[摘 要] 目的：探討靶向融合肽IL-4Rα-lytic對(duì)卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV）陽性原發(fā)性滲出性淋巴瘤（PEL）細(xì)胞的體內(nèi)外殺傷作用及其安全性。方法：應(yīng)用 MTT 法檢測(cè) IL-4Rα -lytic 對(duì) KSHV 陽性PEL細(xì)胞BCBL-1和BCP-1的殺傷能力。通過FCM檢測(cè)IL-4Rα-lytic 誘導(dǎo) KSHV 陽性 PEL 細(xì)胞凋亡的情況。建立 BCBL-1 細(xì)胞小鼠移植瘤模型，連續(xù)3周（3次/周）腹腔注射IL-4Rα-lytic后，通過活體生物發(fā)光成像技術(shù)評(píng)估IL-4Rα-lytic對(duì)小鼠體內(nèi)BCBL-1細(xì)胞移植瘤的抑制效果，并通過H-E染色和全血分析法檢測(cè)其毒副作用。結(jié)果：靶向融合肽IL-4Rα-lytic在體外對(duì)兩種KSHV陽性PEL細(xì)胞BCBL-1和BCP-1均有選擇性殺傷作用（均 P<0.01），并且可以在短時(shí)間內(nèi)發(fā)揮殺傷作用（均 P<0.01）。靶向融合肽 IL-4Rα-lytic 可誘導(dǎo) KSHV 陽性 PEL 細(xì)胞BCBL-1和BCP-1凋亡（均P<0.05）。靶向融合肽IL-4Rα-lytic顯著抑制BCBL-1細(xì)胞小鼠移植瘤的生長(zhǎng)，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并且無明顯的器官毒性（均P>0.05），同時(shí)不會(huì)造成體質(zhì)量異常（P>0.05）。結(jié)論：靶向融合肽IL-4Rα-lytic在體內(nèi)外均顯著抑制KSHV陽性PEL細(xì)胞的生長(zhǎng)，且無明顯毒副作用，有望為PEL的治療提供一種新的治療方案。
原發(fā)性滲出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）是一種罕見的霍奇金淋巴瘤，主要表現(xiàn)為腹水、胸腔積液和心包積液等[1-2]。PEL的惡性程度高，常規(guī)化療藥物治療效果不佳，預(yù)后極差，患者中位生存期少于6個(gè)月[3-4]，因此亟待研發(fā)安全有效的治療手段。PEL 通 常 與 卡 波 西 肉 瘤 相 關(guān) 皰 疹 病 毒（Kaposisarcoma-associated herpesvirus，KSHV）感染相關(guān)[5-9]。本課題組前期的研究結(jié)果[10-11]顯示，處于KSHV感染潛伏期的 PEL 細(xì)胞均不同程度地過表達(dá) IL-4Rα，而KSHV 陰性細(xì)胞則不表達(dá)或低表達(dá) IL-4Rα；過表達(dá)IL-4Rα引起JAK1-PI3K-Akt信號(hào)通路的組成型激活，從而促進(jìn)潛伏期腫瘤的生長(zhǎng)。研究結(jié)果[12-13]發(fā)現(xiàn)，IL-4R高表達(dá)與多種類型惡性腫瘤相關(guān)，并在以其為治療靶點(diǎn)的研究中觀察到藥物對(duì)腫瘤長(zhǎng)期、持續(xù)的療效。上述研究結(jié)果均提示，IL-4Rα可能是KSHV陽性PEL的潛在治療靶點(diǎn)。利用帶負(fù)電的膜磷脂酰絲氨酸在多數(shù)腫瘤與正常細(xì)胞細(xì)胞膜上表達(dá)水平的差異，PAPO等[14]合成非對(duì)映體裂解肽（包含D-和L-形式的亮氨酸和賴氨酸等15個(gè)氨基酸），并發(fā)現(xiàn)此裂解肽能夠因癌細(xì)胞表面酸性成分的靜電吸引而具有一定的細(xì)胞選擇性，隨后通過類似陽離子抗菌肽的工作原理裂解細(xì)胞膜。KOHNO等[15]在此基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化氨基酸序列設(shè)計(jì)了裂解肽 Lytic，減少了對(duì)正常細(xì)胞的殺 傷 。之 后 ，YANG 等[16]設(shè) 計(jì) 的靶向融合肽IL-4Rα-lytic 含 有 靶 向 IL-4Rα 的 靶 向 肽和裂解肽Lytic 兩個(gè)片段，可特異地靶向多種類型表達(dá)IL-4Rα受體的腫瘤細(xì)胞（如胰腺癌、乳腺癌等細(xì)胞）。本研究旨在檢測(cè)靶向融合肽IL-4Rα-lytic對(duì)KSHV陽性PEL細(xì)胞的體內(nèi)外殺傷效果，并分析其安全性，為PEL的治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。
材料與方法
人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系BCBL-1、BCP-1和BJAB由本室保存，熒光素酶標(biāo)記的BCBL-1細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[17]。所有細(xì)胞均采用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，于 37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6周齡、體質(zhì)量20 g左右的雌性NOD/SCID小鼠購自維通達(dá)生物技術(shù)有限公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：20210402Abzz0619000685）。CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，AnnexinⅤ-APC/PI試劑盒購自 BD Biosciences 公司。IVIS Spectrum 活體光學(xué)成像系統(tǒng)購自美國珀金埃爾默公司，熒光素底物購自翌圣生物科技股份有限公司，正倒置一體熒光顯微鏡購自美國ECHO公司，pocH-100i全自動(dòng)血液分析儀購自日本希森美康公司。組織切片和H-E染色由武漢賽維爾生物科技有限公司完成。
IL-4Rα-lytic 和 Lytic多肽均用固態(tài)合成法合成（純度>95%），并經(jīng)過質(zhì)譜分析驗(yàn)證。多肽溶解在 PBS（pH=7.4）中。IL-4Rα-lytic: KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK（有下劃線的氨基酸為D型氨基酸）；Lytic: KLLLKLLKKLLKLLKKK（有下劃線的氨基酸為D型氨基酸）。
將密度為 5×105個(gè)/mL 的 KSHV 相關(guān)細(xì)胞（包括KSHV陽性PEL細(xì)胞BCBL-1、BCP-1和KSHV 陰性細(xì)胞BJAB）懸液接種于96孔板（50 µL/孔），然后加入2.5、5、10或20µmol/L的IL-4Rα-lytic或Lytic溶液（50 µL/孔），于 37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2 h后，每孔加入CCK-8試劑10 µL，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔細(xì)胞的光密度（D）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組D450/對(duì)照組D450×100%）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
將 密 度 為 1×106 個(gè)/mL 的 BCBL-1、BCP-1 和BJAB 細(xì)胞置于 12 孔板中，分別加入 IL-4Rα-lytic 和Lytic 溶液（終濃度均為 5 µmol/L），同時(shí)對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基，37 ℃下處理2 h。離心、冷染色緩沖液洗滌后，用 100 µL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。每管依次加入 0.5 µL Annexin Ⅴ-APC 和 1 µL PI，室溫下避光 15 min，加 400 µL 結(jié)合緩沖液，混勻，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
將熒光素酶標(biāo)記的 BCBL-1 細(xì)胞經(jīng)腹腔注射至NOD/SCID小鼠體內(nèi)（注射劑量為1×107個(gè)細(xì)胞/只），建立小鼠異種移植模型。細(xì)胞植入后第9天，小鼠腹腔注射熒光素底物（150 mg/kg），利用活體生物發(fā)光成像技術(shù)檢測(cè)小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況。隨后，將具有相似信號(hào)強(qiáng)度的荷瘤小鼠隨機(jī)分成 PBS 組（對(duì)照組）和 IL-4Rα-lytic 組（4 只/組），經(jīng)腹腔分別注射PBS 和 IL-4Rα-lytic（5 mg/kg），每周 3 次，連續(xù) 3 周。在藥物治療過程中，每 2~3 d 稱量一次小鼠體質(zhì)量。3周后，再次進(jìn)行活體光學(xué)成像檢測(cè)移植瘤的大小，然后經(jīng)尾靜脈取血，用全自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行血液分析。第 23 天時(shí)處死小鼠，切取肺、肝和腎組織標(biāo)本，經(jīng)固定、石蠟包埋、H-E染色后，在正倒置一體熒光顯微鏡下觀察并拍照。
采用 GraphPad Prism 6 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以xˉ±s 表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05或P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié) 果
用5 µmol/L的IL-4Rα-lytic處理2 h后，F(xiàn)CM檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，與對(duì)照組和Lytic組比較，IL-4Rα-lytic組 KSHV 陽性 BCBL-1 和 BCP-1 細(xì)胞凋亡率均顯著升高（均P<0.05），而KSHV陰性BJAB細(xì)胞凋亡率未見明顯變化。說明，IL-4Rα-lytic 可在體外選擇性誘導(dǎo)KSHV陽性PEL細(xì)胞凋亡而殺傷腫瘤細(xì)胞。
PEL惡性程度高、預(yù)后較差、長(zhǎng)期生存者少，目前主要采用CHOP方案化療和逆轉(zhuǎn)錄病毒治療法聯(lián)用進(jìn)行治療。但是，常規(guī)治療所用藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生殺傷，同時(shí)腫瘤細(xì)胞的耐藥性也影響著治療效果。此外，PEL不常見，臨床研究多局限于個(gè)案報(bào)道，可用的特效藥物少，因此研發(fā)新型的毒副作用小的靶向治療藥物并探究其作用機(jī)制對(duì)于治療PEL意義重大。
小分子短肽因其具有良好的腫瘤穿透能力、無耐藥性問題、易于合成修飾和低免疫原性[17-21]等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為腫瘤治療的熱點(diǎn)。本研究所使用的細(xì)胞裂解肽Lytic是由17個(gè)氨基酸組成的短肽，帶正電荷，而腫瘤細(xì)胞表面負(fù)電性的磷脂酰絲氨酸水平略高于正常細(xì)胞，因此該裂解肽Lytic對(duì)于腫瘤細(xì)胞的殺傷略強(qiáng)于正常細(xì)胞。同時(shí)，由于裂解肽含有D型氨基酸，能有效防止其被蛋白水解酶水解，從而延長(zhǎng)作用時(shí)間[21]。將能靶向IL-4Rα的靶向肽與Lytic結(jié)合，可選擇性殺傷 PEL 細(xì)胞，同時(shí)減少對(duì)正常細(xì)胞的殺傷。靶向融合肽 IL-4Rα-lytic 殺傷 BJAB 細(xì)胞的 IC50分別是殺傷BCBL-1、BCP-1細(xì)胞的3.4和2.8倍，同時(shí)裂解肽 Lytic 殺傷 BCBL-1、BCP-1 細(xì)胞的 IC50分別是 IL-4Rα-lytic 的 11.0 和 7.7 倍。這說明，相比較于KSHV 陰性細(xì)胞，IL-4Rα-lytic 對(duì) KSHV 潛伏感染的PEL細(xì)胞有選擇性殺傷作用。為分析其殺傷機(jī)制，本研究進(jìn)行了短時(shí)間的殺傷活性以及促凋亡能力的測(cè)定，快速的殺傷及促凋亡提示靶向融合肽 IL-4Rα-lytic通過穿膜和誘導(dǎo)凋亡兩種方式來達(dá)到殺傷PEL細(xì)胞的目的。小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-4Rα-lytic 經(jīng)由腹腔注射能顯著抑制BCBL-1細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)于肺、肝、腎等器官均無明顯毒副作用，各項(xiàng)血液檢測(cè)指標(biāo)正常，提示IL-4Rα-lytic的安全性較高。
總之，本研究提供了一種針對(duì)PEL的特異性強(qiáng)、安全性高的靶向融合肽 IL-4Rα-lytic，為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和PEL的治療提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
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