摘要：刺激響應(yīng)聚多肽是一類能夠在外界刺激下發(fā)生物理形態(tài)或化學(xué)組成變化的高分子材料，本文介紹了聚多肽的合成方法，并從氧化還原、溫度、A5、光照這四個(gè)環(huán)境因素出發(fā)，總結(jié)了近年來(lái)新發(fā)展的具有刺激響應(yīng)性的聚多肽類材料。同時(shí)也對(duì)這些材料在藥物運(yùn)輸、生物技術(shù)方面的應(yīng)用前景進(jìn)行了簡(jiǎn)要?dú)w納。
多肽是a-氨基酸以肽鍵為主鏈連接起來(lái)的寡聚物或者大分子,多肽的一個(gè)顯著特性在于它們具有豐富的多層次結(jié)構(gòu),多肽側(cè)鏈的R取代基序列構(gòu)成了多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)主鏈的氫鍵作用，多肽還可以形成、螺旋、折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)；進(jìn)一步地，帶有不同側(cè)鏈官能團(tuán)的多肽還可以通過(guò)二硫鍵等動(dòng)態(tài)共價(jià)鍵及多種非共價(jià)相互作用，如氫鍵、范德華力、π-π 堆積等使多肽發(fā)生折疊形成精確的三級(jí)結(jié) 構(gòu)[1] 。由于多肽類材料的結(jié)構(gòu)特性和仿生性質(zhì) , 它們?cè)谏镝t(yī)藥 、生物技術(shù) 、組織工程 、藥物運(yùn)輸?shù)阮I(lǐng)域 具有廣泛的應(yīng)用前景 , 人們對(duì)其的研究興趣日益提高[2] 。
多肽材料的制備主要通過(guò)多肽固相合成法和N-羧基內(nèi)酸酐(NCA)的開環(huán)聚合來(lái)實(shí)現(xiàn)。自從1963年Merrifield第一次報(bào)道多肽固相合成法以來(lái)[3],經(jīng)過(guò)數(shù)十年的發(fā)展,多肽固相合成法已經(jīng)能夠大規(guī)模 生產(chǎn)序列明確的短肽材料。其方法是將肽鏈端基的氨基酸負(fù)載在樹脂上,再依次完成隨后不同氨基酸的 縮合-脫保護(hù)-縮合步驟,重復(fù)數(shù)次完成需要的多肽序列后再將多肽從樹脂上整體脫除,側(cè)鏈保護(hù)基也一 并脫除,經(jīng)過(guò)高效液相色譜提純即可得到純品多肽。然而這一方法雖被人們廣泛采用,其缺點(diǎn)也是顯而 易見的:由于固相合成法是通過(guò)逐步反應(yīng)的方式實(shí)現(xiàn)肽鏈的增長(zhǎng),長(zhǎng)肽的合成費(fèi)時(shí)費(fèi)力,代價(jià)不菲。而隨 著肽鏈長(zhǎng)度的增加,即使對(duì)于單步反應(yīng)產(chǎn)率超過(guò)99%的縮合反應(yīng),其最終產(chǎn)率也會(huì)嚴(yán)重下降,目前人們 通過(guò)固相合成法得到的最長(zhǎng)多肽僅為50肽[4] 。
N-羧基內(nèi)酸酐(NCA)的開環(huán)聚合能夠在短時(shí)間里得到高分子量的多肽,明顯彌補(bǔ)了固相合成法的不足。同時(shí),通過(guò)對(duì)側(cè)鏈R基不同反應(yīng)基團(tuán)的引入,可以方便地得到功能化的聚多肽材料。最早的NCA開環(huán)聚合由Hermann Leuchs在1906年報(bào)道[5] 。之后在1921年,Curtius[6] 、wessely等[7]用水、醇和一級(jí)胺來(lái)引發(fā)NCA開環(huán)聚合,并第一次制備了高分子量的聚多肽材料。隨后人們嘗試用不同的親核試劑和有機(jī)堿引發(fā)NCA聚合,最常見的是胺類化合物和金屬醇鹽[8] 。由于在這樣的聚合中存在許多副反應(yīng), 聚合的控制并不好。近年來(lái),隨著NCA開環(huán)聚合的不斷發(fā)展,新型可控NCA聚合方法被相繼報(bào)道。第一個(gè)實(shí)現(xiàn)活性NCA開環(huán)聚合的是Deming,他使用零價(jià)鎳和鈷的共催化體系(例如(PMe3)4Co和bpyNi(COD),bpy=2,2-聯(lián)吡啶,COD=1,5-環(huán)辛二烯)得到了一系列具有很好的分子量控制和窄分子量分布的聚合物[9~12] 。2007年,Cheng和Lu發(fā)展出一種有機(jī)硅調(diào)控的NCA開環(huán)聚合體系[13] (例如HMDS,HMDS=六甲基二硅氮烷)。在這個(gè)體系中,N-三甲基硅基胺對(duì)NCA環(huán)親和進(jìn)攻后,三甲基硅基轉(zhuǎn)移到鏈末端的二氧化碳基團(tuán)處形成三甲基硅基氨基甲酸酯的結(jié)構(gòu),以此來(lái)穩(wěn)定聚合物鏈的末端,加速鏈增長(zhǎng),并最終實(shí)現(xiàn)活性聚合。2011年,Ling等將稀土金屬?gòu)?fù)合物引入到NCA開環(huán)聚合中(例如Re(OiPr)3,iPr=異丙基),并制備了分子量可控且分子量分布窄的隨機(jī)共聚物和嵌段共聚物,實(shí)現(xiàn)了NCA的可控聚合[14] 。
NCA的可控聚合極大地促進(jìn)了聚多肽的發(fā)展,其中一類具有廣闊應(yīng)用前景的材料是刺激響應(yīng)性聚多肽[15~19] 。刺激響應(yīng)性聚多肽是外界環(huán)境的刺激下(例如光、溫度、PH等),能夠發(fā)生物理形態(tài)或者化學(xué)組成改變的聚多肽材料。與其它刺激響應(yīng)性聚合物相比,聚多肽具有良好的生物相容性和穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu),這就更使得它在藥物運(yùn)輸、組織工程等領(lǐng)域具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。本綜述將從氧化還原、溫度、PH和光這四個(gè)角度對(duì)近幾年發(fā)展出的新型刺激響應(yīng)聚多肽材料進(jìn)行概述。
1 氧化還原響應(yīng)聚多肽
2013年 , Chen等[27] 同樣利用二硫鍵賦予聚合物氧化還原響應(yīng)性并最終實(shí)現(xiàn)可控的藥物釋放 。其工 作是利用疊氮和炔基的“Click”反應(yīng)將聚谷氨酸芐酯(PBLG)和聚葡萄糖結(jié)合 , 隨后進(jìn)行藥物的包裹 , 并 通過(guò)二硫鍵實(shí)現(xiàn)聚葡萄糖鏈間的交聯(lián) 。最終得到的包裹藥物后的膠束能夠在細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的刺激下 完成藥物的釋放 , 從而實(shí)現(xiàn)特異性的給藥治療。
最近 , Cheng等[28] 通過(guò) NCA開環(huán)聚合制備了側(cè)鏈含有巰基的正電荷螺旋聚多肽 , 它可以通過(guò)靜電 相互作用力與帶負(fù)電荷的 siRNA形成納米粒子 , 并進(jìn)一步通過(guò)二硫鍵的交聯(lián)得到尺寸更小且更為穩(wěn)定 的納米粒子 。這樣的納米粒子在癌細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的作用下可以實(shí)現(xiàn)高效的 siRNA 釋放 , 并且依然保 持螺旋聚多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu) , 從而實(shí)現(xiàn) siRNA 的高效運(yùn)輸及可控釋放 。
2014 年 , Dong等[29] 利用 mPEG-NH2 制備了側(cè)鏈帶有鄰硝基芐基的聚半胱氨酸 , 這樣的嵌段共聚物 在水中自組裝成囊泡結(jié)構(gòu) 。在 365nm紫外光照射下鄰硝基芐基脫除 , 得到的新聚合物自組裝成膠束結(jié) 構(gòu) 。而在 0. 1 M 過(guò)氧化氫作用下 , 裸露出的巰基通過(guò)二硫鍵交聯(lián) , 膠束的尺寸變小;在 DTT 的還原作用 下 , 二硫鍵被切斷 , 膠束又會(huì)變回原來(lái)的尺寸 。通過(guò)這樣的方式 , Dong等巧妙地構(gòu)建了同時(shí)具有光 、可逆 氧化還原響應(yīng)性的聚多肽 。隨后的載藥實(shí)驗(yàn)也表明這種氧化還原響應(yīng)性能夠?qū)崿F(xiàn)可控的藥物釋放 。
2 溫度響應(yīng)聚多肽
2011 年 , Li等報(bào)道了一種新型的寡聚乙二醇作為側(cè)鏈的聚谷氨酸 , 其溶解性 、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及低臨界 溶解溫度都隨側(cè)鏈 OEG 的長(zhǎng)度而改變[33] 。通過(guò)調(diào)節(jié)單體的手性或者將不同 OEG 側(cè)鏈長(zhǎng)度的 NCA 共 聚都能對(duì) LCST進(jìn)行調(diào)節(jié) �；谶@種溫度響應(yīng)性的 NCA單體 , Li等制備了其與 PEG 的共聚物 , 得到的 水凝膠同樣具有溫度響應(yīng)性 , 在不同的溫度下這種嵌段共聚物能夠發(fā)生溶膠-凝膠的轉(zhuǎn)換[34] 。隨后該課 題組又利用同樣的策略在半胱氨酸的巰基上接出 OEG側(cè)鏈 , 得到的聚多肽同樣具有 LCST[35] 。
這種聚多肽能夠形成兩親性納米粒子 , 當(dāng)溫度高于其 LCST 時(shí) , 納米粒子的藥物釋放速率會(huì)極大地增加 , 從而說(shuō)明溫度響應(yīng)聚多肽在藥物運(yùn)輸方面具有極大的潛在價(jià)值 。
另外有很大一部分工作圍繞用具有溫度響應(yīng)性的聚合物引發(fā)NCA聚合展開。這樣一類聚合物大引發(fā)劑中最廣泛為人們使用的是聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM) 的衍生物[37~41] ,其LCST在31℃~37℃,而LCST在10℃~40℃的聚合物在生物應(yīng)用方面具有更明顯的優(yōu)勢(shì)[42] 。例如,2008年zhang等用端基含有氨基的PNIPAM引發(fā)谷氨酸芐酯NCA(BLG-NCA)和叔丁氧羰基賴氨酸NCA(BLLYs-NCA)的共聚[43] 。脫除保護(hù)基后,得到的嵌段共聚物具有良好的水溶性以及隨PH變化的LCST。此外,聚多肽通過(guò)后修飾的方式接上PNIPAM制備溫度響應(yīng)材料也有報(bào)道[44~46] 。
3 PH響應(yīng)聚多肽
人體內(nèi)正常生理環(huán)境的胞外PH是7.4,而核內(nèi)體和溶酶體的PH則是4.5~6.5[47] ,這樣的差異使得PH響應(yīng)材料實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)藥物釋放成為可能。另一方面,腫瘤組織胞外環(huán)境的PH是5.7,這就使得PH響應(yīng)材料在癌癥治療中也有廣闊的應(yīng)用前景。近年來(lái),PH響應(yīng)聚多肽用作藥物運(yùn)輸載體成為人們研究的熱點(diǎn)之一[48] 。PH為中性時(shí),這些載體保持膠束或囊泡結(jié)構(gòu),內(nèi)部包裹特定的藥物分子。PH為酸性時(shí),膠束或囊泡的結(jié)構(gòu)瓦解,藥物分子釋放,從而完成對(duì)特定部位的給藥。通常來(lái)說(shuō),PH響應(yīng)的功能由側(cè)鏈帶氨基或羧基的聚多肽實(shí)現(xiàn),例如聚谷氨酸[49~51] 和聚賴氨酸[52~54] 。它們的溶解性隨PH變化。將這樣的片段與其它親水或疏水片段結(jié)合,就可以通過(guò)改變PH調(diào)控材料的自組裝行為。
Lecommandoux等[55]利用聚谷氨酸和聚賴氨酸的嵌段共聚物制備了PH響應(yīng)的囊泡。在近中性PH時(shí)(5<PH<9),兩嵌段都帶電并能很好地溶解在水中。在酸性(PH<4)時(shí),聚谷氨酸段被質(zhì)子化,形成α-螺旋構(gòu)型,并使得嵌段共聚物形成一種聚賴氨酸在兩側(cè),聚谷氨酸在中間的囊泡結(jié)構(gòu);在堿性(PH>10)時(shí)情況相反,形成聚賴氨酸在中間而聚谷氨酸在兩側(cè)的囊泡結(jié)構(gòu)。
最近,Hammond等[57]利用聚合后修飾的方法制備了一系列PH響應(yīng)聚多肽。他們先用甲氧基聚乙二醇胺引發(fā)炔丙基谷氨酸NCA聚合,得到兩嵌段共聚物,再通過(guò)“Click”反應(yīng)在后一段上修飾二異丙基胺、二乙胺等基團(tuán)。這些三級(jí)胺作為側(cè)鏈的聚多肽都是很強(qiáng)的質(zhì)子緩沖體系。在包裹藥物后(DOX),它們?cè)赑H7.0~7.4能以穩(wěn)定的膠體形式存在,而在PH5.5~6.3則迅速瓦解完成藥物的釋放。更進(jìn)一步的是Hammond等還在不同聚合物鏈中極少數(shù)(<0.1%)未反應(yīng)的炔基上分別修飾了Cy5.5和Cy7兩種熒光基團(tuán)。當(dāng)聚合物鏈彼此靠近時(shí),兩種熒光基團(tuán)會(huì)通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)成像,從而使 藥物載體的分布變的更為直觀。
Bae等[58~ 59] 報(bào)道了一系列基于組氨酸的 pH 響應(yīng)聚多肽并將其應(yīng)用于 DNA 和藥物分子的運(yùn)載中 。例如 , Bae等[60] 對(duì)比研究了側(cè)鏈接枝聚組氨酸和單個(gè)組氨酸的聚賴氨酸(PLL-g-PHis和 PLL-g-mHis), 發(fā)現(xiàn)當(dāng)聚合物側(cè)鏈的組氨酸成分增加時(shí) , 其運(yùn)載的 DNA 的基因表達(dá)效率明顯上升[60] 。
4 光響應(yīng)聚多肽
而 Chen等[64] 則通過(guò)光信號(hào)實(shí)現(xiàn)了聚多肽的交聯(lián) 。他們先制備了 mPEG-PLGA 的嵌段共聚物 , 然 后將肉桂醇與部分聚谷氨酸中的羧基偶聯(lián) , 得到的聚合物含有大量羧基因而具有 pH 響應(yīng)性 。在 254nm 紫外光照射下鏈間的苯乙烯片段二聚實(shí)現(xiàn)交聯(lián) , 原本的膠束結(jié)構(gòu)形成納米凝膠 , 穩(wěn)定性進(jìn)一步增加 。隨 后的體外實(shí)驗(yàn)也表明 , 這種 pH 響應(yīng)的光交聯(lián)水凝膠具有可控的載藥特性 。
最近 , Cheng等[65] 合成了精巧的光響應(yīng)螺旋聚多肽 。他們將 3, 4-二甲氧基-2硝基芐基這一光敏基 團(tuán)引入到聚多肽中 , 得到具有 α-螺旋結(jié)構(gòu)的正電荷聚多肽 。它能與 DNA 緊密結(jié)合 , 并在進(jìn)入細(xì)胞后通 過(guò)紫外光照射實(shí)現(xiàn)光敏基團(tuán)的裂解 , 從而破壞聚多肽的 α-螺旋構(gòu)型將 DNA 釋放出來(lái) 。這種光誘導(dǎo)的聚多肽構(gòu)型轉(zhuǎn)變能夠極大地增強(qiáng) DNA釋放效果 , 從而提高基因傳遞效率 。
5 總結(jié)與展望
正如活性自由基聚合極大地推動(dòng)了自由基聚合的發(fā)展一樣,NcA活性聚合方法的出現(xiàn)也將聚多肽材料的發(fā)展推上了一個(gè)新的平臺(tái)。自從1997年Deming第一次報(bào)道NcA的活性聚合以來(lái),大量的分子量可控、分子量分布窄、端基明確的聚多肽被合成出來(lái)。人們對(duì)于聚多肽的興趣日益增厚,各種結(jié)構(gòu)精巧的聚多肽相繼見諸于報(bào)道。刺激響應(yīng)聚多肽作為一類生物相容性良好、功能多樣化的材料更是廣受青睞。在這篇綜述里,我們從氧化還原、溫度、pH、光這幾個(gè)方面總結(jié)了刺激響應(yīng)聚多肽最近幾年的研究進(jìn)展,這些精巧的聚合物在藥物運(yùn)輸和生物技術(shù)等方面廣闊的應(yīng)用前景無(wú)疑會(huì)使它們從實(shí)驗(yàn)室走向工業(yè)生產(chǎn),而這一領(lǐng)域的迅速發(fā)展也必將推動(dòng)整個(gè)生物醫(yī)藥行業(yè)的進(jìn)步。
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