摘要:通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)策略及固相合成法設(shè)計(jì)并篩選具有全新結(jié)構(gòu)的αvβ6多肽配體,并用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定多肽配體與αvβ6的結(jié)合親和力,建立αvβ6多肽配體的篩選方案.首 先 用 Sybyl-X1.3 對αvβ6 多 肽 配 體 及 天 然 配 體 進(jìn) 行 分 子 對 接;其 次 用Amber16對分子對接結(jié)果進(jìn)行分子動力學(xué)模擬,確定多肽配體與αvβ6蛋白之間的結(jié)合模式,并以 RGDLXXL(X為任意氨基酸)為多肽配體核心結(jié)構(gòu),通過逐步延伸氨基酸構(gòu)建虛擬肽庫,篩選獲得長度為7~10個氨基酸的多肽配體,進(jìn)一步通過相似氨基酸替換的方法設(shè)計(jì)篩選不同于 RGDLXXL核心的新的多肽配體;最后用固相合成法合成新設(shè)計(jì)的多肽配體,利用間接 ELISA 法測定多肽配體-αvβ6的結(jié)合親和力.已有多肽配體和天然配體的分子對接以及分子動力學(xué)模擬結(jié)果表明,αvβ6與配體的結(jié)合主要通過 Asp218和多肽配體之間形成氫鍵,以及 Mg2+ 和多肽配體形成金屬螯合作用完成.結(jié)合虛擬組合篩選與相似氨基酸替換,發(fā)現(xiàn)GRTDLGTLLFR,GRRTDLATIHG,RTDVGRVRGRG 和 RGDVGRVGR 等多肽均滿足該結(jié)合模式,RTDVGRVRGRG 與αvβ6的親和力為10.76μmol/L.可見 RTDVGRVRGRG與αvβ6親和力良好,是一條全新的αvβ6多肽配體.
目前文獻(xiàn)報道的靶向αvβ6配體包括小分子配體和多肽類配體,其中多肽類配體主要包括定向工程化噬菌體展示獲得的多肽 R01和 S02[4],基于向日葵胰蛋白酶抑制劑噬菌體展示篩選得到的多肽SFLAP3[5],源于口蹄疫病毒外殼的多肽 A20FMDv2[6],噬菌體展示文庫篩選得到的多肽 DLXXL[7],以及天然配體 Pro-TGF-β1和 TGF-β3[8].其中[18F]氟苯甲�；鶚�(biāo)記的肽[18F]FBA-A20FMDv2已在人類臨床試驗(yàn)中用作 PET 放射性示蹤劑,用于特發(fā)性肺纖維化的診斷和治療評估.研究表明,盡管多肽配體沒有直接的抗癌活性,但可以作為分子成像載體用于癌癥等疾病診斷,以及通過與藥物或納米粒的偶聯(lián)進(jìn)行整合素靶向腫瘤治療.靶向整合素放射藥物已是比較成熟的研究方向,此類藥物結(jié)合了兩種關(guān)鍵元素:一種靶向化合物/配體和一種放射性同位素[9].靶向放射性藥物可以與腫瘤組織中的特異性靶點(diǎn)結(jié)合并聚集,通過放射性射線產(chǎn)生電離輻射作用,由于正常組織細(xì)胞與腫瘤組織細(xì)胞對射線的敏感性 不 同,因 此 可 以 實(shí) 現(xiàn) 腫 瘤 的 靶 向 治 療 或 根 據(jù) 放 射 性 射 線 對 腫 瘤 進(jìn) 行 精 準(zhǔn) 診 斷.如177Lu-PSMA-617(Novartis)即將被批準(zhǔn)用于前列腺癌的診療[10],由北京大學(xué)王凡課題組研發(fā)的中國首個核醫(yī)學(xué)腫瘤顯像診斷1類新藥99mTc-3PRGD2已完成三期臨床[11].因此開發(fā)具有靶向αvβ6作用的多肽配體具有重要意義.
針對目前αvβ6結(jié)合多肽基本含有 RGDLXXL(X 為任意氨基酸)核心結(jié)構(gòu),且該結(jié)構(gòu)處于專利保護(hù)范圍內(nèi),本文擬篩選設(shè)計(jì)非專利范圍內(nèi)全新結(jié)構(gòu)的αvβ6結(jié)合多肽配體.先通過分子模擬方法分析αvβ6與多肽配體的結(jié)合模式,再通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法發(fā)現(xiàn)一種全新結(jié)構(gòu)的αvβ6多肽配體,該配體具有良好的結(jié)合親和力,可為后續(xù)的靶向αvβ6多肽和多肽-核素復(fù)合物研究提供理論與實(shí)際研究指導(dǎo),是一個具有發(fā)展前景的先導(dǎo)化合物.
1 材料與方法
Fmoc-氨基酸(上海麥克林生化科技股份有限公司),2-氯代三苯甲基氯-樹脂(阿拉丁試劑(上海)有限公司),二氯甲烷(DCM)、二甲基甲酰胺(DMF)、二異丙基乙胺(DIEA)和乙腈等(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有 限 公 司),人 整 合 素 αvβ6 蛋 白 (MedChemExpressLLC)、鏈 霉 親 和 素-辣 根 過 氧 化 物 酶(Streptavidin-HPR)和 3,3′,5,5′-四 甲 基 聯(lián) 苯 胺 (TMB)顯 色 液 (上 海 碧 云 天 生 物 技A20FMDv2(術(shù) 有 限 公 司),NAVPNLRGDLQVLAQKVART)、A20FMDv2-Biotin(Biotin-NAVPNLRGDLQVLAQKVART)和 A20FMDv2-GRD(NAVPNLGRDLQVLAQKVART)(核欣(蘇州)醫(yī)藥科技有限公司),酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司).
液相制備色譜儀(LC-20AP 型,日本島津公司);三重四級桿液-質(zhì)聯(lián)用儀(AGILENT6470 型,美國安捷倫科技有限公司);全波長酶標(biāo)儀(MultiskanSkyHigh型,美國賽默飛世爾科技公司).
采用 Sybyl-X1.3 進(jìn) 行 分 子 對 接,靶 蛋 白αvβ6 源 自 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 數(shù) 據(jù) 庫 (Protein Data Bank,http://www.rcsb.org,ID:5FFO),配 體 來 源 于 文 獻(xiàn)、有 機(jī) 小 分 子 生 物 活 性 數(shù) 據(jù) 庫 (PubChem,https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)和藥物化學(xué)數(shù)據(jù)庫(Chembl,https://www.ebi.ac.uk/chembl/)等.使用Sybyl軟件的Surflex-Dock模塊,將蛋白晶體結(jié)構(gòu)中天然配體所在位置定義為活性結(jié)合口袋.利用Surflex-DockGeomX(SFXC)模塊進(jìn)行高精度分子對接,分子對接參數(shù):配體分子初始構(gòu)像數(shù)目為10,分子片段最大構(gòu)像數(shù)目為20,分子最大可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)據(jù)為100,其他參數(shù)默認(rèn).綜合結(jié)合構(gòu)像和對接打分構(gòu)建αvβ6-多肽復(fù)合物用于分子動力學(xué)模擬.
本文所有分子動力學(xué)模擬均在 Linux工作站用 Amber16[12]計(jì)算.αvβ6使用 FF14SB力場,多肽配體使用 GAFF力場和 AM1-BCC電荷,將多肽-蛋白體系浸沒于0.15mol/L氯化鈉溶液(TIP3P)的立方體盒子中,復(fù)合物距立方體盒子邊緣為1.00nm,體系包含98個 Na+ ,78個Cl- ,36206個水分子.模擬過程如下:首先進(jìn)行5步能量優(yōu)化,避免可能的分子碰撞;其次進(jìn)行兩步加熱,使體系溫度從0逐漸升溫到303.15K,并進(jìn)行溶液密度調(diào)整和體系平衡;最后在303.15K 下對系統(tǒng)(NPT)進(jìn)行100ns的動力學(xué)模擬,時間步長為2fs,壓力恒定為1個大氣壓.結(jié)合自由能以及能量分解計(jì)算由Amber的 MMPBSA.py程序完成[13],選取最后20ns進(jìn)行計(jì)算并取其平均結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)合模式分析,分析αvβ6與配體的結(jié)合模式.當(dāng)結(jié)合自由能的值為負(fù)值時,體系是穩(wěn)定的,且該值越小配體-受體結(jié)合親和力越高.
本文虛擬篩選由SYBYL-X1.3完成.首先以 RGDLXXL為基礎(chǔ),在5,6號位通過20種天然氨基酸的隨機(jī)組合建立一個含400條多肽的多肽文庫,通過 Rosetta軟件[14]對多肽進(jìn)行批量結(jié)構(gòu)優(yōu)化構(gòu)建虛擬肽庫,根據(jù)1.2.1節(jié)中定義的活性口袋進(jìn)行虛擬篩選,綜合結(jié)合構(gòu)像以及對接打分篩選出最佳結(jié)合七肽.然后將篩選出的七肽作為核心逐步延長多肽鏈,同理篩選出最佳結(jié)合八肽、九肽和十肽用于進(jìn)一步研究.結(jié)合模式分析結(jié)果表明,現(xiàn)有多肽配體與αvβ6的結(jié)合主要為九肽和十肽核心結(jié)構(gòu),因此將篩選出的九肽、十肽和骨架 RGDLXXL進(jìn)行氨基酸替換,如亮氨酸可替換為纈氨酸,二者等電點(diǎn)相近,分別為5.98和5.96,側(cè)鏈結(jié)構(gòu)相似,分別為異丙基和異丁基,二者均為帶疏水性側(cè)鏈的脂肪族氨基酸,氨基酸替換時在改變多肽結(jié)構(gòu)的同時盡量不改變其理化性質(zhì).在保持多肽關(guān)鍵結(jié)合氨基酸不變的情況下,進(jìn)一步構(gòu)建虛擬肽庫,通過與上一步相同的虛擬篩選、精準(zhǔn)對接、分子動力學(xué)模擬獲得最佳結(jié)合多肽配體,利用分子動力學(xué)模擬和結(jié)合自由能能量分解計(jì)算驗(yàn)證結(jié)構(gòu)改造的合理性.
人源αvβ6蛋白經(jīng)包被、封閉后,在孔板中加入待測配體溶液.其中空白組僅加入100μLTBS緩沖溶液;空白對照中加入 A20FMDv2-Biotin 和 TBS緩沖溶液各50μL;陽性對照加入 A20Biotin和 A20FMDv2(梯度)各50μL;陰性對照加入 A20FMDv2-Biotin和 A20FMFMDv2-Dv2-GRD各50μL;實(shí)驗(yàn)組加入 A20FMDv2-Biotin和待測多肽(梯度)各50Streptavidin-HRP用 PBST 稀 釋 100 倍,向 各 孔 加 入μ1L00.每組設(shè)置3個平行試驗(yàn).反應(yīng)2h后,μL,室 溫100μLTMB顯色液,立即將孔板置于酶標(biāo)儀中避光孵育,每5min振 搖 反 應(yīng) 后,向 各 孔 加 入讀取一次650nm 波長處的吸光度(A)值,共讀取1h(13個檢測點(diǎn)).
2 結(jié)果與討論
根據(jù) 高 效 液 相 色 譜 (HPLC)結(jié) 果,P1 純 度 為 98.461%,P2 純 度 為 95.749%,P3 純 度 為95.135%,P4純度為97.554%.根據(jù)LC-MS結(jié)果,P1計(jì)算的摩爾質(zhì)量為1248.42g/mol,測量的摩爾質(zhì)量為1249.00g/mol;P2計(jì)算的摩爾質(zhì)量為1196.31g/mol,測量的摩爾質(zhì)量為1196.70g/mol;P3計(jì)算的摩爾質(zhì)量為1171.31g/mol,測量的摩爾質(zhì)量為1171.35g/mol;P4計(jì)算的摩爾質(zhì)量為971.07g/mol,測量的摩爾質(zhì)量為971.25g/mol.可見,經(jīng) HPLC以及LC-MS分析,確定合成的多肽為本文研究的目標(biāo)產(chǎn)物.
本文通過分子對接與分子動力學(xué)模擬分析αvβ6與配體的結(jié)合模式,虛擬組合篩選獲得符合結(jié)合模式的全新結(jié)構(gòu)多肽,采用固相合成法合成多肽,通過間接 ELISA 法測定多肽配體與αvβ6的結(jié)合親和力.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:多肽配體 P3與αvβ6具有良好的結(jié)合親和力,略大于陽對照 A20FMDv2的結(jié)合親和力,基本符合設(shè)計(jì)預(yù)期.實(shí)驗(yàn)中 P2和 P4由于親和力較弱,僅存在陽性結(jié)果,無法計(jì)算其親和力值.P1雖然也有較強(qiáng)的αvβ6蛋白結(jié)合親和力,但其結(jié)構(gòu)仍具有 RGDLXXL核心,因此在后續(xù)的研究中可作為先導(dǎo)化合物改造其結(jié)構(gòu).P3和 P4雖都為氨基酸替換后篩選出的多肽,但其結(jié)合親和力差距較大.綜合分子對接和結(jié)合自由能相關(guān)計(jì)算結(jié)果,推測 P4活性較差的原因是其-VGRVGR-部分的空間位阻較小,而αv與β6亞基形成的結(jié)合空腔較大,二者結(jié)合時存在一定的結(jié)合不穩(wěn)定性.結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究表明,αvβ6不僅能識別 RGD序列,還能識別-LXXL-基序,該基序折疊成兩親性α-螺旋,結(jié)合至β6亞基殘基組成的疏水口袋中[15-17].研究中篩選出全新結(jié)構(gòu)多肽含有的-VXXV-序列也可以形成兩親性α-螺旋,該螺旋可與β6亞基形成更多氫鍵相互作用,RTD 序列也可以與αvβ6形成穩(wěn)定的氫鍵,表明了本文采用氨基酸替換方法的合理性.可見,計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法可有效提高藥物開發(fā)的成功率、降低研發(fā)成本并縮短研發(fā)周期,是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要方法.
文獻(xiàn)研究表明,整合素αvβ6的表達(dá)在許多腫瘤中顯著上調(diào),包括口腔鱗癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌等[18-20].整合素αvβ6的表達(dá)與許多癌種患者的生存率降低相關(guān),例如結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、非小細(xì)胞肺癌和宮頸鱗狀細(xì)胞癌等[21-25],并且可以通過纖維連接蛋白和膠原中的 RGD序列參與腫瘤細(xì)胞與胞外基質(zhì)的相互作用,該整合素的過度表達(dá)與上皮細(xì)胞向間充質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān),可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移,通常在腫瘤侵襲病灶的前沿部分中整合素的表達(dá)水平較高.目前,靶向整合素成像已成為整合素研究熱點(diǎn)之一,包括正電子發(fā)射斷層掃描和單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描,整合素顯像劑可用于對患者分層進(jìn)行靶向治療、評估治療反應(yīng),并監(jiān)測腫瘤生長[26-30].由于大部分基礎(chǔ)生物學(xué)仍未完全了解,因此αvβ6為靶標(biāo)的治療腫瘤藥物也尚未開發(fā),但其仍有作為診斷靶點(diǎn)的潛力.
綜上所述,本文采用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的方法設(shè)計(jì)了一條基于 RTDVXXV 全新結(jié)構(gòu)的αvβ6多肽配體,研究結(jié)果表明,該配體具有良好的結(jié)合親和力,配體分子可作為靶向αvβ6多肽或肽類結(jié)合物開發(fā)的候選分子,為未來αvβ6結(jié)合配體的開發(fā)提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).
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