng)立體保持性高, 反應(yīng)條件更為溫和和高效, 因而成為該方面近期研究的主流.
2.1 構(gòu)象鎖定結(jié)構(gòu)輔助骨架環(huán)化反應(yīng)
線性多肽在溶液中一般沒(méi)有結(jié)構(gòu), 導(dǎo)致其 C 端和 N端碰撞的幾率不高, 因而分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)速率相對(duì)較慢. 為了提高分子內(nèi)骨架環(huán)化反應(yīng)的效率, 研究者可以將線性多肽的構(gòu)象限制于環(huán)化易發(fā)生的構(gòu)象. 限制線性多肽構(gòu)象的方法一般有兩種, 即內(nèi)部引入可改造多肽結(jié)構(gòu)的保護(hù)基或外加可促進(jìn)特定構(gòu)象形成的金屬離子.
贗脯氨酸結(jié)構(gòu)單元引入多肽序列可達(dá)到限制線性多肽構(gòu)象促進(jìn)分子內(nèi)頭尾環(huán)化反應(yīng)的效果. 丙叉保護(hù)的Ser, Thr 或 Cys 是常見的三種贗脯氨酸, 且均可通過(guò)酸性條件脫去保護(hù)基得到天然結(jié)構(gòu)的氨基酸. 1999 年, Mutter 等[34]將贗脯氨酸作為 Thr 的前體成功實(shí)現(xiàn)了骨架環(huán)三肽的合成, 并證明環(huán)化底物線性多肽的濃度可高達(dá)0.1 mol/L. 2004 年, Turner 等[35]引入 3 對(duì)丙叉保護(hù) Thr輔助分子內(nèi)環(huán)化, 實(shí)現(xiàn)骨架環(huán)六肽[(Val-Thr)3]的合成, 如圖 4 所示. 2010 年, Jolliffe 等[36]報(bào)道了該方法在骨架環(huán)四肽合成方面的應(yīng)用.
金屬離子通過(guò)與多肽序列中的基團(tuán)配位作用可以促進(jìn)線性多肽頭尾空間接近從而利于分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)的發(fā)生. 2003 年, Ye 等[37]發(fā)現(xiàn) Na＋可以與多肽中 5 個(gè)鄰近的羰基發(fā)生絡(luò)合促進(jìn)骨架環(huán)五肽的合成, 如圖4所示. 該研究組[38]在 2005 年發(fā)現(xiàn) Cs＋也能通過(guò)類似的機(jī)制促進(jìn)骨架環(huán)七肽的合成.
2.2 Sanger 試劑、Mukaiyama 試劑或者 N 端缺電子
基團(tuán)取代的磺胺試劑活化 C 端巰基酸肽環(huán)化反應(yīng)C 端巰基酸肽可以與 Sanger 試劑、Mukaiyama 試劑或者 N 端缺電子基團(tuán)取代的磺胺試劑反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚暂^高的 C 端芳基硫酯肽. N 端自由的氨基可以與芳基硫酯肽發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)生成骨架環(huán)肽. 2010 年, Crich等[39～41]采用 Sanger 試劑活化 C 端巰基酸肽成功合成了骨架環(huán)五肽和骨架環(huán)六肽, 如圖 5 所示. 側(cè)鏈官能團(tuán)因影響該反應(yīng)過(guò)程一般采用酸敏感基團(tuán)進(jìn)行保護(hù), 在環(huán)化反應(yīng)完成后, 保護(hù)基可以在酸性下解保護(hù)得到天然結(jié)構(gòu)的骨架環(huán)肽.
2.3 金屬離子或有機(jī)堿催化硫酯肽骨架環(huán)化反應(yīng)
早在上個(gè)世紀(jì) 80 年代, 日本科學(xué)家 Aimoto 等[42]發(fā)現(xiàn), 在金屬離子 Ag＋的催化下, 多肽硫酯可以與多肽的氨基發(fā)生高效的連接反應(yīng). 親硫性金屬離子 Ag＋通過(guò)與C 端硫酯配位加強(qiáng)了硫酯的離去性, 從而促進(jìn)自由氨基與其發(fā)生胺解反應(yīng).
1999 年, Tam 等[43]采用 Ag＋催化多肽 N 端氨基與 C端硫酯的分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng) , 完成了骨架環(huán)七肽[AIa-Lys-Tyr-GIy-GIy-Phe-Leu]的化學(xué)合成. 有趣的是, Tam 研究表明, 通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的酸度, Ag＋催化硫酯可選擇性與 N 端氨基、Lys 側(cè)鏈氨基或 Tyr 側(cè)鏈酚羥基發(fā)生反應(yīng), 如圖 6 所示. 在 pH 4.0 的溶液中, Lys 側(cè)鏈氨基和 N 端氨基均被質(zhì)子化而失去反應(yīng)活性, Tyr 側(cè)鏈酚羥基優(yōu)先與 C 端硫酯發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化生成大環(huán)內(nèi)酯肽; 在pH 5.0～6.0 時(shí), N 端氨基和 C 端硫酯優(yōu)先發(fā)生環(huán)化反應(yīng), 生成傳統(tǒng)的骨架環(huán)多肽; 在 pH＞6 時(shí), Lys 側(cè)鏈氨基活性最高, 最利于發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)生側(cè)鏈環(huán)肽結(jié)構(gòu). 需指出, Ag＋催化硫酯的過(guò)程并不總能保持反應(yīng)位點(diǎn)手性中心的構(gòu)型, 尤其對(duì)于反應(yīng)速率較為緩慢的環(huán)化過(guò)程.
在咪唑的催化下, 硫酯也能被活化而與氨基發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng). 2009 年, Houghten 等[44]利用含有咪唑的乙腈溶液(MeCN∶1.5 mol/L 咪唑)成功合成了骨架環(huán)五肽. 最近, Houghten 等[45]又發(fā)現(xiàn), 在咪唑催化下絲氨酸側(cè)鏈羥基也能與硫酯發(fā)生分子內(nèi)酯化反應(yīng), 可用于化學(xué)合成天然產(chǎn)物大環(huán)內(nèi)酯肽.
2.4 無(wú)痕施陶丁格骨架環(huán)化反應(yīng)
2000 年, Raines[46]和 Bertozzi 等[47]相繼發(fā)展出無(wú)痕施陶丁格連接反應(yīng). 該反應(yīng)是施陶丁格反應(yīng)的改進(jìn). 具體機(jī)制為, 首先含有機(jī)磷和硫酯修飾的多肽會(huì)與疊氮修飾另一分子多肽反應(yīng)生成多肽磷葉立德中間產(chǎn)物, 接下來(lái)葉立德中的親核性胺通過(guò)分子內(nèi)N到S遷移形成酰胺鍵, 最后磷基和巰基修飾基團(tuán)在水中發(fā)生水解反應(yīng)而離去完成多肽片段的無(wú)痕連接.
2008 年, Hackenberger 等[48]將無(wú)痕施陶丁格連接反應(yīng)用于分子內(nèi)反應(yīng), 完成了三種骨架環(huán)十一肽的化學(xué)合成. 該研究表明無(wú)痕施陶丁格環(huán)化反應(yīng)既可用于側(cè)鏈保護(hù)肽的頭尾環(huán)化又可用于側(cè)鏈不保護(hù)多肽的頭尾選擇性環(huán)化. 側(cè)鏈保護(hù)肽的頭尾環(huán)化是采用硼試劑保護(hù)有機(jī)磷, 用 DABCO (1,4-二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷)選擇性解除硼基保護(hù)基, 釋放 C 端磷基修飾硫酯肽用于分子內(nèi)環(huán)化, 如圖 7 所示. 酸性條件解除側(cè)鏈所有保護(hù)基得到的C端為磷修飾硫酯和N端為疊氮修飾肽可直接經(jīng)過(guò)分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)生天然骨架環(huán)肽. 需指出, 無(wú)痕施陶丁格環(huán)化連接存在幾個(gè)缺點(diǎn). 例如, 反應(yīng)底物磷試劑易于被氧氣氧化; 反應(yīng)中需加有機(jī)溶劑以抑制水解副反應(yīng); 環(huán)化反應(yīng)位點(diǎn)一般為位阻較低的 Gly.
2.5 醛基氧酯與 Ser/Thr 骨架環(huán)化反應(yīng)
早在 1994 年, Tam 等[49]發(fā)現(xiàn) C 端為 β-羥基乙醛修飾的氧酯肽可以選擇性與 N 端 Ser, Thr 或 Cys 發(fā)生化學(xué)選擇性成酰胺鍵連接反應(yīng). 為解決 Tam 方法中反應(yīng)轉(zhuǎn)化速率低和修飾基團(tuán)不易解除的缺點(diǎn), 2010 年, Li 等[50]將鄰羥基苯甲醛替代 β-羥基乙醛, 發(fā)展出新一代以 Ser和 Thr 為連接位點(diǎn)的化學(xué)選擇性連接反應(yīng), 如圖 8 所示. 相比而言, 該反應(yīng)效率顯著提高, 并可用于 C 端為高位阻的 Val 的連接. 因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)中的輔助基團(tuán)可以在 TFA 中高效去除, 所以該反應(yīng)得到的產(chǎn)物為天然結(jié)構(gòu)的骨架環(huán)多肽. 2013 年, Li 等[51,52]采用該方法分別完成了大環(huán)內(nèi)酯肽-達(dá)托霉素和骨架環(huán)四肽的合成. 然而, 該反應(yīng)中所需 C 端氧酯肽的合成操作相對(duì)較為復(fù)雜, 且反應(yīng)需在吡啶乙酸的混合溶劑中進(jìn)行[51].
2.6 酮酸-羥胺環(huán)化反應(yīng)
2006年, Bode等[53]發(fā)現(xiàn)C端酮酸修飾多肽可以與N端羥胺化修飾的多肽發(fā)生高效選擇性成酰胺鍵反應(yīng). 該反應(yīng)的基本原理是羥胺與酮酸通過(guò)分子內(nèi)脫羧和脫水反應(yīng)形成天然酰胺鍵. 2012 年, Bode 等[54]運(yùn)用分子內(nèi)的酮酸-羥胺反應(yīng)成功完成了環(huán) 10 肽-短桿菌肽的化學(xué)合 成, 如圖 9. 需指出, 該反應(yīng)一般要求在還有 DMF 的有機(jī)溶劑中進(jìn)行, 且反應(yīng)溫度在 40 ℃左右時(shí)反應(yīng)速率較為高效。
3 自然化學(xué)連接策略
1994 年, Kent 等[55～61]發(fā)展的自然化學(xué)連接反應(yīng)是應(yīng)用最為廣泛的蛋白質(zhì)的化學(xué)合成方法. 即在 pH 為 7和硫醇存在下, 一分子 C端為硫酯的肽鏈與另一條N 端為半胱氨酸的肽可以發(fā)生高效的成酰胺鍵連接反應(yīng). 自然化學(xué)連接反應(yīng)經(jīng)過(guò)化學(xué)選擇性捕獲和分子內(nèi)重排兩個(gè)步驟而完成. 首先, 兩分子的 C 端硫酯和 N 端 Cys 側(cè)鏈巰基之間發(fā)生可逆的硫醇-硫酯交換生成一分子的硫酯中間體, 其次, 通過(guò)分子內(nèi)不可逆的 S—N �；w移, 生成天然肽鍵. 自然化學(xué)連接反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)是: 高效、高選擇性、側(cè)鏈完全無(wú)需保護(hù). 骨架環(huán)肽可以通過(guò)分子內(nèi)的自然化學(xué)連接反應(yīng)制備, 即一條同時(shí)含有 C 端硫酯和N 端 Cys 的線性肽可以通過(guò)分子內(nèi)的成酰胺鍵反應(yīng)實(shí)現(xiàn)頭尾連接, 如圖 10 所示. 1997 年, Tam 等[62]首次用分子內(nèi)自然化學(xué)連接反應(yīng)合成了植物環(huán)多肽 Cyclotide. 隨后, 許多研究者均采用自然化學(xué)連接反應(yīng)完成了骨架環(huán)肽的合成. 原則上, 自然化學(xué)連接環(huán)合策略屬于液相環(huán)化反應(yīng)的一種. 基于該方面的研究較多, 我們對(duì)其專門的介紹.
3.1 分子內(nèi)巰基拉鏈?zhǔn)阶匀换瘜W(xué)骨架環(huán)化反應(yīng)
分子內(nèi)巰基拉鏈骨架環(huán)化反應(yīng)是指富含半胱氨酸的肽通過(guò)分子內(nèi)巰基-硫酯交換反應(yīng), 促進(jìn)多肽 C 端硫酯與 N 端 Cys 空間接近而完成分子內(nèi)自然化學(xué)連接反應(yīng), 如圖 11. 這種反應(yīng)方法需要 3 種重要官能團(tuán): N 端Cys、C 端硫酯和內(nèi)部自由巰基. 首先, 離 C 端硫酯近的半胱氨酸側(cè)鏈親核性進(jìn)攻硫酯, 即硫醇-硫酯交換形成分子內(nèi)硫酯; 其次, 通過(guò)分子內(nèi)可逆的轉(zhuǎn)硫酯化過(guò)程, 形成更大的分子內(nèi)硫酯, 使得 C 端和 N 端進(jìn)一步接近; 最終, 通過(guò)不可逆的 S—N �；D(zhuǎn)移反應(yīng)形成內(nèi)酰胺. 1999 年, Tam 等[63]首次提出了分子內(nèi)巰基拉鏈環(huán)化反應(yīng)機(jī)理, 并指出拉鏈環(huán)化反應(yīng)是熵驅(qū)動(dòng)的過(guò)程, 即通過(guò)小的離散中間產(chǎn)物使得反應(yīng)比相應(yīng)的一步環(huán)合反應(yīng)更高效. 盡管研究證明分子內(nèi)部自由硫醇可以加快分子內(nèi)的自然化學(xué)反應(yīng)速率, 但是并不能確定轉(zhuǎn)硫酯化一定沿著鏈相繼地發(fā)生, 同時(shí)也不能確定所有的自由硫醇都參與催化過(guò)程[64].
3.2 C 端巰基修飾芳基氧酯肽參與自然化學(xué)骨架環(huán)化反應(yīng)
2004年, Danishefsky等[65]發(fā)現(xiàn)C端含有鄰巰基修飾的芳基氧酯肽可以通過(guò)O到S分子內(nèi)酰基遷移原位生成硫酯肽, 實(shí)現(xiàn)與 N 端 Cys 肽的化學(xué)選擇性連接反應(yīng). 利用芳基氧酯肽作為硫酯肽的前體和分子內(nèi)自然化學(xué)連接反應(yīng), Danishefsky 等[66]于 2006 年實(shí)現(xiàn)了含有單糖修飾的骨架環(huán)六肽的化學(xué)合成, 如圖 12 所示.
3.3 C 端巰基修飾烷基氧酯肽參與自然化學(xué)骨架環(huán)化反應(yīng)
硫酯鍵對(duì)堿和親核試劑非常不穩(wěn)定, 易于和哌啶發(fā)生反應(yīng), 因而, 不能直接采用Fmoc法固相合成, 而只能采用 Boc 法進(jìn)行制備. 傳統(tǒng)的 Boc-SPPS 制備硫酯中需要使用極為危險(xiǎn)的 HF, 且?guī)в卸喾N翻譯后修飾肽的對(duì)HF 均不穩(wěn)定, 如糖修飾和磷酸化修飾等. 為解決這一問(wèn)題, 近年來(lái)要發(fā)展了多種有效的 Fmoc-SPPS 合成多肽硫酯的方法. O—S 遷移硫酯制備法是 Fmoc 法制備硫酯肽的一種重要方法. 該方法利用烷基氧酯作為硫酯的前體, 通過(guò)分子內(nèi) O—S 遷移原位形成硫酯用于自然化學(xué)連接反應(yīng)[67～69]. 2012 年, Liu 等[70]采用氧酯肽, 通過(guò)分子內(nèi)的自然化學(xué)連接反應(yīng)完成了植物骨架環(huán)多肽 KB1的合成, 如圖 13 所示. 氧酯與 Fmoc 固相合成兼容, 因而制備起來(lái)比硫酯更為方便. 然而需注意, O—S 遷移僅僅適用于位阻較小的氨基酸, 對(duì)于高位阻的環(huán)化反應(yīng), 存在水解副反應(yīng).
3.4 C 端巰基修飾酰胺肽參與的自然化學(xué)骨架環(huán)化反應(yīng)
與氧酯肽類似, 研究者發(fā)現(xiàn)多種 C 端含巰基修飾的酰胺肽也可作為硫酯肽的前體. 2011 年, Macmillan 等[71]以 C 端為二肽 Gly-Cys、N 端為 Cys 的天然線性多肽為底物, 利用二肽 Gly-Cys 的分子內(nèi)的 N-S 遷移硫酯化機(jī)制, 完成了多種抗菌骨架環(huán)多肽的合成. 2013 年, Tam等[72]以 C 端為 N-巰乙基-N-烷基化酰胺多肽為底物, 利用N-烷基化酰胺易于發(fā)生分子內(nèi)的N-S遷移的特征, 完成了植物骨架環(huán)多肽 Kalata B1 的合成. 與氧酯相似, C端酰胺肽對(duì)于位阻較高的環(huán)化反應(yīng)較差.
3.5 C 端酰肼肽參與的自然化學(xué)骨架環(huán)化反應(yīng)
雖然國(guó)際上有很多課題組發(fā)展了一系列有效的Fmoc-SPPS 間接合成多肽硫酯的方法, 但是均存在問(wèn)題, 如需要預(yù)制結(jié)構(gòu)復(fù)雜的連接臂、成硫酯反應(yīng)受位阻影響大和底物反應(yīng)活性不宜控制等. 2011 年, Liu 等[73～78]以酰肼多肽作為底物, 發(fā)展出酰肼連接技術(shù), 解決了前人方法的問(wèn)題, 成為多肽及蛋白合成方面的一個(gè)重要成果.
酰肼連接技術(shù)的基本原理是, 在弱酸條件下, 多肽酰肼在亞硝酸的氧化下轉(zhuǎn)化為�；B氮, 隨后與硫醇反應(yīng)原位生成肽硫酯并直接與N端Cys肽自然化學(xué)選擇性連接反應(yīng). 本質(zhì)上來(lái)說(shuō), 這種連接方法是酰肼和硫酯原位轉(zhuǎn)變, 是一種改進(jìn)的自然化學(xué)連接反應(yīng). 多肽酰肼也可以通過(guò)生物表達(dá)進(jìn)行制備. 2012 年, Liu等[79]采用非天然氧酯氨基酸嵌入技術(shù)成功表達(dá)出多肽酰肼, 發(fā)展了表達(dá)蛋白酰肼連接技術(shù). 同年, Liu 課題組[80]運(yùn)用分子內(nèi)酰肼連接反應(yīng), 成功制備了系列大小的骨架環(huán)多肽, 如圖 14 所示. 值得注意, Liu 等[81]證明分子內(nèi)酰肼反應(yīng)可以用于高效制備張力較大的骨架環(huán)四肽. 相比前人方法, 多肽酰肼具有合成難度低、成本低廉、自動(dòng)化簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì). 此外, 酰肼連接技術(shù)的連接效率不受位阻影響, 對(duì)于絕大多數(shù)位點(diǎn)的連接均適用.
4 前景和展望
20 世紀(jì) 40 年代, 高斯等發(fā)現(xiàn)著名的治療傷口感染的短桿菌肽, 讓研究者開始關(guān)注骨架環(huán)多肽研究. 在過(guò)去的將近七十年里, 科學(xué)家在細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)骨架環(huán)肽, 并有少數(shù)骨架環(huán)肽已成為治療人類疾病的藥物分子. 最近, 研究者發(fā)展出功能藥物多肽“嫁接”Cyclotide 技術(shù), 為骨架環(huán)肽藥物研發(fā)提供了一條強(qiáng)有力的工具. 2012 年, Tam 等[82]將舒緩激肽 B1 受體拮抗肽嫁接到 Cyclotide 骨架內(nèi), 開發(fā)出治療疼痛的可口服的多肽藥物分子. 2013 年, Camareo 等[83]運(yùn)用生物方法將生物活性短肽PMI嫁接到Cyclotide, 并在小鼠體內(nèi)確認(rèn)該環(huán)肽能夠通過(guò)激活 P53 蛋白來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng). 在這幾十年里, 化學(xué)研究者也發(fā)展了多種骨架環(huán)肽合成的方法. 從固相環(huán)化反應(yīng)到液相環(huán)化反應(yīng), 從傳統(tǒng)縮合劑縮合反應(yīng)到近期發(fā)展的化學(xué)選擇性連接反應(yīng), 化學(xué)方法已經(jīng)逐漸成為制備骨架環(huán)肽的重要手段. 隨著骨架環(huán)肽合成技術(shù)的成熟和其結(jié)構(gòu)與功能方面的深入研究, 我們相信將有更多的骨架環(huán)肽藥物分子被人們發(fā)現(xiàn).
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