心血管疾病是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因，為世界帶來巨大的健康和經(jīng)濟負擔[1,2]. 目前，人工血管作為自體血管的替代物，已被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療[3~5]. 然而，植入過程中容易造成內(nèi)皮損傷及微生物感染，從而導致內(nèi)膜增生、傷口感染和炎癥浸潤等并發(fā)癥的產(chǎn)生，嚴重影響了人工血管的臨床應(yīng)用[6~8]. 其中，促進人工血管管腔表面內(nèi)皮層的快速形成能夠有效降低內(nèi)皮損傷帶來的風險，而植入過程中的微生物感染則可以通過材料表面抗菌來進行有效預防[9~16]. 因此，研究同時具有促進表面內(nèi)皮化和抵抗微生物感染的多功能生物材料，對促進人工血管的發(fā)展及心血管疾病的治療至關(guān)重要(圖1(a)).
宿主防御肽(HDPs)作為先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有廣譜的抗菌活性，被廣泛應(yīng)用于抵抗溶液或生物材料表面的微生物的感染[17~19]. 然而，HDPs存在結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、難以大量制備以及價格昂貴等缺陷，嚴重限制了其進一步應(yīng)用[18,20]. 為了克服HDPs的固有缺陷，越來越多的HDPs模擬物被合成并投入到抗菌的研究與應(yīng)用中[21~24]. 其中，β-多肽聚合物具有優(yōu)異的抗菌活性和生物相容性，并且穩(wěn)定性高、易于大量合成且價格低廉，已被廣泛應(yīng)用于溶液及表面抗菌[25~27]. 此外，我們的前期研究表明，β-多肽聚合物NM40CH60具有優(yōu)異的選擇性促進內(nèi)皮細胞(EC)黏附并抑制平滑肌細胞(SMC)黏附的功能，在促進血管移植物內(nèi)皮化的方向具有較好的應(yīng)用前景[28]. 因此，本研究使用具有促內(nèi)皮化功能的β-多肽聚合物NM40CH60進行表面修飾，并對其表面抗菌活性及抗菌機理進行研究.
熱塑型聚氨酯(TPU)材料具有較高的生物相容性及良好的機械性能，被廣泛用于人工血管移植物的研究與應(yīng)用[29]. 本文合成了不同聚合度的β-多肽聚合物NM40CH60，利用表面等離子體照射和溴代的方式將其接枝于TPU表面，研究其抗菌活性、抗菌機理及細胞選擇性黏附功能. 研究發(fā)現(xiàn)，β-多肽聚合物NM40CH60修飾的TPU表面對革蘭氏陽性菌(MRSA)和革蘭氏陰性菌(E. coli)均表現(xiàn)出廣譜的高效抗菌活性. 此外，聚合度為38 (DP=38，DP表示聚合度)的β-多肽聚合物NM40CH60修飾的TPU表面具有優(yōu)異的血液相容性及選擇性促進EC黏附的功能. 這些結(jié)果表明，β-多肽聚合物NM40CH60修飾的TPU表面能夠有效降低人工血管植入過程中面臨的感染及內(nèi)皮損傷的風險，在心血管疾病的治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景.
1 實驗部分
N,N-二甲基乙酰胺、雙(三甲基硅基)氨基鋰、四氫呋喃、石油醚、三氟乙酸、甲基叔丁基醚、甲醇、無水乙醇、甲苯等試劑購于上海泰坦科技股份有限公司，溴仿購于薩恩化學技術(shù)(上海)有限公司，Triton X-100購于美國Sigma-Aldrich公司，內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(ECM)和平滑肌細胞培養(yǎng)基(SMCM)購于美國sciencell公司，細胞活死染色試劑盒購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司.
不同聚合度的β-多肽聚合物NM40CH60按照之前文獻報道中的合成步驟進行合成[28].
將TPU基材(1 cm × 1 cm)浸泡于無水乙醇中超聲清洗1 h. 隨后浸泡于2 vol%的吐溫-20溶液中，超聲清洗15 min. 吹干后置于等離子體照射機內(nèi)，控制腔體內(nèi)氧氣流速為0.3~0.4 MPa，照射功率為70 W，照射時長為8 min進行單面照射，獲得表面帶活性氧基團修飾的TPU表面. 隨后將其浸沒于溴化試劑溶液(溴仿/甲苯 = 1/10，V/V)中反應(yīng)6~7 h，甲醇和乙醇交替沖洗，氮氣吹干，真空干燥24 h，獲得溴代TPU表面(TPU-Br). 最后在TPU-Br表面均勻滴加β-多肽聚合物溶液(80 μL，1 mg/mL). 反應(yīng)12 h后，將表面使用超純水和無水乙醇交替沖洗并氮氣吹干，加硫代甘油(80 μL，10 mg/mL)溶液反應(yīng)3~4 h，清洗并吹干后，獲得β-多肽聚合物修飾的TPU表面.
測試β-多肽聚合物修飾的TPU表面對革蘭氏陽性菌Staphylococcus aureus USA 300 (MRSA)和革蘭氏陰性菌Escherichia coli (E. coli JM109)的抗菌性能，使用菌濃為5×105 CFU/mL. 將β-多肽聚合物修飾的TPU片放置于24孔板中，并使用未修飾的TPU表面作為實驗對照組. 將每個表面均勻滴加80 µL的菌液，置于37 ℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2.5 h. 隨后每孔加入1.4 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，將孔板超聲2 min并混勻震蕩5 min，確保細菌從表面脫離. 最后，為了獲得每組樣品的菌落數(shù)，從孔板中取30 µL的細菌懸浮液使用接種環(huán)進行涂布，并將培養(yǎng)皿置于37 ℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜. 培養(yǎng)后對菌落數(shù)進行計數(shù)，其中β-多肽聚合物修飾的TPU和TPU表面菌落數(shù)記為Csample，直接加入菌液的空白對照組記為Ccontrol，表面抗細菌率通過下式計算獲得：
TPU-NM40CH60和TPU表面的親疏水性使用水接觸角儀器(JC2000D2，上海中辰數(shù)碼)進行表征. 使用Thermo Scientific K-Alpha光譜儀檢測TPU-NM40CH60和TPU表面的光電子能譜(XPS). 該光譜儀配備有AI Kα (1486.6 eV) X射線源，工作電壓為12 kV，真空度為8×10-10 Pa. TPU-NM40CH60的聚合物層厚度使用橢圓偏振儀進行表征，聚合物鏈的接枝密度通過σ = (hρNA)/Mn公式計算獲得，其中h為聚合物鏈的厚度，ρ為聚合物的密度(假設(shè)為1 g/cm3)，NA是阿伏伽德羅常數(shù)(6.023×1023)，Mn是聚合物的數(shù)均分子量(Mn = 4460 g/mol).
將TPU-NM40CH60和TPU表面置于24孔板中并加入1.5 mL PBS浸沒. 在固定時間點(0.5、1、2、4、6、9、12、15、18和24 h)取出90 µL孔內(nèi)液體作為表面浸出液，再補充等量PBS于孔板內(nèi). 表面浸出液使用熒光胺溶液進行測定(10 μL，3 mg/mL 溶于二甲基亞砜中). 與熒光胺溶液共混后避光孵育15 min，使用酶標儀在Ex 400 nm和Em 470 nm波長下讀數(shù). 其中，使用1 mg/mL的聚合物溶液作為陽性對照.
使用場發(fā)射掃描顯微鏡(SEM)觀察TPU-NM40CH60表面的殺菌形貌. 在TPU-NM40CH60和TPU表面上滴加80 µL工作濃度為107 CFU/mL的細菌懸浮液，在37 ℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2.5 h. 隨后，使用4%戊二醛溶液進行固定，并4 ℃過夜. 固定后的表面用PBS輕柔沖洗3次，使用梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)進行表面逐步脫水，每次10 min. 最后將樣品放在干燥器中干燥處理，噴金后使用SEM進行形貌表征.
將E. coli和MRSA稀釋到5×105 CFU/mL的工作濃度后，取80 µL加入TPU-NM40CH60和TPU表面，并置于37 ℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng). 培養(yǎng)0.5、1、1.5、2和2.5 h后，吸取表面菌液并加入裝有2420 µL超純水的15 mL的離心管中，并將TPU-NM40CH60和TPU表面同樣置于15 mL離心管中，超聲3 min后混勻2 min. 隨后將TPU-NM40CH60和TPU表面取出，使用導電儀測量溶液的電導率.
溶血實驗后，使用SEM觀察表面hRBCs的形貌. 將表面用PBS洗3次，使用2.5%的戊二醛溶液固定，置于4 ℃過夜. 隨后，用PBS洗去固定液，并用梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)進行表面逐步脫水，每次10 min. 最后將樣品放在干燥器中干燥處理后噴金，使用SEM進行hRBCs形貌表征.
使用原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)和原代人臍動脈平滑肌細胞(HUASMC)進行細胞黏附實驗. 其中，HUVEC使用ECM培養(yǎng)基(含5%胎牛血清，1%內(nèi)皮細胞生長補充物和1%青霉素/鏈霉素溶液)進行培養(yǎng)，HUASMC使用SMCM培養(yǎng)基(含2%胎牛血清，1%平滑肌細胞生長補充物和1%青霉素/鏈霉素溶液)進行培養(yǎng). 細胞在37 ℃含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞達到80%的匯合后，收集細胞，以每毫升培養(yǎng)基1.2×104個細胞的濃度接種在表面，每個表面100 μL. 培養(yǎng)2 h后，將表面浸沒于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h. 使用細胞活死染色試劑盒(AM/PI)對細胞進行染色，并置于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照.
細胞在表面黏附的定量實驗是將細胞在表面培養(yǎng)24 h后，向培養(yǎng)液中加入10%的MTT溶液，在37 ℃避光孵育4 h. 隨后，移除表面的培養(yǎng)基，加入100 μL的二甲基亞砜，輕微晃動以溶解細胞與MTT形成的甲臜晶體. 將溶液后的液體等量轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，使用酶標儀讀取570 nm下的OD值.
2 結(jié)果與討論
使用耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA) 和大腸桿菌(E. coli)對不同聚合度的β-多肽聚合物NM40CH60修飾的TPU表面進行抗菌活性篩選. 圖2(b)可以看出不同聚合度的β-多肽聚合物修飾的TPU表面均表現(xiàn)出對MRSA優(yōu)異的抗菌活性，殺菌率分別為98.76%、99.82%和99.29%. 圖2(c)為不同聚合度的β-多肽聚合物修飾的TPU表面對E. coli的抗菌活性，殺菌率分別為93.32%、99.07%和99.21%. 此外，MRSA和E. coli在LB-ager板上的菌落照片如圖2(d)所示，聚合物修飾的TPU表面上的菌落均遠少于TPU表面及對照. 這些結(jié)果證明不同聚合度的β-多肽聚合物NM40CH60修飾的TPU表面均具有較強的抗菌活性. 從中，我們優(yōu)選出DP=38的NM40CH60聚合物進行后續(xù)研究.
為了進一步研究聚合物是否穩(wěn)定接枝于TPU表面，我們將TPU、TPU-NM40CH60浸沒于PBS中在不同時間點使用熒光胺監(jiān)測溶液中的聚合物濃度變化，結(jié)果如圖3(e)所示. 與對照相比，TPU- NM40CH60表面的熒光強度無明顯變化，表明該表面具有優(yōu)異的接枝穩(wěn)定性.
3 結(jié)論
本文將促內(nèi)皮化功能的β-多肽聚合物NM40CH60接枝于TPU表面，并研究其抗菌活性及抗菌機理. 結(jié)果表明，TPU-NM40CH60表面對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌展現(xiàn)出廣譜的接觸殺菌活性. 此外，該表面保持了優(yōu)異的EC選擇性黏附功能，能夠有效降低人工血管植入過程中的感染及內(nèi)皮損傷的風險，在心血管疾病治療領(lǐng)域具有廣闊的研究及應(yīng)用前景.
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