摘要：骨架環(huán)肽是線性肽的C端和N端通過酰胺鍵進行首尾環(huán)合而形成的環(huán)狀分子. 研究者從細菌、真菌、植物和動物中發(fā)現(xiàn)了大量的骨架環(huán)肽. 這種首尾環(huán)合的結構，使得骨架環(huán)肽具有很好的酶穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性，部分骨架環(huán)肽具有細胞膜通透性. 骨架環(huán)肽分子異常的穩(wěn)定性和高效的生物活性，使得其成為目前藥物領域的研究熱點. 為了更深入地研究它們的結構和功能，骨架環(huán)肽的制備成為一個重要問題. 概述了化學合成骨架環(huán)肽的一些方法，包括：（1）固相環(huán)合策略；（2）液相環(huán)合策略；（3）分子內自然化學連接策略，并對這些方法的特點和效率進行了討論比較.
骨架環(huán)肽(Backbone cyclized peptides)是線性多肽的頭尾通過酰胺鍵相連而形成的環(huán)狀分子. 與線性多肽相比, 骨架環(huán)肽具有較為剛性的環(huán)骨架結構特征, 因而對蛋白水解酶穩(wěn)定性顯著提高, 甚至部分骨架環(huán)肽具有獨特的細胞膜通透性. 正是這一原因, 骨架環(huán)肽成為當今國際藥物領域的重要研究對象[1～7]. 早在第二次世界大戰(zhàn)期間, 蘇聯(lián)科學家高斯就發(fā)現(xiàn)由 10 個氨基酸組成頭尾環(huán)合而成的短桿菌肽具有抑制細菌生長的功能[8]. 它是二戰(zhàn)期間治療傷病人傷口感染的主要藥物, 挽救了無數(shù)人的生命. 短桿菌肽的發(fā)現(xiàn)成為環(huán)肽研究的重要歷性事件. 隨后, 研究者在細菌、真菌、植物和動物中均發(fā)現(xiàn)環(huán)肽, 其中許多不乏藥物功能. 例如, 由 11 個氨基酸組成的環(huán)孢素可用于器官移植中防止免疫反應; 含有多個環(huán)狀結構的乳酸鏈球菌肽可用于防止食品腐敗; 多粘素可用于治療腸胃疾病等[9].
骨架環(huán)肽的天然功能是宿主防御作用, 即通過抑制外來生物的生長來保護本物種的生存和延續(xù). 通過活性實驗, 研究者發(fā)現(xiàn)骨架環(huán)肽還具有一些獨特生物功能,可用于治療人類疾病. 如存在于植物中的環(huán)多肽(Cyclotide)具有助子宮收縮活性、抗菌性、抗 HIV 活性以及抗腫瘤活性[10]. 然而, 從生物中得到的骨架環(huán)肽可能對人體產生生物毒性, 因此多數(shù)不能直接用于臨床試驗 , 而需要對其結構進行改造 . 例 如 , 為了降低Cyclotide 的生物毒性, 研究者需要對其個別位點進行突變或者通過“嫁接”的方式將具有生物活性的外源功能肽融合于 Cyclotide 中[11].
骨架環(huán)肽可以通過 3 種途徑獲得: 從生物體中分離、基因重組技術和化學從頭合成. 從生物體內純化骨架環(huán)肽的方法存在分離難度大、效率低和工作量大的缺點. 由于骨架環(huán)肽存在特殊的頭尾環(huán)合的酰胺鍵結構, 傳統(tǒng)基因重組表達技術也不能直接用于骨架環(huán)肽的制備, 需要對菌種進行再改造, 因而該方法技術難度相對較高. 骨架環(huán)肽對菌種的毒性也會常常導致基因重組表達失敗. 此外, 生物表達含有非天然修飾的骨架環(huán)肽的能力十分有限. 相比前兩種方法, 化學從頭合成骨架環(huán)肽具有優(yōu)勢, 如可以任意改變氨基酸的序列, 可以實現(xiàn)位點的任意突變, 以及可以任意非天然氨基酸的嵌入等.
從環(huán)化反應的特點來看, 骨架環(huán)肽的化學合成經歷了二個階段. 早期骨架環(huán)肽的合成是以側鏈官能團全保護的線性肽為底物, 頭尾通過縮合試劑而環(huán)化. 該方法存在許多缺點. 例如, 需要預制部分或全部保護的線性多肽; 反應位點手性中心不能保持和容易發(fā)生多聚化副反應. 上世紀末本世紀初, 研究者發(fā)展出化學選擇性連接環(huán)化反應制備骨架環(huán)肽的方法, 成功解決了傳統(tǒng)縮合法的缺陷. 雖然歷史上有不少關于環(huán)肽方面的綜 述[12～17], 但是多數(shù)是籠統(tǒng)介紹骨架環(huán)肽、側鏈環(huán)肽和環(huán)肽類似物的進展, 專門介紹骨架環(huán)肽的合成的綜述文章仍很少. 基于國際上最近涌現(xiàn)許多課題組利用新型的多肽連接反應制備骨架環(huán)肽, 我們將著重從化學合成角度綜述骨架環(huán)肽的最新進展.
1 固相環(huán)化策略
固相環(huán)化指多肽頭尾成酰胺鍵反應在樹脂上完成. 該策略有兩個明顯的優(yōu)點, 如降低分子間碰撞幾率, 減少分子間多聚化副反應; 減少合成中的分離和純化的次數(shù). 一般來說, 多肽可采用兩種方式固定于樹脂上, 即利用側鏈官能基團錨定樹脂和利用 C 端羧基固定于樹脂. 前者在固相上完成多肽序列的拼接后, 脫去 N 端和C 端保護基游離出自由氨基和羧基, 再在固相上完成 C端羧基和N 端氨基的縮合環(huán)化. 后者則利用主鏈 C端羧基錨定樹脂, 在多肽序列拼接完成后, 活化多肽的 C 端, 并隨之與N 端自由氨基發(fā)生分子內胺解環(huán)合反應. 第二種方法環(huán)化和多肽的固相切割是同時進行的, 且不需要側鏈固定, 因而比第一種方法更具優(yōu)勢. 需要指出, 固相環(huán)化反應不能保證反應位點的構型完全保持, 對于易消旋的氨基酸具有潛在的危險.
1.1 側鏈固定樹脂
利用氨基酸側鏈官能團固定樹脂, 線性多肽 N 端氨基和 C 端羧基通過縮合反應生成環(huán)肽是固相合成骨架環(huán)肽的常用方法. 該方法需要正交的保護基用于保護多肽側鏈功能團、N 端氨基和 C 端羧基. 側鏈功能團一般采用對酸敏感的保護基; N 端氨基可采用 Fmoc; C 端羧基常用對 Pd 敏感的烯丙酯結構. 具體的操作如圖 1 所示. 首先, 第一個氨基酸利用側鏈官能團和樹脂上官能團反應固定于樹脂; 該氨基酸的α-氨基以Fmoc保護, C-端羧基采用烯丙酯保護. 接下來, 按照傳統(tǒng) Fmoc 固相合成完成目標序列的拼接后, 分別用 Pd(PPh3)4、哌啶試劑解除 C 端烯丙酯和 N 端 Fmoc 保護基. 最后, 線性多肽首尾通過縮合反應實現(xiàn)環(huán)化, 并在 TFA 作用下與樹脂分離, 最終得到天然結構的環(huán)肽. 常用側鏈固定樹脂的氨基酸為 Asp, Glu[18], His[19]或者 Lys[20]. 2011 年, Veerman 等[21]利用 Glu 側鏈錨定樹脂, 合成出環(huán)狀人體唾液中的組胺素, 并證明其活性是天然線性組胺素的1000 倍. 需指出, 該策略在固相合成中常常會有二酮哌嗪副反應, 且環(huán)化反應不能確保反應中心的手性保持.
1.2 C 端磺酰胺固定樹脂
在 Fmoc 法固相多肽合成中, 多肽 C 端羧基不能直接采用活化酯或活化酰胺的形式來固定樹脂. 這是因為Fmoc 多肽固相合成操作過程需要使用強堿性親核性試劑——哌啶. 在采用 C 端固定樹脂方式合成骨架環(huán)肽過程中, 多肽 C 端連接臂必需對哌啶穩(wěn)定, 且在線性肽固相拼接后可被高效轉化為活化氧酯或活化酰胺, 以實現(xiàn)與 N 端自由氨基發(fā)生分子內環(huán)化反應. 磺酰胺結構滿足該要求, 可以用于 C 端錨定樹脂固相合成骨架環(huán)肽. 磺酰胺對哌啶試劑非常穩(wěn)定, 而經過烷基化后能轉變?yōu)榛罨０? 可以與裸露自由氨基發(fā)生高效的胺解反應. 具體操作如圖 2 所示. 首先在完成多肽固相拼接后將 N 端氨基保護基Fmoc轉化為對酸敏感的Trt保護基, 接下來分別用碘化乙腈處理磺酰胺樹脂和弱酸解除 N 端 Trt 保護基以及用有機堿催化首尾固相環(huán)合反應, 最后利用強酸 TFA 解除側鏈保護基得到天然結構的骨架環(huán)肽. 1999年, Morriello 等[22]在 Merck 公司首次利用 Kenner’s 磺酰胺樹脂成功合成了骨架環(huán)肽和環(huán)羧酚酸肽. 2005 年, Ganesan 等[23]采用該法合成了海洋天然產物骨架環(huán)肽kahalalide A 及類似物, 并系統(tǒng)研究了該天然產物的結構功能關系. 此外, 磺酰胺樹脂還用于多粘菌素[24]、鏈陽霉素等[25,26]環(huán)肽的化學合成.
1.3 C 端芳基�；鹿潭渲�
芳基�；驴梢酝ㄟ^脫氫氧化轉化為活化酰胺, 氨基可以與活化酰胺發(fā)生成酰胺鍵反應. 氧化過程對多數(shù)氨基酸不造成副反應, 因而原理上可用于多肽的 C 端固相活化制備骨架環(huán)肽. 該反應早在 1970 年被 Birr 等[27]發(fā)現(xiàn), 但是長期以來并沒有被多肽研究者所關注. 直到1997 年, Langner 等[28]首次利用 C 端芳基酰基肼合成了骨架環(huán)七肽, 并證明該方法制備骨架環(huán)肽的效率比傳統(tǒng)液相縮合高. 2001 年, Waldmann 等[29]利用該法也成功制備了骨架環(huán)六肽, stylostatin, 如圖 3 所示. 此外, Janda 等[30]并將該方法用于多種骨架環(huán)肽分子的構建. 值得一提, 2004 年, Camareo 等[31]利用芳基肼氧化活化反應發(fā)展了 Fmoc 硫酯的合成方法. 通過結合自然化學連接反應, Camareo 等[32]最近實現(xiàn)了防御素的化學合成. C 端芳基�；禄罨h(huán)合以商業(yè)化的苯肼樹脂為載體進行固相合成, 完成多肽拼接后, 利用 NBS 獲銅試劑氧化芳基酰基肼實現(xiàn) N 端氨基與 C 端的固相環(huán)化反應. 需注意, 該方法對位阻比較敏感, 適合于反應位點位阻比較低的氨基酸的環(huán)化, 且氧化條件可能造成 Met 和 Trp 側鏈的氧化副反應發(fā)生.
2 液相環(huán)化策略
固相環(huán)化策略不適合鏈比較長的骨架環(huán)肽合成. 這是由于隨著肽鏈的增長, 固相反應的效率會顯著降低. 因此, 對于長鏈的骨架環(huán)肽高效的合成方法仍為液相縮合. 傳統(tǒng)的液相縮合是以側鏈全保護的線性肽為原料, 通過縮合反應而完成多肽的頭尾環(huán)合. 側鏈全保護肽的溶解性受序列和鏈長度影響大, 因此縮合前需對有機溶劑進行優(yōu)化[16,17]. 為降低分子間縮合副反應, 液相縮合的濃度一般要求嚴格控制. 而且, 傳統(tǒng)縮合反應位點立體保持性差, 一般適用于 C 端為 Gly 和 Pro 的骨架環(huán)合反應[33]. 隨著肽鏈對接技術的發(fā)展, 化學選擇性反應成為骨架環(huán)肽合成的新興方法. 相比傳統(tǒng)縮合反應, 化學選擇性反應立體保持性高, 反應條件更為溫和和高效, 因而成為該方面近期研究的主流.
2.1 構象鎖定結構輔助骨架環(huán)化反應
線性多肽在溶液中一般沒有結構, 導致其 C 端和 N端碰撞的幾率不高, 因而分子內環(huán)化反應速率相對較慢. 為了提高分子內骨架環(huán)化反應的效率, 研究者可以將線性多肽的構象限制于環(huán)化易發(fā)生的構象. 限制線性多肽構象的方法一般有兩種, 即內部引入可改造多肽結構的保護基或外加可促進特定構象形成的金屬離子.
贗脯氨酸結構單元引入多肽序列可達到限制線性多肽構象促進分子內頭尾環(huán)化反應的效果. 丙叉保護的Ser, Thr 或 Cys 是常見的三種贗脯氨酸, 且均可通過酸性條件脫去保護基得到天然結構的氨基酸. 1999 年, Mutter 等[34]將贗脯氨酸作為 Thr 的前體成功實現(xiàn)了骨架環(huán)三肽的合成, 并證明環(huán)化底物線性多肽的濃度可高達0.1 mol/L. 2004 年, Turner 等[35]引入 3 對丙叉保護 Thr輔助分子內環(huán)化, 實現(xiàn)骨架環(huán)六肽[(Val-Thr)3]的合成, 如圖 4 所示. 2010 年, Jolliffe 等[36]報道了該方法在骨架環(huán)四肽合成方面的應用.
金屬離子通過與多肽序列中的基團配位作用可以促進線性多肽頭尾空間接近從而利于分子內環(huán)化反應的發(fā)生. 2003 年, Ye 等[37]發(fā)現(xiàn) Na＋可以與多肽中 5 個鄰近的羰基發(fā)生絡合促進骨架環(huán)五肽的合成, 如圖4所示. 該研究組[38]在 2005 年發(fā)現(xiàn) Cs＋也能通過類似的機制促進骨架環(huán)七肽的合成.
2.2 Sanger 試劑、Mukaiyama 試劑或者 N 端缺電子
基團取代的磺胺試劑活化 C 端巰基酸肽環(huán)化反應C 端巰基酸肽可以與 Sanger 試劑、Mukaiyama 試劑或者 N 端缺電子基團取代的磺胺試劑反應轉變?yōu)榛钚暂^高的 C 端芳基硫酯肽. N 端自由的氨基可以與芳基硫酯肽發(fā)生分子內環(huán)化反應生成骨架環(huán)肽. 2010 年, Crich等[39～41]采用 Sanger 試劑活化 C 端巰基酸肽成功合成了骨架環(huán)五肽和骨架環(huán)六肽, 如圖 5 所示. 側鏈官能團因影響該反應過程一般采用酸敏感基團進行保護, 在環(huán)化反應完成后, 保護基可以在酸性下解保護得到天然結構的骨架環(huán)肽.
2.3 金屬離子或有機堿催化硫酯肽骨架環(huán)化反應
早在上個世紀 80 年代, 日本科學家 Aimoto 等[42]發(fā)現(xiàn), 在金屬離子 Ag＋的催化下, 多肽硫酯可以與多肽的氨基發(fā)生高效的連接反應. 親硫性金屬離子 Ag＋通過與C 端硫酯配位加強了硫酯的離去性, 從而促進自由氨基與其發(fā)生胺解反應.
1999 年, Tam 等[43]采用 Ag＋催化多肽 N 端氨基與 C端硫酯的分子內環(huán)化反應 , 完成了骨架環(huán)七肽[AIa-Lys-Tyr-GIy-GIy-Phe-Leu]的化學合成. 有趣的是, Tam 研究表明, 通過調節(jié)溶液的酸度, Ag＋催化硫酯可選擇性與 N 端氨基、Lys 側鏈氨基或 Tyr 側鏈酚羥基發(fā)生反應, 如圖 6 所示. 在 pH 4.0 的溶液中, Lys 側鏈氨基和 N 端氨基均被質子化而失去反應活性, Tyr 側鏈酚羥基優(yōu)先與 C 端硫酯發(fā)生分子內環(huán)化生成大環(huán)內酯肽; 在pH 5.0～6.0 時, N 端氨基和 C 端硫酯優(yōu)先發(fā)生環(huán)化反應, 生成傳統(tǒng)的骨架環(huán)多肽; 在 pH＞6 時, Lys 側鏈氨基活性最高, 最利于發(fā)生分子內環(huán)化反應產生側鏈環(huán)肽結構. 需指出, Ag＋催化硫酯的過程并不總能保持反應位點手性中心的構型, 尤其對于反應速率較為緩慢的環(huán)化過程.
在咪唑的催化下, 硫酯也能被活化而與氨基發(fā)生分子內環(huán)化反應. 2009 年, Houghten 等[44]利用含有咪唑的乙腈溶液(MeCN∶1.5 mol/L 咪唑)成功合成了骨架環(huán)五肽. 最近, Houghten 等[45]又發(fā)現(xiàn), 在咪唑催化下絲氨酸側鏈羥基也能與硫酯發(fā)生分子內酯化反應, 可用于化學合成天然產物大環(huán)內酯肽.
2.4 無痕施陶丁格骨架環(huán)化反應
2000 年, Raines[46]和 Bertozzi 等[47]相繼發(fā)展出無痕施陶丁格連接反應. 該反應是施陶丁格反應的改進. 具體機制為, 首先含有機磷和硫酯修飾的多肽會與疊氮修飾另一分子多肽反應生成多肽磷葉立德中間產物, 接下來葉立德中的親核性胺通過分子內N到S遷移形成酰胺鍵, 最后磷基和巰基修飾基團在水中發(fā)生水解反應而離去完成多肽片段的無痕連接.
2008 年, Hackenberger 等[48]將無痕施陶丁格連接反應用于分子內反應, 完成了三種骨架環(huán)十一肽的化學合成. 該研究表明無痕施陶丁格環(huán)化反應既可用于側鏈保護肽的頭尾環(huán)化又可用于側鏈不保護多肽的頭尾選擇性環(huán)化. 側鏈保護肽的頭尾環(huán)化是采用硼試劑保護有機磷, 用 DABCO (1,4-二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷)選擇性解除硼基保護基, 釋放 C 端磷基修飾硫酯肽用于分子內環(huán)化, 如圖 7 所示. 酸性條件解除側鏈所有保護基得到的C端為磷修飾硫酯和N端為疊氮修飾肽可直接經過分子內環(huán)化反應產生天然骨架環(huán)肽. 需指出, 無痕施陶丁格環(huán)化連接存在幾個缺點. 例如, 反應底物磷試劑易于被氧氣氧化; 反應中需加有機溶劑以抑制水解副反應; 環(huán)化反應位點一般為位阻較低的 Gly.
2.5 醛基氧酯與 Ser/Thr 骨架環(huán)化反應
早在 1994 年, Tam 等[49]發(fā)現(xiàn) C 端為 β-羥基乙醛修飾的氧酯肽可以選擇性與 N 端 Ser, Thr 或 Cys 發(fā)生化學選擇性成酰胺鍵連接反應. 為解決 Tam 方法中反應轉化速率低和修飾基團不易解除的缺點, 2010 年, Li 等[50]將鄰羥基苯甲醛替代 β-羥基乙醛, 發(fā)展出新一代以 Ser和 Thr 為連接位點的化學選擇性連接反應, 如圖 8 所示. 相比而言, 該反應效率顯著提高, 并可用于 C 端為高位阻的 Val 的連接. 因為結構中的輔助基團可以在 TFA 中高效去除, 所以該反應得到的產物為天然結構的骨架環(huán)多肽. 2013 年, Li 等[51,52]采用該方法分別完成了大環(huán)內酯肽-達托霉素和骨架環(huán)四肽的合成. 然而, 該反應中所需 C 端氧酯肽的合成操作相對較為復雜, 且反應需在吡啶乙酸的混合溶劑中進行[51].
2.6 酮酸-羥胺環(huán)化反應
2006年, Bode等[53]發(fā)現(xiàn)C端酮酸修飾多肽可以與N端羥胺化修飾的多肽發(fā)生高效選擇性成酰胺鍵反應. 該反應的基本原理是羥胺與酮酸通過分子內脫羧和脫水反應形成天然酰胺鍵. 2012 年, Bode 等[54]運用分子內的酮酸-羥胺反應成功完成了環(huán) 10 肽-短桿菌肽的化學合 成, 如圖 9. 需指出, 該反應一般要求在還有 DMF 的有機溶劑中進行, 且反應溫度在 40 ℃左右時反應速率較為高效。
3 自然化學連接策略
1994 年, Kent 等[55～61]發(fā)展的自然化學連接反應是應用最為廣泛的蛋白質的化學合成方法. 即在 pH 為 7和硫醇存在下, 一分子 C端為硫酯的肽鏈與另一條N 端為半胱氨酸的肽可以發(fā)生高效的成酰胺鍵連接反應. 自然化學連接反應經過化學選擇性捕獲和分子內重排兩個步驟而完成. 首先, 兩分子的 C 端硫酯和 N 端 Cys 側鏈巰基之間發(fā)生可逆的硫醇-硫酯交換生成一分子的硫酯中間體, 其次, 通過分子內不可逆的 S—N �；w移, 生成天然肽鍵. 自然化學連接反應的優(yōu)點是: 高效、高選擇性、側鏈完全無需保護. 骨架環(huán)肽可以通過分子內的自然化學連接反應制備, 即一條同時含有 C 端硫酯和N 端 Cys 的線性肽可以通過分子內的成酰胺鍵反應實現(xiàn)頭尾連接, 如圖 10 所示. 1997 年, Tam 等[62]首次用分子內自然化學連接反應合成了植物環(huán)多肽 Cyclotide. 隨后, 許多研究者均采用自然化學連接反應完成了骨架環(huán)肽的合成. 原則上, 自然化學連接環(huán)合策略屬于液相環(huán)化反應的一種. 基于該方面的研究較多, 我們對其專門的介紹.
3.1 分子內巰基拉鏈式自然化學骨架環(huán)化反應
分子內巰基拉鏈骨架環(huán)化反應是指富含半胱氨酸的肽通過分子內巰基-硫酯交換反應, 促進多肽 C 端硫酯與 N 端 Cys 空間接近而完成分子內自然化學連接反應, 如圖 11. 這種反應方法需要 3 種重要官能團: N 端Cys、C 端硫酯和內部自由巰基. 首先, 離 C 端硫酯近的半胱氨酸側鏈親核性進攻硫酯, 即硫醇-硫酯交換形成分子內硫酯; 其次, 通過分子內可逆的轉硫酯化過程, 形成更大的分子內硫酯, 使得 C 端和 N 端進一步接近; 最終, 通過不可逆的 S—N 酰基轉移反應形成內酰胺. 1999 年, Tam 等[63]首次提出了分子內巰基拉鏈環(huán)化反應機理, 并指出拉鏈環(huán)化反應是熵驅動的過程, 即通過小的離散中間產物使得反應比相應的一步環(huán)合反應更高效. 盡管研究證明分子內部自由硫醇可以加快分子內的自然化學反應速率, 但是并不能確定轉硫酯化一定沿著鏈相繼地發(fā)生, 同時也不能確定所有的自由硫醇都參與催化過程[64].
3.2 C 端巰基修飾芳基氧酯肽參與自然化學骨架環(huán)化反應
2004年, Danishefsky等[65]發(fā)現(xiàn)C端含有鄰巰基修飾的芳基氧酯肽可以通過O到S分子內酰基遷移原位生成硫酯肽, 實現(xiàn)與 N 端 Cys 肽的化學選擇性連接反應. 利用芳基氧酯肽作為硫酯肽的前體和分子內自然化學連接反應, Danishefsky 等[66]于 2006 年實現(xiàn)了含有單糖修飾的骨架環(huán)六肽的化學合成, 如圖 12 所示.
3.3 C 端巰基修飾烷基氧酯肽參與自然化學骨架環(huán)化反應
硫酯鍵對堿和親核試劑非常不穩(wěn)定, 易于和哌啶發(fā)生反應, 因而, 不能直接采用Fmoc法固相合成, 而只能采用 Boc 法進行制備. 傳統(tǒng)的 Boc-SPPS 制備硫酯中需要使用極為危險的 HF, 且?guī)в卸喾N翻譯后修飾肽的對HF 均不穩(wěn)定, 如糖修飾和磷酸化修飾等. 為解決這一問題, 近年來要發(fā)展了多種有效的 Fmoc-SPPS 合成多肽硫酯的方法. O—S 遷移硫酯制備法是 Fmoc 法制備硫酯肽的一種重要方法. 該方法利用烷基氧酯作為硫酯的前體, 通過分子內 O—S 遷移原位形成硫酯用于自然化學連接反應[67～69]. 2012 年, Liu 等[70]采用氧酯肽, 通過分子內的自然化學連接反應完成了植物骨架環(huán)多肽 KB1的合成, 如圖 13 所示. 氧酯與 Fmoc 固相合成兼容, 因而制備起來比硫酯更為方便. 然而需注意, O—S 遷移僅僅適用于位阻較小的氨基酸, 對于高位阻的環(huán)化反應, 存在水解副反應.
3.4 C 端巰基修飾酰胺肽參與的自然化學骨架環(huán)化反應
與氧酯肽類似, 研究者發(fā)現(xiàn)多種 C 端含巰基修飾的酰胺肽也可作為硫酯肽的前體. 2011 年, Macmillan 等[71]以 C 端為二肽 Gly-Cys、N 端為 Cys 的天然線性多肽為底物, 利用二肽 Gly-Cys 的分子內的 N-S 遷移硫酯化機制, 完成了多種抗菌骨架環(huán)多肽的合成. 2013 年, Tam等[72]以 C 端為 N-巰乙基-N-烷基化酰胺多肽為底物, 利用N-烷基化酰胺易于發(fā)生分子內的N-S遷移的特征, 完成了植物骨架環(huán)多肽 Kalata B1 的合成. 與氧酯相似, C端酰胺肽對于位阻較高的環(huán)化反應較差.
3.5 C 端酰肼肽參與的自然化學骨架環(huán)化反應
雖然國際上有很多課題組發(fā)展了一系列有效的Fmoc-SPPS 間接合成多肽硫酯的方法, 但是均存在問題, 如需要預制結構復雜的連接臂、成硫酯反應受位阻影響大和底物反應活性不宜控制等. 2011 年, Liu 等[73～78]以酰肼多肽作為底物, 發(fā)展出酰肼連接技術, 解決了前人方法的問題, 成為多肽及蛋白合成方面的一個重要成果.
酰肼連接技術的基本原理是, 在弱酸條件下, 多肽酰肼在亞硝酸的氧化下轉化為酰基疊氮, 隨后與硫醇反應原位生成肽硫酯并直接與N端Cys肽自然化學選擇性連接反應. 本質上來說, 這種連接方法是酰肼和硫酯原位轉變, 是一種改進的自然化學連接反應. 多肽酰肼也可以通過生物表達進行制備. 2012 年, Liu等[79]采用非天然氧酯氨基酸嵌入技術成功表達出多肽酰肼, 發(fā)展了表達蛋白酰肼連接技術. 同年, Liu 課題組[80]運用分子內酰肼連接反應, 成功制備了系列大小的骨架環(huán)多肽, 如圖 14 所示. 值得注意, Liu 等[81]證明分子內酰肼反應可以用于高效制備張力較大的骨架環(huán)四肽. 相比前人方法, 多肽酰肼具有合成難度低、成本低廉、自動化簡便的優(yōu)勢. 此外, 酰肼連接技術的連接效率不受位阻影響, 對于絕大多數(shù)位點的連接均適用.
4 前景和展望
20 世紀 40 年代, 高斯等發(fā)現(xiàn)著名的治療傷口感染的短桿菌肽, 讓研究者開始關注骨架環(huán)多肽研究. 在過去的將近七十年里, 科學家在細菌、真菌、植物和動物中均發(fā)現(xiàn)骨架環(huán)肽, 并有少數(shù)骨架環(huán)肽已成為治療人類疾病的藥物分子. 最近, 研究者發(fā)展出功能藥物多肽“嫁接”Cyclotide 技術, 為骨架環(huán)肽藥物研發(fā)提供了一條強有力的工具. 2012 年, Tam 等[82]將舒緩激肽 B1 受體拮抗肽嫁接到 Cyclotide 骨架內, 開發(fā)出治療疼痛的可口服的多肽藥物分子. 2013 年, Camareo 等[83]運用生物方法將生物活性短肽PMI嫁接到Cyclotide, 并在小鼠體內確認該環(huán)肽能夠通過激活 P53 蛋白來抑制腫瘤生長. 在這幾十年里, 化學研究者也發(fā)展了多種骨架環(huán)肽合成的方法. 從固相環(huán)化反應到液相環(huán)化反應, 從傳統(tǒng)縮合劑縮合反應到近期發(fā)展的化學選擇性連接反應, 化學方法已經逐漸成為制備骨架環(huán)肽的重要手段. 隨著骨架環(huán)肽合成技術的成熟和其結構與功能方面的深入研究, 我們相信將有更多的骨架環(huán)肽藥物分子被人們發(fā)現(xiàn).
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