摘要：芳基吡咯類小分子化合物NB-2衍生物(Noc或Npc)與衍生于C34中的靶標(biāo)特異性多肽P26所形成的綴合物具有低納摩爾水平的融合抑制活性. 本文通過(guò)不同長(zhǎng)度或不同柔性的連接臂將Noc或Npc與衍生于C34的靶標(biāo)特異性多肽P27綴合, 探討了C34中a位殘基I635和連接臂對(duì)綴合物活性的影響. 人體免疫缺陷病毒1型(HIV-1)Env介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 多肽與小分子之間產(chǎn)生了強(qiáng)的協(xié)同作用.
人體免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包膜糖蛋白中的跨膜亞基gp41是介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜融合的功能性蛋白質(zhì). 在HIV-1感染宿主細(xì)胞的初始階段, gp41胞外域的2個(gè)功能區(qū), 即C末端重復(fù)序列(C-terminal heptad repeat, CHR)和N末端重復(fù)序列(N-terminal heptad repeat, NHR), 發(fā)生相互作用并形成一種熱力學(xué)穩(wěn)定的六股螺旋束(Six-helical bundle, 6-HB)[1,2] , 此過(guò)程是由疏水效應(yīng)主導(dǎo)的熵與焓的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程(ΔG=ΔH-TΔS)[3,4]; 之后病毒包膜和宿主細(xì)胞膜接近并最終融合. HIV-1融合抑制劑通過(guò)阻止上述內(nèi)源性6-HB的形成來(lái)阻斷膜融合的過(guò)程[5,6].
T20和C34是衍生于gp41 CHR的融合抑制多肽[7,8], 能夠競(jìng)爭(zhēng)性地與gp41 NHR所形成的螺旋三聚體(N-trimer)結(jié)合, 抑制內(nèi)源性6-HB的形成. 其中, T20已于2003年由美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)上市[9]. C34雖然具有比T20更高的抗病毒活性, 但因其水溶性不佳, 故未能應(yīng)用于臨床, 僅作為先導(dǎo)結(jié)構(gòu)用于結(jié)構(gòu)修飾[10,11]. 在C34的N端含有可與gp41 N-trimer表面疏水性口袋相互作用的3個(gè)關(guān)鍵性氨基酸殘基(Trp628, Trp631和Ile635)[12,13], 即口袋結(jié)合區(qū)(Pocket binding domain, PBD).
研究[14]結(jié)果表明, N-trimer表面的疏水性口袋在gp41介導(dǎo)的膜融合過(guò)程以及穩(wěn)定gp41所形成的6-HB方面起到了重要作用. 同時(shí), 這個(gè)疏水性的口袋也成為小分子類融合抑制劑的作用靶點(diǎn). Jiang等[15]報(bào)道了2個(gè)芳基吡咯類小分子化合物NB-2和NB-64, 它們抑制HIV-1復(fù)制的EC50值分別為1.04和2.21 μmol/L. 通過(guò)諸如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)和圓二色譜分析(CD)等分子生物學(xué)或生物物理學(xué)方法證明, NB-2和NB-64可作用于N-trimer表面的疏水性口袋.
前文[16]研究表明, C肽類融合抑制劑的序列內(nèi)可以細(xì)分為結(jié)構(gòu)部分和功能部分, 每一部分的側(cè)重點(diǎn)不同. 結(jié)構(gòu)部分主要用于維持藥物的高級(jí)結(jié)構(gòu)和分子尺寸; 功能部分則含有可與靶標(biāo)特異性結(jié)合的氨基酸殘基[17,18]. 將作用于N-trimer表面疏水性口袋的NB-2衍生物Noc [2-氧乙酸基-4-(2,5-二甲基吡咯基)-苯甲酸]或Npc[1-(4-羧基-3-羥苯基)-2,5-二甲基吡咯-3-羧酸]與衍生于C34中結(jié)構(gòu)部分的多肽P26(序列為NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL)綴合得到的多肽-小分子綴合物具有低納摩爾水平的細(xì)胞融合活性[19]. C34/N36形成的6-HB的晶體結(jié)構(gòu)分析表明, 在N-trimer中, 3個(gè)NHR通過(guò)a和d位殘基作用形成螺旋三聚體; 在其表面, e和g位殘基形成疏水性溝槽. C34中的a和d位殘基分別與N-trimer中的e和g位殘基相互作用, 形成6-HB(見圖1).
本文將衍生于C34的P27多肽(序列為INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL)與Noc或Npc綴合. 與P26多肽相比, P27多肽保留了C34中的a位殘基I635. 期望通過(guò)I635的保留使其所在螺旋得以保持, 并且I635可與疏水性口袋發(fā)生相互作用, 上述因素也許有利于提高綴合物的活性. 同時(shí), 在P27多肽與小分子之間引入不同長(zhǎng)度和柔性的連接臂[20], 探討了連接臂對(duì)綴合物活性的影響.
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 試劑與儀器
Rink-amide樹脂(載量0.44 mmol/g, 天津南開和成科技有限公司); 各種保護(hù)氨基酸[Fmoc-βAla-OH(N-芴甲氧羰基-β-丙氨酸)、 Fmoc-L-Asn(Trt)-OH(N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-L-天冬酰胺)、 Fmoc-L-Gln(Trt)-OH(N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-L-谷氨酰胺)、 Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-谷氨酸)、 Fmoc-L-His(Trt)-OH(N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-L-組氨酸)、 Fmoc-L-Ile-OH(N-芴甲氧羰基-L-異亮氨酸)、 Fmoc-L-Leu-OH(N-芴甲氧羰基-L-亮氨酸)、 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH(N-α-芴甲氧羰基-N'-叔丁氧羰基-L-賴氨酸)、 Fmoc-L-Ser(t-Bu)-OH(N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-絲氨酸)、 Fmoc-L-Thr(Trt)-OH(N-芴甲氧羰基-O-三苯甲基-L-蘇氨酸)、 Fmoc-L-Tyr(t-Bu)-OH(N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-酪氨酸)]及Fmoc-6-Aminocaproic Acid(N-芴甲氧羰基-6-氨基己酸); Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid(N-芴甲氧羰基-8-氨基-3,6-二氧雜辛酸)購(gòu)自浙江嘉興博美生物有限公司; 5-氨基水楊酸購(gòu)自英國(guó)Alfa Aesar公司; 其它試劑均為分析純.
CEM LibertyTM微波多肽合成儀(美國(guó)CEM公司); Shimadzu 10A 型高效液相色譜儀(日本島津株式會(huì)社); Venusil ASB C8液相色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm, 天津博納艾杰爾公司); Prep LC4000高壓制備液相色譜儀(美國(guó)Waters公司); X-Bridge C8制備色譜柱(195 μm×250 μm, 5 μm, 美國(guó)Waters 公司); Free-Zone 18 L型冷凍干燥機(jī)(美國(guó)Labconco公司); REFLEX Ⅲ型 MALDI-TOF 質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司).
1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程
1.2.1 小分子中間體的合成純化 Noc和Npc的合成參考文獻(xiàn)[19]方法. Noc: 紅色固體, 收率36%. LC-MS(C15H15NO5的MS理論值), m/z: 290.1(M+H, 100)(289). Npc: 白色固體, 收率21%. LC-MS(C14H13NO5的MS理論值), m/z: 276.1(M+H, 100)(275).
1.2.2 多肽及綴合物的合成與分離純化 參考文獻(xiàn)[19]方法進(jìn)行多肽及綴合物的合成與分離純化.
1.2.3 HIV-1 Env介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn) 將含有熒光素酶報(bào)告基因的TZM-b1細(xì)胞(50×104 cell/mL)與HL2/3細(xì)胞(100×104 cell/mL)及稀釋后的樣品共同孵育24 h后, 裂解細(xì)胞, 采用Lucife-rase Assay System(美國(guó)Promega公司)進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè), 得到待測(cè)樣品在不同濃度下的細(xì)胞融合抑制百分率. 以O(shè)rigin 7.5軟件(美國(guó)Origin Lab)處理數(shù)據(jù), 對(duì)劑量-融合抑制百分率曲線進(jìn)行S形擬合, 得到測(cè)試樣品的IC50值, 結(jié)果如表1所示.
2 結(jié)果與討論
2.1 小分子與多肽的協(xié)同效應(yīng)
如表1所示, C34的細(xì)胞融合活性為1.91 nmol/L, 而衍生于C34的靶標(biāo)特異性多肽P27的融合抑制活性比C34降低了約700倍. 該結(jié)果表明C34中的PBD在抑制HIV-1 Env介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合過(guò)程中發(fā)揮了重要作用. 小分子Noc通過(guò)連接臂共價(jià)鍵合P27得到的綴合物的細(xì)胞融合活性為10.38~17.09 nmol/L, 比單獨(dú)的P27提高了80~130倍; Npc通過(guò)連接臂共價(jià)鍵合P27得到的綴合物的細(xì)胞融合活性為314.5~649.8 nmol/L, 比P27提高了2~4倍. 上述結(jié)果表明, 芳基吡咯類小分子化合物與P27多肽之間產(chǎn)生了協(xié)同作用, 與前文[19]報(bào)道一致. 其中, Noc-βAla-P27的細(xì)胞融合活性比Noc-βAla-P26[文獻(xiàn)值[19]: IC50=(22.5±3.18) nmol/L]提高了2.2倍, 表明引入a位殘基I635確實(shí)可以提高綴合物的細(xì)胞融合活性. 但是, Npc-βAla-P27的細(xì)胞融合活性比Npc-βAla-P26降低了2.4倍. 上述結(jié)果表明, 綴合小分子的類型會(huì)對(duì)I635的作用產(chǎn)生影響.
2.2 連接臂對(duì)協(xié)同效應(yīng)的影響
選用不同長(zhǎng)度及柔性的連接臂連接小分子和多肽, 探討了連接臂的長(zhǎng)度和柔性對(duì)于綴合物活性的影響. 其中, βAla和Aca均為脂肪烴類, 前者的長(zhǎng)度小于后者; PEG3為脂肪醚類, 長(zhǎng)度上和Aca相近, 但比Aca具有更好的柔性. 通過(guò)比較Noc-βAla-P27, Noc-Aca-P27與Noc-PEG3-P27之間或Npc-βAla-P27, Npc-Aca-P27與Npc-PEG3-P27之間的細(xì)胞融合活性結(jié)果發(fā)現(xiàn), 連接臂的長(zhǎng)度和柔性對(duì)綴合物的活性無(wú)顯著影響.
綜上所述, 小分子Noc或Npc與衍生于C34的靶標(biāo)特異性多肽P27可形成綴合物, 綴合物中小分子部分和多肽部分分別作用于gp41 N-trimer的不同區(qū)域, 二者起到了協(xié)同作用, 細(xì)胞-細(xì)胞膜融合活性達(dá)到了低納摩爾水平. 不同類型的小分子在一定程度上影響了綴合物的活性. 連接臂的長(zhǎng)度和柔性的不同對(duì)綴合物的活性無(wú)顯著影響. 本文綴合物的設(shè)計(jì)與合成進(jìn)一步的繼承和拓展了小分子-肽綴合物融合抑制劑.
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