摘要 糖聚肽是一類(lèi)由聚肽/聚氨基酸與糖類(lèi)化合物共價(jià)相連構(gòu)成的高分子化合物, 因其良好的生物相容性及獨(dú)特的生物學(xué)性能, 在自組裝、組織工程、藥物輸送等領(lǐng)域均顯示出廣泛的應(yīng)用前景, 成為近年來(lái)蓬勃發(fā)展的熱點(diǎn)領(lǐng)域. 高效合成結(jié)構(gòu)規(guī)整可控的糖聚肽是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn). 點(diǎn)擊化學(xué)的快速發(fā)展為糖聚肽的合成提供了高效便捷的途徑. 系統(tǒng)綜述了點(diǎn)擊反應(yīng)在糖聚肽兩種合成策略中的應(yīng)用——通過(guò)聚合后修飾法將糖分子引入到聚氨基酸前體側(cè)鏈上以及對(duì)糖苷化的 α-氨基酸-N-羧酸酐(glyco-NCA)“可點(diǎn)擊”化學(xué)單體的開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng), 同時(shí)也總結(jié)了通過(guò)點(diǎn)擊反應(yīng)將含糖功能基元化學(xué)偶聯(lián)到聚氨基酸鏈末端合成糖聚肽類(lèi)似物的策略, 并對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)和發(fā)展方向進(jìn)行了簡(jiǎn)要討論.
糖作為生物體的基本構(gòu)建砌塊和儲(chǔ)能單元, 以糖綴合物的形態(tài)參與許多重要的生命過(guò)程[1～5]. 其中, 糖蛋白在細(xì)胞信號(hào)識(shí)別、神經(jīng)調(diào)控、信息傳遞及免疫調(diào)節(jié)等生命活動(dòng)中扮演著重要角色. 糖肽是由糖基與氨基酸或多肽鏈共價(jià)相連形成的綴合物, 具有與糖蛋白相似的多種生物功能, 同時(shí)又不具有糖蛋白巨大的分子量和復(fù)雜的結(jié)構(gòu), 因而糖肽作為研究糖蛋白的重要模型引起了人們的廣泛關(guān)注[6]. 目前, 采用固相合成法、選擇性化學(xué)修飾法、酶催化糖基化法以及生物半合成法等有機(jī)化學(xué)合成手段構(gòu)建天然糖蛋白/糖肽類(lèi)似物的方法, 均存在合成步驟繁瑣、產(chǎn)率較低等缺點(diǎn), 限制了其進(jìn)一步的發(fā)展和應(yīng)用. 近些年, 有機(jī)合成及聚合反應(yīng)技術(shù)的發(fā)展為人工合成糖蛋白/糖肽類(lèi)似物提供了新的思路和手段. 將聚肽/聚氨基酸與糖類(lèi)化合物偶聯(lián)制備的糖聚肽, 作為天然糖蛋白/糖肽的合成類(lèi)似物, 其具有分子結(jié)構(gòu)規(guī)整、制備簡(jiǎn)單、易于設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)調(diào)控等優(yōu)勢(shì), 為糖蛋白/糖肽活性與構(gòu)效關(guān)系的研究提供了基礎(chǔ), 已發(fā)展成為探索、研究并闡明糖蛋白相關(guān)科學(xué)問(wèn)題的有力工具. 同時(shí), 糖聚肽由于具有良好的生物相容性及獨(dú)特的生物學(xué)性能, 在生物診斷、組織工程、細(xì)胞培養(yǎng)、藥物輸送等領(lǐng)域均顯示出廣泛的應(yīng)用前景[7～9].
到目前為止, 糖聚肽合成的研究已有 20 多年歷史, 且在最近幾年呈現(xiàn)出蓬勃發(fā)展的趨勢(shì), 但大量制備結(jié)構(gòu)規(guī)整的糖聚肽仍存在一定困難, 從而限制了糖聚肽在材料及生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用. 點(diǎn)擊化學(xué)(“Cli k” h mist y)具有高效、快速, 高選擇性、反應(yīng)條件溫和及立體選擇性好等優(yōu)點(diǎn), 在材料制備、藥物合成等領(lǐng)域均得到了廣泛應(yīng)用[10,11]. 除了傳統(tǒng)的銅催化的疊氮/炔的 1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)外, 目前巰基/烯、巰基/炔、巰基/馬來(lái)酰亞胺、Diels-Alder 以及鹵代物與氮氧自由基偶聯(lián)等新型點(diǎn)擊反應(yīng)也得到蓬勃發(fā)展, 這些合成技術(shù)為糖聚肽及其類(lèi)似物的制備提供了便捷手段. 本文對(duì)近些年點(diǎn)擊反應(yīng)在糖聚肽及其類(lèi)似物合成中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述, 并對(duì)合成策略進(jìn)行了簡(jiǎn)述與評(píng)價(jià).
1 點(diǎn)擊化學(xué)
點(diǎn)擊化學(xué)(“ li k” chemistry)是由美國(guó)著名的化學(xué)家 Sharpless 于 2001 年首次提出的[12], 它是繼組合化學(xué)之后又一具有顛覆性的合成技術(shù), 以其反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)得到化學(xué)研究者的廣泛青睞. 其中, 銅催化的疊氮-炔 1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)(copper-catalyzed azidealkynecycloaddition, CuAAC)是其代表性反應(yīng)[13,14]. 近些年, 無(wú)金屬催化的綠色點(diǎn)擊反應(yīng)更是成為研究的熱點(diǎn), 被成功應(yīng)用于聚合物制備、藥物合成、蛋白質(zhì)組學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域[15,16].
目前點(diǎn)擊反應(yīng)的主要類(lèi)型有[17]: (1) Cu(I)催化的疊氮與炔基反應(yīng)生成 1,2,3-三唑五元環(huán)的反應(yīng)(CuAAC); (2)環(huán)張力促進(jìn)的疊氮與環(huán)炔的環(huán)加成反應(yīng)(strainpromoted cycloaddition of alkynes and azides, SPAAC); (3) 共軛雙烯與親雙烯體的 Diels-Alder (D-A)環(huán)加成反應(yīng); (4)巰基與各類(lèi)官能團(tuán)之間的反應(yīng), 包括巰基-烯/炔(Thiol-ene/yne)化學(xué)反應(yīng)、巰基-鹵素取代反應(yīng)、巰基-環(huán)氧反應(yīng)以及巰基和異氰酸酯的反應(yīng)等(Scheme 1). CuAAC 反應(yīng)可以在多種質(zhì)子和非質(zhì)子溶劑中進(jìn)行, 并且不受其它官能團(tuán)的影響, 是研究最早且應(yīng)用最廣的點(diǎn)擊反應(yīng)類(lèi)型. 該反應(yīng)采用 Cu(I)為催化劑, 也可以通過(guò)Cu(II)或者 Cu(0)在反應(yīng)過(guò)程中原位還原/氧化制備. 但是, 使用銅鹽作為催化劑, 后處理較為繁瑣, 且產(chǎn)物中殘留的部分很難去除干凈, 限制了其在藥物合成和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用. 隨后, 科研工作者經(jīng)過(guò)探索研究發(fā)現(xiàn), 環(huán)炔與疊氮的反應(yīng)不需要金屬催化劑, 僅依靠環(huán)炔的環(huán)張力即可促進(jìn)兩官能團(tuán)之間的反應(yīng). 該反應(yīng)速率雖然沒(méi)有 CuAAC 高, 但可以通過(guò)在環(huán)炔中引入強(qiáng)吸電子基團(tuán)(如氟原子等)來(lái)改變環(huán)張力, 加速反應(yīng)的進(jìn)行. SPAAC的發(fā)展為生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記、分子示蹤等提供了新途徑. D-A 環(huán)加成反應(yīng)是指共軛雙烯(diene)和親雙烯體(dienophile)之間進(jìn)行[4＋2]環(huán)加成反應(yīng)形成穩(wěn)定的六元環(huán)化合物的反應(yīng). 該反應(yīng)通常在較溫和的條件下進(jìn)行, 一般不需要催化劑, 且反應(yīng)進(jìn)行到一定溫度時(shí)可以發(fā)生逆反應(yīng), 應(yīng)用于聚合物制備中, 不僅有利于聚合物的降解、回收和利用, 還可以用于構(gòu)建化學(xué)鍵動(dòng)態(tài)變化的功能聚合物. 巰基與各類(lèi)官能團(tuán)的反應(yīng)分為兩大 類(lèi)[18]: 一類(lèi)是自由基加成反應(yīng), 包括巰基-烯(Thiolene)和巰基-炔(Thiol-yne)的自由基加成反應(yīng); 另一類(lèi)是親核加成反應(yīng), 包括巰基與環(huán)氧、異氰酸酯、鹵素和缺電子雙鍵的邁克爾加成反應(yīng). 其中, 巰基-烯/炔化學(xué)反應(yīng)是近年來(lái)發(fā)展出的一類(lèi)新型的點(diǎn)擊反應(yīng), 一般通過(guò)加熱或紫外光照射產(chǎn)生自由基從而引發(fā)反應(yīng). 該反應(yīng)便捷、快速、立體選擇性好, 可以在無(wú)金屬催化劑和無(wú)溶劑的條件下進(jìn)行, 被認(rèn)為是最有發(fā)展前景的無(wú)金屬催化點(diǎn)擊反應(yīng)[19,20].
由于點(diǎn)擊反應(yīng)效率高(產(chǎn)率一般高于 90%), 反應(yīng)條件溫和, 催化劑高效穩(wěn)定, 且所用單體中官能團(tuán)均可以通過(guò)簡(jiǎn)單溫和的化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化得到, 因而符合聚合反應(yīng)的要求, 被廣泛應(yīng)用于各種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)聚合物(包括線形、刷形、星形、環(huán)狀及樹(shù)枝狀大分子等)材料的制備當(dāng)中. 除線形聚合物以外的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)聚合物都具有比較特殊的性質(zhì), 如溶解性好、粘度低、熱穩(wěn)定性高和可修飾官能團(tuán)位點(diǎn)多, 且溶液自組裝行為復(fù)雜, 因而在超分子與自組裝領(lǐng)域、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域均有廣闊的應(yīng)用前景, 日益受到大家的重視. 相關(guān)的合成方法及應(yīng)用進(jìn)展已有綜述報(bào)道[21～32], 在此不再贅述.
2 點(diǎn)擊反應(yīng)在糖聚肽及其類(lèi)似物合成中的應(yīng)用
糖聚肽(glycopolypeptides), 即糖苷化合成的聚氨基酸/多肽, 嚴(yán)格意義上是指含有側(cè)掛糖基元的聚氨基酸/多肽. 另外, 聚氨基酸/多肽與天然多糖或糖聚合物(采用化學(xué)合成方法制備的含有側(cè)掛糖基元的高分子化合物)的化學(xué)偶聯(lián)物, 包括線性、樹(shù)枝狀等各種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的合成聚合物統(tǒng)稱為糖聚肽類(lèi)似物[33]. 由于該領(lǐng)域最近幾年才有較大發(fā)展, 尚未形成統(tǒng)一的表述, 因此, 很多文獻(xiàn)中不嚴(yán)格區(qū)分糖聚肽和糖聚肽類(lèi)似物.
糖聚肽作為天然糖蛋白的合成類(lèi)似物, 與糖蛋白相比, 具有制備簡(jiǎn)單、結(jié)構(gòu)規(guī)整、易于批量化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn). 人工合成糖聚肽不僅有助于理解天然糖蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)特性, 同時(shí)為糖蛋白結(jié)構(gòu)與功能之間構(gòu)效關(guān)系的研究提供了模型[8](圖1). 糖聚肽高分子中聚氨基酸骨架具有良好的生物可降解性, 并依據(jù)分子結(jié)構(gòu)的不同顯示出 α-螺旋、β-折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu), 有利于通過(guò)自組裝形成豐富形貌的聚集體[34,35]. 另外, 已有大量研究表明, 糖綴合物是重要的生物信息分子, 在許多生理和病理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用, 并可通過(guò)與蛋白質(zhì)的特異性識(shí)別, 實(shí)現(xiàn)生物信息的有效傳遞[4,36]將糖分子偶聯(lián)到聚氨基酸側(cè)鏈或末端, 可賦予糖聚肽高分子良好的親水性和生物相容性, 以及生物分子識(shí)別和細(xì)胞粘附特性等. 糖聚肽高分子自組裝體系因其具有能仿生模擬表面含糖綴合物的細(xì)胞或細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的特性而引起了科研工作者深入的研究和探索. Lecommandoux 等[37]合成的葡聚糖和聚(γ-谷氨酸-L 芐酯)(PBLG)的嵌段共聚物(dextran-b-PBLG)在水溶液中自組裝成了類(lèi)“病毒衣殼”結(jié)構(gòu)的囊泡組裝體; 糖基化聚(炔丙基甘氨酸)為親水鏈段、PBLG 為疏水鏈段的兩親糖聚肽(PBLG-b-PGG)依據(jù)親疏水鏈段比例的不同, 在水溶液中自組裝形成膠束、囊泡或蠕蟲(chóng)狀聚集體, 且不同形貌聚集體均可特異性識(shí)別凝集素 RCA120[38]. Deming 等[39]則研究了糖聚肽高分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)自組裝體的影響, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在具有相同疏水鏈結(jié)構(gòu)的情況下, 親水的糖聚肽嵌段若為無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu), 則自組裝成囊泡結(jié)構(gòu)聚集體, 若為 α-螺旋結(jié)構(gòu), 則形成無(wú)規(guī)則片狀組裝體. 另外, 含糖聚肽的兩親雜化高分子也被應(yīng)用于程序化分級(jí)自組裝的研究及各種豐富形貌自組裝聚集體的制備當(dāng)中[40～43]. 另一方面, 糖聚肽具有良好的生物相容性和獨(dú)特的生理學(xué)性能, 在靶向藥物輸送、細(xì)胞組織培養(yǎng)、生物成像等領(lǐng)域均獲得廣泛關(guān)注. Wenz 等[44]合成了一種具有熒光分子標(biāo)記的半乳糖側(cè)掛修飾的聚賴氨酸, 并發(fā)現(xiàn)其具有靶向識(shí)別 T 淋巴細(xì)胞表面的 L 選擇素 CD26L 的能力. Chen 等[45]制備的糖聚肽 PPLG-b-PLGA 溶液自組裝形成納米膠束, 高效同步負(fù)載抗腫瘤藥物阿霉素(DOX); 該復(fù)合膠束具有 pH響應(yīng)性藥物釋放特性, 且能特異性靶向 HepG2 肝癌細(xì)胞. 同時(shí), 其制備所得 PPLG-g-Man/HPPA 共聚物, 通過(guò)溶液中酶催化的交聯(lián)反應(yīng)生成可注射(injectable)糖聚肽凝膠, 有望應(yīng)用作為軟骨組織工程中的三維仿生支 架[46]. 除此之外, 合成糖聚肽作為基因輸送載體[47]、細(xì)胞穿透材料[48]、細(xì)胞的選擇性吸附[49]及活細(xì)胞膜的定點(diǎn)修飾材料[50]等均有相關(guān)應(yīng)用報(bào)道. 糖聚肽的應(yīng)用領(lǐng)域在圖 2 中表示.
糖聚肽在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用也推動(dòng)了科研工作者對(duì)其合成制備方法的深入研究. 目前, 糖聚肽的合成方法主要有兩種: (1)首先制備功能化的聚氨基酸前體, 再通過(guò)聚合后修飾法將糖分子引入到聚氨基酸側(cè)鏈上; (2)首先合成糖苷化的 α-氨基酸-N-羧酸酐(glyco-NCA)單體, 再通過(guò) NCA 開(kāi)環(huán)聚合高效制備結(jié)構(gòu)規(guī)整的糖聚肽. 另外, 也可以直接將含糖基元化學(xué)偶聯(lián)到聚氨基酸鏈末端合成糖聚肽類(lèi)似物, 示意圖如圖 3 所示[9,51].
2.1 利用點(diǎn)擊反應(yīng)在聚氨基酸側(cè)鏈鍵合糖分子
人工合成聚氨基酸作為天然蛋白質(zhì)或多肽的合成類(lèi)似物, 具有優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性, 幾十年前已被作為結(jié)構(gòu)材料使用, 最近十幾年隨著生物材料的興起而呈現(xiàn)出蓬勃發(fā)展的趨勢(shì), 被廣泛應(yīng)用于構(gòu)筑精確有序的納米組裝體及作為基因/藥物輸送載體[52]. 聚氨基酸的合成方法主要包括生物合成法、固相合成法以及 α-氨基酸-N-羧酸酐(α-carboxyanhydrides, NCA)開(kāi)環(huán)聚合法. 其中, NCA 開(kāi)環(huán)聚合法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、產(chǎn)率高、無(wú)消旋, 且聚合物分子量及分子量分布可控等優(yōu)點(diǎn), 目前已成為聚氨基酸制備的主要方法[53]. 該方法通常是將 α-氨基酸與(三)光氣反應(yīng)生成 α-氨基酸-N-羧酸酐單體, 再通過(guò)親核試劑或者有機(jī)堿(最為常見(jiàn)的是伯胺和醇鹽負(fù)離子)及過(guò)渡金屬配合物等引發(fā) NCA 單體開(kāi)環(huán)聚合, 高效可控制備得到結(jié)構(gòu)規(guī)整的聚氨基酸(Scheme 2). 同時(shí), 該方法可以進(jìn)一步制備嵌段、接枝及環(huán)狀功能氨基酸聚合物. Deming 等[53～62]在該領(lǐng)域做出了許多開(kāi)創(chuàng)性的工作, 并對(duì) NCA 的活性/可控催化體系進(jìn)行了較為深入的探索和有效的改進(jìn). 經(jīng)過(guò) 60 多年的發(fā)展, 到目前為止, 已有近 200 種不同的天然或非天然的 NCA 單體被制備出來(lái), 用于聚氨基酸的合成. 具體合成方法及聚合物的應(yīng)用可參見(jiàn)相關(guān)綜述報(bào)導(dǎo)[63～72].
基于已有的聚氨基酸高分子骨架, 研究者首先聯(lián)想到將糖基元通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)策略接枝到聚氨基酸側(cè)鏈上制備糖聚肽. 早期的合成方法是將糖分子通過(guò)酰胺鍵直接化學(xué)鍵合到天然氨基酸(如賴氨酸或谷氨酸)的活性基上(Scheme 3). 由于較低的偶聯(lián)反應(yīng)活性及糖基的化學(xué)位阻作用, 糖基元接枝率大多低于 60%. 采用 1-羥基苯并三唑(HOBt)或 4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMT-MM)偶聯(lián)試劑, 接枝率最高可以達(dá)到90%左右, 但強(qiáng)烈依賴于糖基的化學(xué)結(jié)構(gòu)或位阻[73～77]. 最近, Heise 等[78]同樣采用 DMT-MM 偶聯(lián)試劑, 制備了系列具有精確序列結(jié)構(gòu)的糖聚肽嵌段共聚物, 并研究了嵌段序列特異性的糖分子在溶液中的二級(jí)結(jié)構(gòu)及對(duì)凝集素的特異性識(shí)別作用(Scheme 4). 雖然半乳糖分子的接枝效率達(dá)到 90%～93%, 但非定量的接枝反應(yīng)仍會(huì)對(duì)后續(xù)糖聚肽分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)及生物活性的對(duì)比研究產(chǎn)生影響. 除此之外, Roche[79]和 Li 等[80]采用異硫氰酸根功能化糖基試劑, 將糖分子通過(guò)硫脲鍵(Scheme 3c)偶聯(lián)到聚氨基酸/多肽側(cè)鏈上, 該反應(yīng)即使采用過(guò)量的糖基化試劑, 接枝率仍不超過(guò) 40%.
近些年, 隨著點(diǎn)擊化學(xué)在高分子學(xué)科領(lǐng)域中的應(yīng)用, 一系列具有可“點(diǎn)擊”側(cè)鏈的聚氨基酸被相繼開(kāi)發(fā)出來(lái), 并應(yīng)用于糖聚肽的制備中. Hammond等[81]于2009年首次報(bào)道了將疊氮化的聚乙二醇(PEG-azides)通過(guò)Cu(I)催化的疊氮-炔環(huán)加成點(diǎn)擊反應(yīng)偶聯(lián)到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯) (PPLG)上, 以近乎定量的反應(yīng)產(chǎn)率制備得到含有側(cè)掛 PEG 的聚合物分子刷. 隨后, Chen 等[82]采用同樣的聚氨基酸前體 PPLG, 將三種疊氮基功能化糖分子通過(guò) CuAAC 反應(yīng)偶聯(lián)到聚合物主鏈上, 分別制備得到含有側(cè)掛葡萄糖、半乳糖和甘露糖分子的糖聚肽(Scheme 5), 拓展了合成糖聚肽的糖基多樣性. 該小組進(jìn)一步利用此合成策略, 制備了含有側(cè)掛糖基元和3-(4-羥苯基)-丙酰胺(HPPA)的共聚物作為仿生軟骨組織工程支架[46], 以及糖聚肽與聚谷氨酸(PLGA)的嵌段共聚物作為阿霉素(DOX)的高效輸送載體[83]. Brougham等[84]以氧化鐵納米顆粒表面的氨基為引發(fā)劑, 引發(fā) γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-NCA 單體開(kāi)環(huán)聚合, 再通過(guò) CuAAC反應(yīng)高效偶聯(lián)糖分子, 制備所得糖聚肽修飾磁納米粒子具有良好的溶液分散性, 并具有生物識(shí)別及磁共振成像特性, 有望作為磁共振成像造影劑. Heise 等[85]采用CuAAC 反應(yīng), 將半乳糖和二乙二醇單甲醚(mEO2)同步偶聯(lián)到 PPLG 側(cè)鏈上, 制備了具有溫敏特性的糖聚肽. 有趣的是, 該糖聚肽對(duì)凝集素 RCA120 的特異性識(shí)別能力與聚合物溶液的濁點(diǎn)溫度有關(guān), 且可以通過(guò)半乳糖和mEO2 的接枝比例進(jìn)行調(diào)控. 這為溫度敏感的生物學(xué)響應(yīng)功能材料的設(shè)計(jì)制備提供了新思路. 除此之外, Gupta等[86]制備了兩親均聚糖聚肽, 并研究了其自組裝行為. 但是, 上述采用 PPLG 后修飾糖基元的策略雖然可以高效定量得到功能糖聚肽, 但側(cè)鏈中酯鍵在生理?xiàng)l件下會(huì)緩慢水解, 降低糖聚肽的生物活性. 另外, 酯鍵在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿溶液中均不穩(wěn)定, 在多種官能團(tuán)的脫保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)條件下均會(huì)發(fā)生斷裂, 從而限制了具有較復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)和多種功能的糖聚肽體系的進(jìn)一步制備及應(yīng)用。
基于上述酯鍵的不穩(wěn)定性, 為了提高疏水側(cè)鏈的水解穩(wěn)定性, Heise 和 Lecommandoux 等[87～90]合成了炔丙基甘氨酸-NCA 單體, 并通過(guò)一級(jí)胺引發(fā)的開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)制備了聚(炔丙基甘氨酸)均聚物及與 PBLG 的無(wú)規(guī)和嵌段共聚物. 隨后, 在三乙胺和催化量(PPh3)3CuBr 的二甲基亞砜(DMSO)溶劑中, 與疊氮基功能化半乳糖高效反應(yīng), 獲得具有水解穩(wěn)定性的系列糖聚肽高分子. 該糖聚肽均聚物 PGG 在溶液中呈現(xiàn) β-折疊結(jié)構(gòu), 并且與凝集素 RCA120 具有特異性識(shí)別作用, 表現(xiàn)出良好的生物; 同時(shí), 兩親嵌段共聚物 PGG-b-PBLG 通過(guò)“納米沉淀法”自組裝形成球狀膠束、蠕蟲(chóng)狀膠束和囊泡等多種形貌聚集體[38]. 隨后, Lecommandoux 等[91]采用更為廉價(jià)的天然氨基酸替代上述非天然氨基酸制備糖聚肽. 該方法以 ω-氨基叔丁氧羰基(Boc)保護(hù)的賴氨酸-NCA為前體, 經(jīng)開(kāi)環(huán)聚合制備聚氨基酸, 脫除 Boc 保護(hù)基后, 在碳二亞胺(DCC)的活化作用下, ω-氨基以近乎定量的產(chǎn)率偶聯(lián)戊炔酸, 隨后通過(guò) CuAAC 反應(yīng)高效接枝乳糖和半乳糖.
另一種策略即是制備側(cè)鏈含有疊氮基的聚氨基酸前體, 再與炔基功能化糖基元進(jìn)行“ li k”偶聯(lián). Zhang等[92]于 2010 年首次合成了聚(γ-氯丙基-L-谷氨酸酯) (PCPLG), 經(jīng)疊氮化鈉處理, 側(cè)鏈末端氯原子定量轉(zhuǎn)化為疊氮基, 獲得含有側(cè)掛疊氮基的聚(γ-疊氮丙基-L-谷氨酸酯)(PAPLG), 再通過(guò) CuAAC 反應(yīng)鍵合 1-炔丙基-α-D-甘露糖, 獲得糖聚肽高分子. 隨后, Deming 和Rhodes[93]開(kāi)發(fā)了一種新型的疊氮基功能化的聚氨基酸. 該方法以芐氧羰基(CBz)保護(hù)的賴氨酸或鳥(niǎo)氨酸為前體, 首先將 ω-氨基轉(zhuǎn)變?yōu)榀B氮基團(tuán), 再以(PMe3)4Co 為引發(fā)劑, 引發(fā)疊氮基功能化的氨基酸-NCA 單體開(kāi)環(huán)聚合, 制備得到序列長(zhǎng)度可控的均聚和共聚氨基酸, 進(jìn)一步通過(guò) CuAAC 點(diǎn)擊反應(yīng)與炔基功能化糖分子高效偶聯(lián)生成糖聚肽(Scheme 6). 該方法直接引發(fā)疊氮基功能化的NCA 單體開(kāi)環(huán)聚合, 避免了聚合反應(yīng)后官能團(tuán)轉(zhuǎn)化不完全的缺陷; 并且, 側(cè)鏈完全由亞甲基組成, 具有優(yōu)異的水解穩(wěn)定性. 除此之外, Jiang 等[94]合成了 γ-(2-疊氮乙基-L-谷氨酸酯)-NCA (AELG-NCA)單體, 并以含有二硫鍵的氨基封端聚己內(nèi)酯 PCL-SS-NH2 引發(fā)該 NCA 單體開(kāi)環(huán)聚合, 后續(xù)通過(guò) CuAAC 反應(yīng)鍵合乳糖或半乳糖, 制備了具有細(xì)胞內(nèi)還原響應(yīng)性的兩親嵌段共聚物.
除了 CuAAC 點(diǎn)擊反應(yīng)外, 近些年, 自由基介導(dǎo)的“巰基- 烯(thiol-ene)”和“巰基-炔(thiol-yne)”反應(yīng)也被報(bào)道應(yīng)用于制備糖聚肽高分子. 2010 年, Schlaad 等[95]首先合成了單分散(PDI＜1.10)的聚(烯丙基甘氨酸)及聚乙二醇-嵌段-聚(烯丙基甘氨酸), 并通過(guò)光或者熱引發(fā)的“巰基-烯”點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng), 以幾乎定量的收率得到半乳糖接枝的糖聚肽高分子. 該過(guò)程避免了繁瑣的糖分子保護(hù)-脫保護(hù)反應(yīng), 并且反應(yīng)過(guò)程中不需要使用金屬催化劑[96]. 隨后, Schlaad 等[97,98]進(jìn)一步研究了通過(guò)“巰基-炔”反應(yīng)將巰基功能化糖分子鍵合到聚(炔丙基甘氨酸)側(cè)鏈上制備糖聚肽高分子. 結(jié)果表明, 在炔基上鍵合第1 個(gè)巰基功能化糖分子的效率高于 90%, 但由于空間位阻的限制, 第 2 個(gè)糖分子接枝效率較低, 即使采用過(guò)量的巰基功能化糖分子, 最終偶聯(lián)的糖分子與炔基物質(zhì)的量之比不超過(guò) 1.5. 遺憾的是, 聚(烯丙基甘氨酸)和聚(炔丙基甘氨酸)在常用有機(jī)溶劑和水中溶解性均很差, 這限制了高分子量聚氨基酸的合成及后續(xù)糖分子接枝反應(yīng)的效率.
除此之外, Deming 和 Kramer[99,100]直接采用天然氨基酸——甲硫氨酸為原料制備聚(L-甲硫氨酸), 并在其側(cè)鏈通過(guò)一種類(lèi)似于“點(diǎn)擊”反應(yīng)的“甲硫氨酸烷基化”反應(yīng), 將含有碘基、三氟甲磺酸酯基或環(huán)氧基功能化的糖分子鍵合到聚氨基酸側(cè)鏈上形成糖聚肽高分子. 該反應(yīng)直接采用廉價(jià)易得的天然氨基酸, 不需要側(cè)鏈修飾及基團(tuán)保護(hù), 并且可以和其它氨基酸進(jìn)行共聚, 其官能團(tuán)對(duì)脫保護(hù)反應(yīng)條件等均具有良好的兼容性.
到目前為止, 已有數(shù)十種功能聚氨基酸被合成出來(lái), 并通過(guò)后續(xù)“點(diǎn)擊”反應(yīng)制備得到糖聚肽, 具體分子結(jié)構(gòu)在表 1 中表示. 繼續(xù)豐富和發(fā)展可“點(diǎn)擊”聚氨基酸和糖基元的種類(lèi), 簡(jiǎn)化合成步驟, 提高接枝反應(yīng)的效率仍是目前研究的重點(diǎn).
2.2 利用點(diǎn)擊反應(yīng)制備含糖 NCA 單體, 再通過(guò)開(kāi)環(huán)聚合制備糖聚肽
糖聚肽高分子的另一種合成方法是直接利用含糖NCA 單體開(kāi)環(huán)聚合. 含糖 NCA 單體的制備和應(yīng)用可以追溯到 19 世紀(jì) 60 年代. Rüde 等[101]在 1966 年首次合成了含葡萄糖分子的絲氨酸 NCA 單體, 但受限于含糖NCA 單體的純度, 無(wú)法開(kāi)環(huán)聚合得到高分子量糖聚肽. 之后雖有含糖 NCA 單體合成方法的陸續(xù)報(bào)道, 但純度問(wèn)題始終未得到有效解決. 直到2010年, Deming等[102]報(bào)道了一種利用快速柱層析法(flash chromatography)對(duì)所制備的含糖賴氨酸-NCA 單體進(jìn)行純化的方法, 首次解決了含糖 NCA 單體純度較低的問(wèn)題. 隨后, 才有一些含糖NCA 單體被合成出來(lái), 并應(yīng)用到糖聚肽的制備當(dāng)中.
其中, 點(diǎn)擊反應(yīng)為含糖 NCA 單體的制備提供了新的思路. 2012 年, Deming 等[103]報(bào)道了一種以 L-半胱氨酸或 L-高半胱氨酸為起始原料, 通過(guò)“巰基-烯”點(diǎn)擊化學(xué)方法, 將全乙�；Ｗo(hù)半乳糖或葡萄糖分子高效地鍵 合 到 氨 基 酸 上 形 成 氨 基 酸 - 糖 綴 合 物 (glyco-Cys NCA), 進(jìn)一步通過(guò) Leuch 反應(yīng)進(jìn)行環(huán)合, 快速柱層析分離后, 得到高純度糖分子鍵合的 NCA 單體. 該單體可以通過(guò)(PMe3)4Co 引發(fā)開(kāi)環(huán)聚合, 糖聚肽的鏈長(zhǎng)隨單體/引發(fā)劑比例線性增長(zhǎng), 聚合度最高可以達(dá)到 200, 且分子量分布較窄(PDI＜1.2) (Scheme 7). 之后, Schlaad 等[104]發(fā)展了一種通過(guò)“巰基-烯”反應(yīng)直接將巰基功能化全乙�；Ｗo(hù)半乳糖分子鍵合到烯丙基甘氨酸 NCA上, 原位合成含糖 NCA 單體(Scheme 8), 大大簡(jiǎn)化了含糖 NCA 單體的制備純化步驟. 通過(guò)控制巰基化糖分子的接枝比, 開(kāi)環(huán)聚合后可以獲得側(cè)基同時(shí)含有烯丙基和糖基元的糖聚肽高分子.
采用含糖 NCA 單體開(kāi)環(huán)聚合制備糖聚肽的方法, 雖然能有效避免聚合后修飾帶來(lái)的接枝反應(yīng)不完全的問(wèn)題, 但含糖 NCA 單體的制備和純化是難點(diǎn), 目前僅有為數(shù)不多的單體被合成出來(lái)并成功應(yīng)用于后續(xù)糖聚肽制備當(dāng)中, 具體結(jié)構(gòu)如圖 4 所示. 因此, 如何利用高效而便于操作的有機(jī)合成反應(yīng)制備純化含糖 NCA 單體, 并擴(kuò)展含糖 NCA 單體的種類(lèi)是目前研究的重點(diǎn)方向.
2.3 通過(guò)點(diǎn)擊反應(yīng)將糖基元與聚氨基酸/多肽鏈末端進(jìn)行偶聯(lián)制備糖聚肽類(lèi)似物
為克服上述兩種聚糖肽合成制備中存在的步驟繁瑣、純化困難、單體種類(lèi)有限等不足, 近些年, 科研工作者嘗試通過(guò)點(diǎn)擊反應(yīng)將糖基元偶聯(lián)到聚氨基酸/多肽鏈末端制備糖聚肽類(lèi)似物, 以期進(jìn)一步拓展糖聚肽及其類(lèi)似物的種類(lèi). 采用這種方法, 可以有效地將天然單糖[105]、雙糖[106]、低聚糖、多糖[37,107,108]以及人工合成糖聚合物[109]偶聯(lián)到聚氨基酸/多肽鏈末端, 制備線性、枝狀等不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的聚合物. 這些豐富結(jié)構(gòu)的糖聚肽類(lèi)似物, 為糖組學(xué)(Glycomics)的研究以及疾病的診斷和治療提供了新途徑. 同時(shí), 人工合成兩親糖聚肽類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)和組成更易于進(jìn)行聚合物親疏水比例及理化性能的調(diào)控, 有利于進(jìn)一步可控制備球形、纖維狀及蠕蟲(chóng)狀膠束和囊泡自組裝體. Lecommandoux 小組[37,90,107,110～112]首先采用 3-疊氮丙胺引發(fā) γ-芐基-L-谷氨酸酯-NCA 單體開(kāi)環(huán)聚合, 得到末端具有疊氮基團(tuán)的聚(γ-芐基-L-谷氨酸酯)(PBLG), 再通過(guò) CuAAC 反應(yīng)將末端炔基功能化的葡聚糖、透明質(zhì)酸、半乳聚糖等鍵合到疏水的 PBLG末端, 制備得到系列具有兩親性嵌段結(jié)構(gòu)的糖聚肽類(lèi)似物. 其中 PBLG 的 α-螺旋結(jié)構(gòu)有利于層狀結(jié)構(gòu)聚集體的形成, 且 DOX 負(fù)載自組裝納米顆粒表面的透明質(zhì)酸可以特異性靶向過(guò)表達(dá) CD44 受體的癌細(xì)胞.
Wang 等[109]運(yùn)用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)活性自由基聚合、NCA 開(kāi)環(huán)聚合和“ li k”偶聯(lián)的組合合成方法, 制備了含有側(cè)掛半乳糖基和 PBLG 的兩親嵌段共聚物 PMAgala-SS-PBLG. 首先制備了含有二硫鍵且末端疊氮基功能化的 RAFT 鏈轉(zhuǎn)移劑, 并對(duì)丙酮保護(hù)的甲基丙烯酸半乳糖酯單體 MAIpGP 進(jìn)行聚合, 制備得到疊氮基功能化的糖聚合物, 再通過(guò) CuAAC 反應(yīng)和末端炔基功能化的 PBLG 偶聯(lián), 脫除半乳糖保護(hù)基后得到目標(biāo)聚合物. 該合成策略可以有效調(diào)控糖聚合物以及聚氨基酸嵌段的長(zhǎng)度, 在保留半乳糖嵌段生物活性和聚氨基酸嵌段 α-螺旋結(jié)構(gòu)的同時(shí), 界面二硫鍵的引入可以實(shí)現(xiàn)兩親自組裝膠束在 HepG2 肝腫瘤細(xì)胞內(nèi)的還原響應(yīng)性藥物釋放, 有望作為高生物相容性的肝靶向高效藥物輸送載體得到進(jìn)一步應(yīng)用(Scheme 9).
在具有不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的糖聚肽的制備方面, 也有點(diǎn)擊反應(yīng)的相關(guān)應(yīng)用報(bào)道. Gu等[113]通過(guò)CuAAC反應(yīng)將三代精氨酸樹(shù)狀大分子成功偶聯(lián)到乳糖酸修飾的普魯蘭多糖上, 制備了兩親樹(shù)狀糖聚肽 LP-g-G3P, 其負(fù)載抗腫瘤藥物 DOX 的自組裝復(fù)合膠束能特異性抑制肝癌細(xì)胞的增殖. Lecommandoux等[114]首先制備了聚(γ-芐基-L-谷氨酸酯)-嵌段-聚(D/L-炔丙基甘氨酸)(PBLG-b-PPAG5)共聚物, 繼而在炔基末端通過(guò)“ li k”策略偶聯(lián)大分子葡聚糖, 制備了樹(shù)枝狀糖聚肽類(lèi)似物, 并研究了其溶液自組裝行為(圖 5). Yan 等[115]采用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)可控自由基聚合、N-羧基環(huán)丙酸酐(NCA)開(kāi)環(huán)聚合和“ li k”偶聯(lián)組合方法, 制備了兩親多臂共聚物, 隨后將近紅外熒光探針和 DOX 共價(jià)偶聯(lián)到聚氨基酸嵌段上. 該大分子藥物不僅具有 pH 響應(yīng)性和近紅外光成像特性, 同時(shí)表面接枝的半乳糖分子能通過(guò)受體靶向增強(qiáng)肝細(xì)胞的內(nèi)吞能力. Chan-Park 等[116]采用類(lèi)似的多反應(yīng)組合策略, 制備了四臂星狀糖聚肽類(lèi)似物 P(GlyEMA)-P(Lys) (Scheme 10). 其中, 聚賴氨酸兩臂有抗菌活性, 糖聚合物兩臂在提高聚合物對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞相容性的同時(shí)有效增強(qiáng)同靶向細(xì)菌的結(jié)合作用. 因而, 采用該聚合物合成策略制備的四臂糖聚肽類(lèi)似物, 能夠有效利用糖分子和氨基酸獨(dú)特的生物活性, 為抗菌材料的制備提供了新思路.
3 結(jié)語(yǔ)及展望
關(guān)于糖聚肽合成策略及功能化應(yīng)用的研究是目前化學(xué)、材料科學(xué)及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重要的前沿研究方向. 大部分有關(guān)糖聚肽合成方法的研究工作均發(fā)表于 2010年以后, 且其在生物醫(yī)用方面的應(yīng)用也剛剛起步, 尚有大量未知的領(lǐng)域需要探索. 例如, 利用人工合成糖聚肽深入研究糖蛋白的結(jié)構(gòu)及功能, 仿生模擬天然層狀結(jié)構(gòu)蛋白(如膠原、角蛋白等), 利用糖聚肽對(duì)生物活性物質(zhì)進(jìn)行識(shí)別、檢測(cè)、分離和提純, 調(diào)控細(xì)胞黏附、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化等. 這些應(yīng)用的推進(jìn)均離不開(kāi)糖聚肽合成技術(shù)的發(fā)展.
點(diǎn)擊反應(yīng)的發(fā)展大大促進(jìn)了糖聚肽的合成制備, 得益于其具有的反應(yīng)條件溫和、效率高、對(duì)功能性基團(tuán)耐受性好和產(chǎn)物易于提純等優(yōu)點(diǎn), 已被證實(shí)是一種高效實(shí)用的反應(yīng). 但是, 采用聚合后修飾法及糖苷化-NCA 單體開(kāi)環(huán)聚合法制備糖聚肽的策略, 仍然存在接枝反應(yīng)非定量、合成純化步驟繁瑣、單體種類(lèi)有限等不足. 未來(lái),在基于糖聚肽的合成方面還有很大的發(fā)展空間需要開(kāi)拓, 主要包括以下幾個(gè)方面: (1)簡(jiǎn)化制備路線, 縮短合成步驟, 發(fā)展高效提純策略; (2)發(fā)展更加綠色的點(diǎn)擊聚合反應(yīng), 如以水、離子液體作為溶劑, 且無(wú)金屬催化(Metal Free)的點(diǎn)擊聚合反應(yīng), 如光催化反應(yīng)、有機(jī)催化反應(yīng)和酶模型催化反應(yīng)等; (3)開(kāi)發(fā)更加高效、普適、功能化的(如智能響應(yīng)和生物活性)單體和與單體相匹配的點(diǎn)擊反應(yīng)類(lèi)型, 拓展糖聚肽高分子的種類(lèi); (4)合成序列結(jié)構(gòu)精確可控的糖聚肽高分子; (5)繼續(xù)制備具有豐富拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[如超支化結(jié)構(gòu)、對(duì)稱/不對(duì)稱高級(jí)結(jié)構(gòu)、大環(huán)結(jié)構(gòu)以及特殊的 3D 結(jié)構(gòu)(如 Janus, Cubic, Origami 和Inclusion)和理化與生物功能(如分子識(shí)別、受體靶向、膜通道模擬、信號(hào)傳導(dǎo)和分子伴侶)的糖聚肽. 在此基礎(chǔ)上, 以上述功能糖聚肽作為組裝基元, 進(jìn)一步采用超分子組裝和納米聚集體可控合成方法, 制備得到基于功能糖聚肽的仿生納米組裝體, 為其后續(xù)的生物醫(yī)學(xué)功能化應(yīng)用提供基礎(chǔ).
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