摘要 設(shè)計(jì)合成了具有 2 個(gè)活性序列的線性和環(huán)狀多肽及具有單個(gè)活性序列的短鏈多肽, 研究了它們的殺菌活性、 細(xì)胞毒性及溶血性. 結(jié)果表明, 線性肽和環(huán)狀肽的殺菌活性高于短鏈肽. 利用計(jì)算模擬的方法計(jì)算了多肽與細(xì)菌細(xì)胞膜中一種重要的成分磷脂酰甘油(DMPG)的結(jié)合能. 結(jié)果表明, 多肽-DMPG 的結(jié)合能與多肽的殺菌活性具有較高的相關(guān)性, 線性和環(huán)狀多肽與 DMPG 的結(jié)合能大于短鏈肽. 線性和環(huán)狀多肽均含有 2 個(gè)活性序列, 可提供多個(gè)荷正電氨基酸與荷負(fù)電的磷脂結(jié)合, 結(jié)合能較大, 殺菌活性較強(qiáng). 采用模擬生物膜對(duì)其中幾條多肽的作用機(jī)理進(jìn)行了初步研究. 結(jié)果表明, 該類多肽有可能使正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生孔洞; 而對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞膜, 多肽并未在膜上產(chǎn)生明顯孔洞, 而是引起了細(xì)菌細(xì)胞膜的聚集.
隨著傳統(tǒng)抗生素在醫(yī)藥、 食品、 畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)等領(lǐng)域的濫用以及細(xì)菌突變速度的加快, 很多細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素的抗藥性問題日漸突出, 然而在過去的 30 年中卻沒有一種真正意義上的新種類的抗菌藥物出現(xiàn)在市場(chǎng)上[1]. 因此, 尋找抗生素的替代品迫在眉睫. 抗菌肽(AMPs)的出現(xiàn)有可能使這局面得到改觀[2], 它是宿主防御體系中天然免疫的一個(gè)重要組成部分. 天然免疫在微生物侵襲宿主細(xì)胞后幾分鐘內(nèi)啟動(dòng), 抑制病原體擴(kuò)散, 為宿主細(xì)胞提供第一時(shí)間的保護(hù). 抗菌肽廣泛分布于自然界中,具有廣譜抗菌性, 某些抗菌肽還具有抗癌性及抗病毒性[3,4]. 研究表明, 細(xì)菌的細(xì)胞膜是抗菌肽的主要作用靶位, 抗菌肽通過破壞細(xì)胞膜的完整性, 使其產(chǎn)生孔洞或者瓦解而使內(nèi)部物質(zhì)外流, 或者穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部, 干預(yù)一些重要的細(xì)胞過程, 從而達(dá)到殺菌作用[5]. 而對(duì)于微生物來說, 改變其細(xì)胞膜的組成和成分代價(jià)巨大, 因此抗菌肽普遍具有比較低的抗藥性, 具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[6].
根據(jù)天然抗菌肽的特性進(jìn)行設(shè)計(jì)是發(fā)現(xiàn)新抗菌肽的重要途徑[7]. 研究表明, 很多含有多個(gè)活性片段的多肽具有較高的生物活性, 如 WLBU2[8], V4[9], Tritrpticin 的對(duì)稱模擬肽[10]和 Gramicidin S[11]等.此外, 很多抗菌肽在溶液中是單體, 與生物膜相結(jié)合時(shí)形成兩親的二聚體, 如 Pexiganan(MSI-78)[12],PG-1[12]和 Sushi 3[13]等. 對(duì)于這些抗菌肽而言, 二聚體是其活性構(gòu)象, 而二聚體也可視為分子中含有2 個(gè)活性序列. 大部分抗菌肽具有兩親性結(jié)構(gòu), 雙活性序列使其兩親性加強(qiáng), 有助于生物活性的表現(xiàn).因此, 具有雙活性序列的多肽可能具有更強(qiáng)的生物活性. 本文設(shè)計(jì)了含有雙活性序列的抗菌肽, 研究雙活性序列是否有助于提高抗菌肽的活性. 鑒于多肽的化學(xué)合成成本, 具備抗菌活性的短肽具有大批量生產(chǎn)的潛力, 因此本文選取抗菌肽數(shù)據(jù)庫(http: / / aps. unmc. edu / AP / main. php)中具有較短序列的多肽 Ac-RRWWRF-NH2(Combi-1) 和 Ac-FRWWHR-NH2(Combi-2)作為活性序列. 這 2 條多肽均為不對(duì)稱序列, 為加強(qiáng)多肽的兩親性, 需將 Combi-1 和 Combi-2 的序列顛倒, 逆序的抗菌肽是否仍有活性尚不清楚, 因此本文考察了逆序的 Combi-1 和 Combi-2 的活性. 將 Combi-1 和 Combi-2 及逆序的 Combi-1 和Combi-2 作為活性序列, 參照 V4 的結(jié)構(gòu)[9] 設(shè)計(jì)出具有雙活性序列的多肽, 測(cè)試了其殺菌活性、 毒性、溶血性及與模擬生物膜的相互作用, 并運(yùn)用計(jì)算模擬的方法計(jì)算了所設(shè)計(jì)的多肽與細(xì)菌的細(xì)胞膜中一種重要的磷脂———磷脂酰甘油的結(jié)合能. 二硫鍵環(huán)化有助于穩(wěn)定多肽的結(jié)構(gòu), 因此本文還設(shè)計(jì)了具有單個(gè)二硫鍵的環(huán)狀多肽并考察其殺菌活性, 為抗菌肽的設(shè)計(jì)提供了依據(jù).
1 實(shí)驗(yàn)部分
1. 2. 1 殺菌實(shí)驗(yàn) 挑取適量菌種在固體 Luria-Bertani(LB) 培養(yǎng)基中劃線, 在培養(yǎng)箱中于 37 益過夜培養(yǎng). 挑取適量處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)菌于生理鹽水中, 配制濁度為 0郾 5 ~ 1 麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙? 此時(shí)細(xì)菌菌落數(shù)約為 1X10^8 CFU/ mL, 使用時(shí)稀釋至 1X10^6 CFU/ mL. 配制濃度為 2 mg / mL 的多肽溶液. 采用微量肉湯二倍稀釋法測(cè)定合成多肽對(duì)各細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC). 同時(shí)進(jìn)行溶劑、 只加菌液不加多肽的陰性對(duì)照和加入多粘菌素 B 的陽性對(duì)照, 每個(gè)多肽平行進(jìn)行 3 次. 置于 37 益恒溫箱中培養(yǎng) 12 h, 觀察孔內(nèi)溶液的混濁情況, 96 孔板同排中肉眼所見澄清孔所對(duì)應(yīng)的最小濃度即為該多肽的 MIC 值.
1. 2. 2 毒性實(shí)驗(yàn) 用含 10% (體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的 RPMI 1640(含 100 U/ mL 青霉素和 100 U/ mL 鏈霉素)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng) BEAS-2B 細(xì)胞. 采用對(duì)數(shù)生長期的 BEAS-2B 細(xì)胞, 用含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為 5X10^4 Cells/ mL, 接種到 96 孔板. 培養(yǎng) 12 h 后, 加入不同濃度的多肽(終濃度分別為 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 和 320 ug / mL), 每種多肽濃度設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔, 并設(shè)不加細(xì)胞液的調(diào)零孔和只加細(xì)胞液、 不加肽液的空白對(duì)照孔. 采用 MTT 法測(cè)定細(xì)胞毒性, 于 490 nm 波長下測(cè)定光密度值.
1. 2. 3 溶血性實(shí)驗(yàn) 分別稱取各多肽, 用0.9% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))生理鹽水溶解, 濃度為1000 ug / mL, 依次二倍稀釋加入到 96 孔板中, 每孔 50 uL, 每個(gè)樣品平行 3 次(終濃度分別 500, 250, 125, 64, 32, 16 和8 ug / mL). 抽取健康兔子的新鮮血液, 加入到含有 1 g / L 肝素鈉的離心管中, 以 1000 r/ min 轉(zhuǎn)速離心5 min, 棄去上清液, 分離得紅細(xì)胞. 再用 0.9% 生理鹽水洗滌 2 次, 重復(fù)離心操作, 棄去上清液, 得到壓積紅細(xì)胞. 取 2 滴壓積紅細(xì)胞加入 4 mL 生理鹽水即得 2% (體積分?jǐn)?shù))紅細(xì)胞懸液. 取 2% 紅細(xì)胞懸液 50 uL, 依次加入到上述 96 孔板各孔中. 用含 1% 紅細(xì)胞的生理鹽水和蒸餾水分別作為空白陰性對(duì)照和 100% 溶血陽性對(duì)照. 于 37 度下?lián)u床振蕩孵化 4 h. 待紅細(xì)胞沉淀, 吸取 40 uL 上清液加入到另一個(gè)干凈的 96 孔板中, 采用酶標(biāo)儀在 540 nm 波長下測(cè)定吸光度.
1. 2. 4 多肽和磷脂的相互作用 采用三電極體系研究多肽與磷脂的相互作用: 膜修飾玻碳電極為工作電極, 飽和甘汞電極為參比電極, 鉑電極為對(duì)電極. 電解液為 1 mmol / L 的 K3Fe(CN)6/ K4Fe(CN)6溶液(包含 0.1 mol / L KCl). 將玻碳電極在三氧化二鋁粉末中拋光后, 依次在硝酸(體積比 1 :1)、無水乙醇和二次水中超聲清洗 1 min, 用氮?dú)獯蹈? 配制 4 mg / mL DMPC 成膜液(氯仿溶液) 及 4 mg / mLDMPG 成膜液[V(甲醇) : V(氯仿)= 1:3]. 將 5 uL DMPC 或 DMPG 成膜液滴涂在玻碳電極表面, 晾干后在 0.1 mol / L KCl 溶液中水化 30 min, 制得磷脂雙層膜修飾電極. 將該修飾電極在電解液中進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)定, 掃速為 50 mv / s. 然后將電極浸泡在一系列濃度的多肽溶液中 30 min, 再在電解液中進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)定. 通過 2 次測(cè)定的氧化峰電流差來衡量多肽與磷脂雙層膜的相互作用.
參照文獻(xiàn)[14]方法制備脂質(zhì)體. 將 100 uL 1 mg / mL 的多肽溶液加入 96 孔板中, 依次二倍稀釋,每孔溶液體積 50 uL. 每孔加入 30 uL 2 mg / mL 的脂質(zhì)體, 使多肽最終濃度依次為 625, 313, 156, 78和 39 ug / mL. 室溫下孵育 20 min, 用酶標(biāo)儀于 600 nm 波長下測(cè)定光密度值(OD600 ). 以加入 50 uL 的PBS 緩沖液為陰性對(duì)照, 加入 50 uL 10% 的 Trion X-100 為陽性對(duì)照. 每個(gè)多肽平行進(jìn)行 3 次.
式中, E 為優(yōu)化后各組分的單點(diǎn)能. 計(jì)算時(shí)盡量考慮不同的結(jié)合模式, 從而使多肽與 DMPG 達(dá)到最優(yōu)結(jié)合.
2 結(jié)果與討論
目前, 新抗菌肽的發(fā)現(xiàn)主要依賴于對(duì)天然抗菌肽及合成產(chǎn)物的大規(guī)模篩選, 組合化學(xué)對(duì)于先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)具有重要作用. Combi-1 和 Combi-2 是采用組合化學(xué)方法經(jīng)過大規(guī)模篩選得到的抗菌肽, 對(duì)多種細(xì)菌及酵母菌具有廣譜殺菌活性, 而對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞及紅細(xì)胞無毒或具有較小毒性. Combi-1 對(duì)多種細(xì)菌的殺菌活性相當(dāng)或優(yōu)于天然抗菌肽(IC50 = 5 ~ 39 ug / mL)[18]. Combi-1 和 Combi-2 均含有 6 個(gè)氨基酸殘基, 肽鏈長度較短, 但卻表現(xiàn)出較好的殺菌活性及較低的毒性, 因此具有研究意義. 本文選取 Combi-1 和 Combi-2 作為一個(gè)活性序列, 參照 V4 抗菌肽的設(shè)計(jì), 采用 GSG 將2 個(gè)活性序列連接形成含有雙活性序列的線性多肽. Combi-1 和 Combi-2 均為不對(duì)稱序列, 為使線性多肽從結(jié)構(gòu)上兩親性更加顯著, 采用逆序的多肽 Ac-FRWWRR-NH2(r-Combi-1) 和 Ac-RHWWRF-NH2(r-Combi-2)和相應(yīng)的正序多肽相結(jié)合設(shè)計(jì)形成線性多肽 Ac-RRWWRFGSGFRWWRR-NH2(l-Combi-1) 和 Ac-FRWWHRGSGRHW-WRF-NH2(l-Combi-2). 為進(jìn)一步固定多肽的構(gòu)象, 使疏水面更疏水, 親水面更親水, 采用分子內(nèi)二硫鍵環(huán)化線性多肽, 形成環(huán)狀的含有雙活性序列的多肽 Ac-CRRWWRFGSGFRWWRRC-NH2(c-Combi-1)和 Ac-CFRWWHRGSGRHWWRFC-NH2(c-Combi-2).
選取上述多肽中殺菌效果較好的 Combi-1, l-Combi-1 和 l-Combi-2 進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn), 結(jié)果見圖 1.多肽類抗菌素陽性對(duì)照多粘菌素 B 雖具有較強(qiáng)的殺菌活性(表 1), 但會(huì)引起部分正常細(xì)胞的死亡. 特別是濃度>80 mg / mL 時(shí), 多粘菌素 B 可造成較高的細(xì)胞死亡率. Combi-1 的細(xì)胞毒性較小, 在濃度小于等于80mg / mL 時(shí), 對(duì)細(xì)胞的抑制率均不超過 22% , 低濃度時(shí)毒性更低. l-Combi-1 在濃度小于等于40 mg / mL 時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制率很低, 但濃度>80 mg / mL 時(shí), 細(xì)胞毒性急劇升高. l-Combi-2 在低濃度時(shí)也有一定的細(xì)胞抑制作用(濃度小于等于80 mg / mL), 高濃度時(shí)毒性較大. 以上結(jié)果說明, Combi-1 和 l-Combi-1 在較低濃度下具有較高的殺菌活性且細(xì)胞毒性較低.
2. 4. 1 多肽與磷脂雙層膜的相互作用 固體支撐的磷脂雙層膜穩(wěn)定性好, 作為一種生物模擬膜已被廣泛地應(yīng)用于抗菌肽與生物膜的相互作用研究中[19 ~ 21]. 本文采用此膜模擬生物膜研究多肽是否能增加生物膜的通透性. 將 DMPC 或 DMPG 修飾于電極上, 并置于電解液中測(cè)試. 磷脂具有電絕緣性, 因此可阻礙電解液中的探針 K3Fe(CN)6/ K4Fe(CN)6到達(dá)電極表面. 與裸玻碳電極相比, 探針的氧化還原電流較低. 當(dāng)磷脂雙層膜電極被置于多肽溶液中, 如果多肽與磷脂發(fā)生相互作用, 使磷脂雙層膜產(chǎn)生孔洞或者膜發(fā)生瓦解, 磷脂雙層膜通透性增加, 探針可順利到達(dá)電極表面, 從而產(chǎn)生較強(qiáng)的循環(huán)伏安電流, 可通過電流的變化來評(píng)價(jià)多肽與磷脂的作用程度. 圖 3(A)為探針 K3Fe(CN)6/ K4Fe(CN)6在裸電極及 DMPC 修飾電極上的循環(huán)伏安曲線. 探針在裸玻碳電極上的電流響應(yīng)較高. 當(dāng)電極表面修飾有 DMPC 雙層膜時(shí), 循環(huán)伏安電流急劇降低, 說明電極表面修飾有磷脂雙層膜, 阻礙了電子的轉(zhuǎn)移.將該 DMPC 修飾電極浸入到多肽溶液中 30 min 后, 置于電解液中測(cè)試, 發(fā)現(xiàn)探針的循環(huán)伏安電流重新升高, 說明電極表面的 DMPC 雙層膜已有破損, 或者形成孔洞, 或者多肽使磷脂膜發(fā)生瓦解. Combi-1,l-Combi-1 和 lCombi-2 對(duì) DMPC 雙層膜的破壞作用見圖3(B). 隨著 Combi-1 和 l-Combi-1 濃度增加, 循環(huán)伏安電流增大, 說明提高多肽濃度可提高對(duì)磷脂膜的破壞作用. l-Combi-2 在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)DMPC 的破壞作用隨濃度變化不大. 磷脂酰膽堿是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的重要組分, 多肽對(duì) DMPC 膜的破壞表明多肽可能對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜具有一定的破壞作用. 多肽與細(xì)菌細(xì)胞膜的重要成分 DMPG 之間的相互作用見圖 4. 與 DMPC 相比, 多肽對(duì) DMPG 的破壞作用明顯降低(圖中循環(huán)伏安電流的增大主要來自于溶劑對(duì) DMPG 的破壞作用). 在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi), 循環(huán)伏安電流基本上圍繞零點(diǎn)波動(dòng)(扣除溶劑的影響后), 表明多肽不能使細(xì)菌細(xì)胞膜產(chǎn)生孔洞或者瓦解, 多肽的殺菌作用并非源于對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞作用. Rezansoff 等[16]報(bào)道, Combi-1 和 Combi-2 不能造成含 PG 的脂質(zhì)體產(chǎn)生孔洞, 但卻能穿透大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜并聚集到細(xì)胞質(zhì)中, 推測(cè)該類多肽的殺菌作用并非來自于對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞, 其作用靶點(diǎn)可能位于細(xì)胞內(nèi)部, 此結(jié)果和本文所得結(jié)果一致.
3 結(jié) 論
設(shè)計(jì)合成了具有 2 個(gè)活性序列的線性和環(huán)狀多肽及具有單個(gè)活性序列的短鏈多肽, 研究了它們的殺菌活性、 對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性和溶血性及與磷脂之間的相互作用, 并采用計(jì)算模擬的方法計(jì)算了多肽與細(xì)菌細(xì)胞膜中重要成分磷脂酰甘油(DMPG)的結(jié)合能, 從理論上解釋了其活性. 結(jié)果表明,含 2 個(gè)活性序列的線性和環(huán)狀多肽比含單個(gè)活性序列的短鏈肽具有較高的殺菌活性, 活性提高幅度視不同的序列而異. 經(jīng)過計(jì)算模擬, 多肽的殺菌活性與多肽-磷脂的結(jié)合能顯示出較高的相關(guān)性. 線性肽和環(huán)狀肽與 DMPG 的結(jié)合能高于短鏈肽. 計(jì)算模擬的方法為研究抗菌肽的殺菌活性從理論上提供了一定的依據(jù). 線性多肽具有較高的殺菌活性, 生產(chǎn)成本較低, 且對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性和溶血性均較低, 因此具有進(jìn)一步的研究價(jià)值和潛在的應(yīng)用價(jià)值. 采用固體支撐的磷脂雙層膜及脂質(zhì)體模擬生物膜, 對(duì)多肽的作用機(jī)理進(jìn)行了初步研究. 結(jié)果表明, 多肽 Combi-1, l-Combi-1 和 l-Combi-2 可以使DMPC 膜產(chǎn)生孔洞而使細(xì)胞膜通透性增加. 而對(duì)于 DMPG 膜, 多肽并未在 DMPG 膜上產(chǎn)生明顯孔洞,而是引起了磷脂的聚集, 因此細(xì)菌細(xì)胞膜可能不是該類多肽殺菌的主要作用靶點(diǎn).
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