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具有雙活性序列的新型抗菌肽的設(shè)計(jì)及性質(zhì)
瀏覽量:447 | 2024/6/12 17:22:57


摘要 設(shè)計(jì)合成了具有 2 個(gè)活性序列的線(xiàn)性和環(huán)狀多肽及具有單個(gè)活性序列的短鏈多肽, 研究了它們的殺菌活性、 細(xì)胞毒性及溶血性. 結(jié)果表明, 線(xiàn)性肽和環(huán)狀肽的殺菌活性高于短鏈肽. 利用計(jì)算模擬的方法計(jì)算了多肽與細(xì)菌細(xì)胞膜中一種重要的成分磷脂酰甘油(DMPG)的結(jié)合能. 結(jié)果表明, 多肽-DMPG 的結(jié)合能與多肽的殺菌活性具有較高的相關(guān)性, 線(xiàn)性和環(huán)狀多肽與 DMPG 的結(jié)合能大于短鏈肽. 線(xiàn)性和環(huán)狀多肽均含有 2 個(gè)活性序列, 可提供多個(gè)荷正電氨基酸與荷負(fù)電的磷脂結(jié)合, 結(jié)合能較大, 殺菌活性較強(qiáng). 采用模擬生物膜對(duì)其中幾條多肽的作用機(jī)理進(jìn)行了初步研究. 結(jié)果表明, 該類(lèi)多肽有可能使正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生孔洞; 而對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞膜, 多肽并未在膜上產(chǎn)生明顯孔洞, 而是引起了細(xì)菌細(xì)胞膜的聚集.


隨著傳統(tǒng)抗生素在醫(yī)藥、 食品、 畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)等領(lǐng)域的濫用以及細(xì)菌突變速度的加快, 很多細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素的抗藥性問(wèn)題日漸突出, 然而在過(guò)去的 30 年中卻沒(méi)有一種真正意義上的新種類(lèi)的抗菌藥物出現(xiàn)在市場(chǎng)上[1]. 因此, 尋找抗生素的替代品迫在眉睫. 抗菌肽(AMPs)的出現(xiàn)有可能使這局面得到改觀[2], 它是宿主防御體系中天然免疫的一個(gè)重要組成部分. 天然免疫在微生物侵襲宿主細(xì)胞后幾分鐘內(nèi)啟動(dòng), 抑制病原體擴(kuò)散, 為宿主細(xì)胞提供第一時(shí)間的保護(hù). 抗菌肽廣泛分布于自然界中,具有廣譜抗菌性, 某些抗菌肽還具有抗癌性及抗病毒性[3,4]. 研究表明, 細(xì)菌的細(xì)胞膜是抗菌肽的主要作用靶位, 抗菌肽通過(guò)破壞細(xì)胞膜的完整性, 使其產(chǎn)生孔洞或者瓦解而使內(nèi)部物質(zhì)外流, 或者穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部, 干預(yù)一些重要的細(xì)胞過(guò)程, 從而達(dá)到殺菌作用[5]. 而對(duì)于微生物來(lái)說(shuō), 改變其細(xì)胞膜的組成和成分代價(jià)巨大, 因此抗菌肽普遍具有比較低的抗藥性, 具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[6].


根據(jù)天然抗菌肽的特性進(jìn)行設(shè)計(jì)是發(fā)現(xiàn)新抗菌肽的重要途徑[7]. 研究表明, 很多含有多個(gè)活性片段的多肽具有較高的生物活性, 如 WLBU2[8], V4[9], Tritrpticin 的對(duì)稱(chēng)模擬肽[10]和 Gramicidin S[11]等.此外, 很多抗菌肽在溶液中是單體, 與生物膜相結(jié)合時(shí)形成兩親的二聚體, 如 Pexiganan(MSI-78)[12],PG-1[12]和 Sushi 3[13]等. 對(duì)于這些抗菌肽而言, 二聚體是其活性構(gòu)象, 而二聚體也可視為分子中含有2 個(gè)活性序列. 大部分抗菌肽具有兩親性結(jié)構(gòu), 雙活性序列使其兩親性加強(qiáng), 有助于生物活性的表現(xiàn).因此, 具有雙活性序列的多肽可能具有更強(qiáng)的生物活性. 本文設(shè)計(jì)了含有雙活性序列的抗菌肽, 研究雙活性序列是否有助于提高抗菌肽的活性. 鑒于多肽的化學(xué)合成成本, 具備抗菌活性的短肽具有大批量生產(chǎn)的潛力, 因此本文選取抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)(http: / / aps. unmc. edu / AP / main. php)中具有較短序列的多肽 Ac-RRWWRF-NH2(Combi-1) 和 Ac-FRWWHR-NH2(Combi-2)作為活性序列. 這 2 條多肽均為不對(duì)稱(chēng)序列, 為加強(qiáng)多肽的兩親性, 需將 Combi-1 和 Combi-2 的序列顛倒, 逆序的抗菌肽是否仍有活性尚不清楚, 因此本文考察了逆序的 Combi-1 和 Combi-2 的活性. 將 Combi-1 和 Combi-2 及逆序的 Combi-1 和Combi-2 作為活性序列, 參照 V4 的結(jié)構(gòu)[9] 設(shè)計(jì)出具有雙活性序列的多肽, 測(cè)試了其殺菌活性、 毒性、溶血性及與模擬生物膜的相互作用, 并運(yùn)用計(jì)算模擬的方法計(jì)算了所設(shè)計(jì)的多肽與細(xì)菌的細(xì)胞膜中一種重要的磷脂———磷脂酰甘油的結(jié)合能. 二硫鍵環(huán)化有助于穩(wěn)定多肽的結(jié)構(gòu), 因此本文還設(shè)計(jì)了具有單個(gè)二硫鍵的環(huán)狀多肽并考察其殺菌活性, 為抗菌肽的設(shè)計(jì)提供了依據(jù).


1 實(shí)驗(yàn)部分


1. 1 試劑與儀器
革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌(Escherichia coli)、 銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、 鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌( Stenotrophomonas maltophilia); 革蘭氏陽(yáng)性菌包括金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、 藤黃微球菌(Micrococcus luteus)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subti-lis). 其中, 大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌、 藤黃微球菌及枯草芽孢桿菌由河南省食品藥品檢驗(yàn)所提供,其余菌株由臨床分離得到. 人支氣管上皮細(xì)胞株(BEAS-2B 細(xì)胞)由鄭州大學(xué)吳衛(wèi)東教授饋贈(zèng); 健康成年兔子 1 只, 由河南省鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供; 多粘菌素 B(Polymyxin B, PB)購(gòu)自于 Sigma 公司;Triton X-100 購(gòu)自于北京索來(lái)寶生物有限公司; 磷脂酰膽堿(DMPC) 與磷脂酰甘油(DMPG) 均購(gòu)于Avanti Polar Lipids Inc(美國(guó)); 其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純; 所用水根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求采用超純水或二次蒸餾水.Spectra MR 酶標(biāo)儀(美國(guó) DYNEX 公司); RST3000 電化學(xué)工作站(蘇州瑞思特儀器有限公司).


1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 殺菌實(shí)驗(yàn) 挑取適量菌種在固體 Luria-Bertani(LB) 培養(yǎng)基中劃線(xiàn), 在培養(yǎng)箱中于 37 益過(guò)夜培養(yǎng). 挑取適量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌于生理鹽水中, 配制濁度為 0郾 5 ~ 1 麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙? 此時(shí)細(xì)菌菌落數(shù)約為 1X10^8 CFU/ mL, 使用時(shí)稀釋至 1X10^6 CFU/ mL. 配制濃度為 2 mg / mL 的多肽溶液. 采用微量肉湯二倍稀釋法測(cè)定合成多肽對(duì)各細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC). 同時(shí)進(jìn)行溶劑、 只加菌液不加多肽的陰性對(duì)照和加入多粘菌素 B 的陽(yáng)性對(duì)照, 每個(gè)多肽平行進(jìn)行 3 次. 置于 37 益恒溫箱中培養(yǎng) 12 h, 觀察孔內(nèi)溶液的混濁情況, 96 孔板同排中肉眼所見(jiàn)澄清孔所對(duì)應(yīng)的最小濃度即為該多肽的 MIC 值.


1. 2. 2 毒性實(shí)驗(yàn) 用含 10% (體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的 RPMI 1640(含 100 U/ mL 青霉素和 100 U/ mL 鏈霉素)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng) BEAS-2B 細(xì)胞. 采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 BEAS-2B 細(xì)胞, 用含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為 5X10^4 Cells/ mL, 接種到 96 孔板. 培養(yǎng) 12 h 后, 加入不同濃度的多肽(終濃度分別為 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 和 320 ug / mL), 每種多肽濃度設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔, 并設(shè)不加細(xì)胞液的調(diào)零孔和只加細(xì)胞液、 不加肽液的空白對(duì)照孔. 采用 MTT 法測(cè)定細(xì)胞毒性, 于 490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值.


1. 2. 3 溶血性實(shí)驗(yàn) 分別稱(chēng)取各多肽, 用0.9% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))生理鹽水溶解, 濃度為1000 ug / mL, 依次二倍稀釋加入到 96 孔板中, 每孔 50 uL, 每個(gè)樣品平行 3 次(終濃度分別 500, 250, 125, 64, 32, 16 和8 ug / mL). 抽取健康兔子的新鮮血液, 加入到含有 1 g / L 肝素鈉的離心管中, 以 1000 r/ min 轉(zhuǎn)速離心5 min, 棄去上清液, 分離得紅細(xì)胞. 再用 0.9% 生理鹽水洗滌 2 次, 重復(fù)離心操作, 棄去上清液, 得到壓積紅細(xì)胞. 取 2 滴壓積紅細(xì)胞加入 4 mL 生理鹽水即得 2% (體積分?jǐn)?shù))紅細(xì)胞懸液. 取 2% 紅細(xì)胞懸液 50 uL, 依次加入到上述 96 孔板各孔中. 用含 1% 紅細(xì)胞的生理鹽水和蒸餾水分別作為空白陰性對(duì)照和 100% 溶血陽(yáng)性對(duì)照. 于 37 度下?lián)u床振蕩孵化 4 h. 待紅細(xì)胞沉淀, 吸取 40 uL 上清液加入到另一個(gè)干凈的 96 孔板中, 采用酶標(biāo)儀在 540 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度.


1. 2. 4 多肽和磷脂的相互作用 采用三電極體系研究多肽與磷脂的相互作用: 膜修飾玻碳電極為工作電極, 飽和甘汞電極為參比電極, 鉑電極為對(duì)電極. 電解液為 1 mmol / L 的 K3Fe(CN)6/ K4Fe(CN)6溶液(包含 0.1 mol / L KCl). 將玻碳電極在三氧化二鋁粉末中拋光后, 依次在硝酸(體積比 1 :1)、無(wú)水乙醇和二次水中超聲清洗 1 min, 用氮?dú)獯蹈? 配制 4 mg / mL DMPC 成膜液(氯仿溶液) 及 4 mg / mLDMPG 成膜液[V(甲醇) : V(氯仿)= 1:3]. 將 5 uL DMPC 或 DMPG 成膜液滴涂在玻碳電極表面, 晾干后在 0.1 mol / L KCl 溶液中水化 30 min, 制得磷脂雙層膜修飾電極. 將該修飾電極在電解液中進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)定, 掃速為 50 mv / s. 然后將電極浸泡在一系列濃度的多肽溶液中 30 min, 再在電解液中進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)定. 通過(guò) 2 次測(cè)定的氧化峰電流差來(lái)衡量多肽與磷脂雙層膜的相互作用.


參照文獻(xiàn)[14]方法制備脂質(zhì)體. 將 100 uL 1 mg / mL 的多肽溶液加入 96 孔板中, 依次二倍稀釋,每孔溶液體積 50 uL. 每孔加入 30 uL 2 mg / mL 的脂質(zhì)體, 使多肽最終濃度依次為 625, 313, 156, 78和 39 ug / mL. 室溫下孵育 20 min, 用酶標(biāo)儀于 600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值(OD600 ). 以加入 50 uL 的PBS 緩沖液為陰性對(duì)照, 加入 50 uL 10% 的 Trion X-100 為陽(yáng)性對(duì)照. 每個(gè)多肽平行進(jìn)行 3 次.


1. 2. 5 計(jì)算模擬 采用磷脂酰甘油(DMPG)模擬細(xì)菌細(xì)胞膜, 對(duì)多肽與 DMPG 的結(jié)合能進(jìn)行計(jì)算. 多肽與 DMPG 分子的初始構(gòu)型由 Gaussian view 和 Amber 軟件中的 leap 模塊共同構(gòu)建. 計(jì)算使用 Gaussian09 軟件[15], 采用 PM3 半經(jīng)驗(yàn)算法參照文獻(xiàn)[16,17]對(duì) DMPG 及各個(gè)多肽分子進(jìn)行構(gòu)型優(yōu)化. 然后對(duì)多肽與 DMPG 分子的復(fù)合物進(jìn)行優(yōu)化來(lái)模擬多肽與 DMPG 分子的相互作用, 由于復(fù)合物分子量較大,模擬時(shí)仍然采用 PM3 半經(jīng)驗(yàn)算法. 多肽與 DMPG 主要通過(guò)靜電作用結(jié)合, 同時(shí)形成氫鍵, 計(jì)算時(shí)需要同時(shí)考慮兩種作用. 采用以下公式計(jì)算多肽與 DMPG 分子的結(jié)合能, 用以衡量二者之間的相互作用程度.

式中, E 為優(yōu)化后各組分的單點(diǎn)能. 計(jì)算時(shí)盡量考慮不同的結(jié)合模式, 從而使多肽與 DMPG 達(dá)到最優(yōu)結(jié)合.


2 結(jié)果與討論


2. 1 多肽的設(shè)計(jì)

目前, 新抗菌肽的發(fā)現(xiàn)主要依賴(lài)于對(duì)天然抗菌肽及合成產(chǎn)物的大規(guī)模篩選, 組合化學(xué)對(duì)于先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)具有重要作用. Combi-1 和 Combi-2 是采用組合化學(xué)方法經(jīng)過(guò)大規(guī)模篩選得到的抗菌肽, 對(duì)多種細(xì)菌及酵母菌具有廣譜殺菌活性, 而對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞及紅細(xì)胞無(wú)毒或具有較小毒性. Combi-1 對(duì)多種細(xì)菌的殺菌活性相當(dāng)或優(yōu)于天然抗菌肽(IC50 = 5 ~ 39 ug / mL)[18]. Combi-1 和 Combi-2 均含有 6 個(gè)氨基酸殘基, 肽鏈長(zhǎng)度較短, 但卻表現(xiàn)出較好的殺菌活性及較低的毒性, 因此具有研究意義. 本文選取 Combi-1 和 Combi-2 作為一個(gè)活性序列, 參照 V4 抗菌肽的設(shè)計(jì), 采用 GSG 將2 個(gè)活性序列連接形成含有雙活性序列的線(xiàn)性多肽. Combi-1 和 Combi-2 均為不對(duì)稱(chēng)序列, 為使線(xiàn)性多肽從結(jié)構(gòu)上兩親性更加顯著, 采用逆序的多肽 Ac-FRWWRR-NH2(r-Combi-1) 和 Ac-RHWWRF-NH2(r-Combi-2)和相應(yīng)的正序多肽相結(jié)合設(shè)計(jì)形成線(xiàn)性多肽 Ac-RRWWRFGSGFRWWRR-NH2(l-Combi-1) 和 Ac-FRWWHRGSGRHW-WRF-NH2(l-Combi-2). 為進(jìn)一步固定多肽的構(gòu)象, 使疏水面更疏水, 親水面更親水, 采用分子內(nèi)二硫鍵環(huán)化線(xiàn)性多肽, 形成環(huán)狀的含有雙活性序列的多肽 Ac-CRRWWRFGSGFRWWRRC-NH2(c-Combi-1)和 Ac-CFRWWHRGSGRHWWRFC-NH2(c-Combi-2).


2. 2 多肽 MIC 值的確定
采用目視法, 觀察肉眼所見(jiàn)的澄清孔所對(duì)應(yīng)的最小濃度, 考察了多肽對(duì)多種革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌的殺菌活性, 結(jié)果見(jiàn)表 1. 具有單個(gè)活性序列的多肽 Combi-1 肽鏈雖然較短, 但仍具有較好的殺菌活性, 對(duì)多種革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌的 MIC 值為 32 ~ 64 mg / mL(除枯草芽孢桿菌). 與 Combi-1 序列完全相反的 r-Combi-1 對(duì)大多數(shù)菌種殺菌活性大大降低. 將 Combi-1 和 r-Combi-1 用 GSG 連接所形成的l-Combi-1 表現(xiàn)出更好的殺菌活性, 對(duì)所研究的菌種的 MIC 值為 8 ~ 32 mg / mL. 對(duì)多種菌種而言,l-Combi-1 的殺菌活性比 Combi-1 提高約 1 倍. 分子內(nèi)二硫鍵環(huán)化的 c-Combi-1 的殺菌活性與線(xiàn)性的l-Combi-1 基本相當(dāng)(除個(gè)別菌種外). 由組合化學(xué)所獲得的 Combi-2 活性不及 Combi-1, 對(duì)多數(shù)菌種殺菌活性不佳. 逆序的 r-Combi-2 對(duì)大多數(shù)菌種幾乎無(wú)殺菌活性. 但將二者用 GSG 連接所得 l-Combi-2 的殺菌活性大大提高, 對(duì)大多數(shù)菌種的 MIC 值較低. 環(huán)化的 c-Combi-2 比 l-Combi-2 殺菌能力稍有降低,但仍表現(xiàn)出一定的殺菌活性. 以上結(jié)果表明, 逆序的多肽和正序的多肽雖然只是氨基酸序列相反, 但活性相差較大, 這可能與多肽構(gòu)型不同有關(guān). 具有雙活性序列的線(xiàn)性多肽具有較高的殺菌能力, 比具有單活性序列的多肽活性大大提高. 特別是組成 l-Combi-2 的 Combi-2 和 r-Combi-2 殺菌活性較低或幾乎無(wú)殺菌活性, 但由二者組成的 l-Combi-2 卻具有較高的殺菌能力. 環(huán)狀多肽的殺菌能力與線(xiàn)性多肽相當(dāng)或稍差, 考慮到多肽的合成成本, 具有雙活性序列的線(xiàn)性多肽具有進(jìn)一步研究的價(jià)值. 此外, 8 條多肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的殺菌活性均略強(qiáng)于革蘭氏陰性菌, 特別是枯草芽孢桿菌.

2. 3 多肽的毒性實(shí)驗(yàn)和溶血性實(shí)驗(yàn)

選取上述多肽中殺菌效果較好的 Combi-1, l-Combi-1 和 l-Combi-2 進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn), 結(jié)果見(jiàn)圖 1.多肽類(lèi)抗菌素陽(yáng)性對(duì)照多粘菌素 B 雖具有較強(qiáng)的殺菌活性(表 1), 但會(huì)引起部分正常細(xì)胞的死亡. 特別是濃度>80 mg / mL 時(shí), 多粘菌素 B 可造成較高的細(xì)胞死亡率. Combi-1 的細(xì)胞毒性較小, 在濃度小于等于80mg / mL 時(shí), 對(duì)細(xì)胞的抑制率均不超過(guò) 22% , 低濃度時(shí)毒性更低. l-Combi-1 在濃度小于等于40 mg / mL 時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制率很低, 但濃度>80 mg / mL 時(shí), 細(xì)胞毒性急劇升高. l-Combi-2 在低濃度時(shí)也有一定的細(xì)胞抑制作用(濃度小于等于80 mg / mL), 高濃度時(shí)毒性較大. 以上結(jié)果說(shuō)明, Combi-1 和 l-Combi-1 在較低濃度下具有較高的殺菌活性且細(xì)胞毒性較低.


多肽 Combi-1, l-Combi-1 和 l-Combi-2 對(duì)兔血細(xì)胞的溶血性見(jiàn)圖 2. Combi-1 和 l-Combi-2 在濃度小于等于125 mg / mL 時(shí)對(duì)兔血細(xì)胞溶血性很小, 但當(dāng)濃度升高時(shí), 溶血性增大; 而 l-Combi-1 和陽(yáng)性對(duì)照多粘菌素 B 在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)基本無(wú)溶血性. 綜上所述, Combi-1 和 l-Combi-1 在低濃度下具有較強(qiáng)的殺菌活性, 同時(shí)細(xì)胞毒性和溶血性較低, 因此具有進(jìn)一步的研究?jī)r(jià)值和潛在的應(yīng)用價(jià)值.

2. 4 多肽與磷脂的相互作用

2. 4. 1 多肽與磷脂雙層膜的相互作用 固體支撐的磷脂雙層膜穩(wěn)定性好, 作為一種生物模擬膜已被廣泛地應(yīng)用于抗菌肽與生物膜的相互作用研究中[19 ~ 21]. 本文采用此膜模擬生物膜研究多肽是否能增加生物膜的通透性. 將 DMPC 或 DMPG 修飾于電極上, 并置于電解液中測(cè)試. 磷脂具有電絕緣性, 因此可阻礙電解液中的探針 K3Fe(CN)6/ K4Fe(CN)6到達(dá)電極表面. 與裸玻碳電極相比, 探針的氧化還原電流較低. 當(dāng)磷脂雙層膜電極被置于多肽溶液中, 如果多肽與磷脂發(fā)生相互作用, 使磷脂雙層膜產(chǎn)生孔洞或者膜發(fā)生瓦解, 磷脂雙層膜通透性增加, 探針可順利到達(dá)電極表面, 從而產(chǎn)生較強(qiáng)的循環(huán)伏安電流, 可通過(guò)電流的變化來(lái)評(píng)價(jià)多肽與磷脂的作用程度. 圖 3(A)為探針 K3Fe(CN)6/ K4Fe(CN)6在裸電極及 DMPC 修飾電極上的循環(huán)伏安曲線(xiàn). 探針在裸玻碳電極上的電流響應(yīng)較高. 當(dāng)電極表面修飾有 DMPC 雙層膜時(shí), 循環(huán)伏安電流急劇降低, 說(shuō)明電極表面修飾有磷脂雙層膜, 阻礙了電子的轉(zhuǎn)移.將該 DMPC 修飾電極浸入到多肽溶液中 30 min 后, 置于電解液中測(cè)試, 發(fā)現(xiàn)探針的循環(huán)伏安電流重新升高, 說(shuō)明電極表面的 DMPC 雙層膜已有破損, 或者形成孔洞, 或者多肽使磷脂膜發(fā)生瓦解. Combi-1,l-Combi-1 和 lCombi-2 對(duì) DMPC 雙層膜的破壞作用見(jiàn)圖3(B). 隨著 Combi-1 和 l-Combi-1 濃度增加, 循環(huán)伏安電流增大, 說(shuō)明提高多肽濃度可提高對(duì)磷脂膜的破壞作用. l-Combi-2 在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)DMPC 的破壞作用隨濃度變化不大. 磷脂酰膽堿是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的重要組分, 多肽對(duì) DMPC 膜的破壞表明多肽可能對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜具有一定的破壞作用. 多肽與細(xì)菌細(xì)胞膜的重要成分 DMPG 之間的相互作用見(jiàn)圖 4. 與 DMPC 相比, 多肽對(duì) DMPG 的破壞作用明顯降低(圖中循環(huán)伏安電流的增大主要來(lái)自于溶劑對(duì) DMPG 的破壞作用). 在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi), 循環(huán)伏安電流基本上圍繞零點(diǎn)波動(dòng)(扣除溶劑的影響后), 表明多肽不能使細(xì)菌細(xì)胞膜產(chǎn)生孔洞或者瓦解, 多肽的殺菌作用并非源于對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞作用. Rezansoff 等[16]報(bào)道, Combi-1 和 Combi-2 不能造成含 PG 的脂質(zhì)體產(chǎn)生孔洞, 但卻能穿透大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜并聚集到細(xì)胞質(zhì)中, 推測(cè)該類(lèi)多肽的殺菌作用并非來(lái)自于對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞, 其作用靶點(diǎn)可能位于細(xì)胞內(nèi)部, 此結(jié)果和本文所得結(jié)果一致.


2. 4. 2 多肽與脂質(zhì)體的相互作用 脂質(zhì)體也是一種常見(jiàn)的生物膜模型, 可用于研究小分子與生物膜的相互作用, 本文利用此模型考察了多肽對(duì)生物膜的破裂作用[22]. 圖 5 顯示了各多肽對(duì) DMPC 和DMPG 脂質(zhì)體的破裂作用. Combi-1, l-Combi-1, c-Combi-1, l-Combi-2 及 PB 基本不引起 DMPC 脂質(zhì)體的破裂, 而陽(yáng)性對(duì)照 Triton X-100 可引起明顯的脂質(zhì)體破裂, 導(dǎo)致粒度變小[圖 5(A)]. 因此, 多肽并不能同表面活性劑一樣將 DMPC 脂質(zhì)體破裂成碎片, 此結(jié)果表明多肽并不能將細(xì)胞膜破裂成碎片, 而可能是通過(guò)形成孔洞使膜通透性增加. 各多肽也同樣不能引起 DMPG 脂質(zhì)體的破裂[圖 5(B)]. 值得注意的是, 各多肽在濃度較高時(shí)均不同程度地引起了 DMPG 脂質(zhì)體聚集, 從而使溶液中的顆粒變大.這可能是帶正電的多肽和帶負(fù)電的 DMPG 脂質(zhì)體之間強(qiáng)烈的靜電作用所致, 此現(xiàn)象與文獻(xiàn)[14]關(guān)于V4 的報(bào)道一致, 荷正電的 V4 也可引起 DMPG 脂質(zhì)體聚集。

2. 5 模擬計(jì)算
Combi-1, l-Combi-1 和 l-Combi-2 雖不能直接破壞細(xì)菌細(xì)胞膜而殺菌, 但卻可與細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)生相互作用, 從而穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì). 因此, 本文研究了多肽與細(xì)菌細(xì)胞膜中重要的組分 DMPG 的相互作用以探究殺菌活性和多肽-磷脂相互作用的關(guān)系. l-Combi-1 和 l-Combi-2 對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌均表現(xiàn)出較好的殺菌活性. 這 2 條多肽均含有雙活性序列, 是 2 條具有單活性序列的多肽通過(guò)簡(jiǎn)單的氨基酸殘基相連而形成, 但比相應(yīng)的短鏈肽表現(xiàn)出顯著提高的殺菌活性. 本文采用計(jì)算模擬的方法計(jì)算多肽與 DMPG 相互作用時(shí)的結(jié)合能來(lái)評(píng)價(jià)多肽和細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)合程度. 采用 Gaussian 09 中的 PM3半經(jīng)驗(yàn)算法優(yōu)化 DMPG 及各多肽的分子構(gòu)型. 參照文獻(xiàn)[16,17]對(duì) Combi-1 和 Combi-2 結(jié)構(gòu)的報(bào)道, 在優(yōu)化過(guò)程中將多肽與 DMPG 分子的骨架部分進(jìn)行固定以縮短優(yōu)化時(shí)間, 結(jié)果如圖 6 所示. 根據(jù)各多肽和 DMPG 的構(gòu)型優(yōu)化的結(jié)果, 構(gòu)建多肽和 DMPG 形成的復(fù)合物, 并對(duì)復(fù)合物進(jìn)一步優(yōu)化, 復(fù)合物的構(gòu)型見(jiàn)圖 7. 計(jì)算時(shí)主要考慮多肽和 DMPG 分子的靜電和氫鍵結(jié)合, 并同時(shí)考慮盡可能多的結(jié)合模式.以結(jié)合能最低為原則, 根據(jù)式(1)計(jì)算出各多肽與 DMPG 形成的復(fù)合物和單體之間的能量差得結(jié)合能, 數(shù)據(jù)列于表 2[23]. 表 2 顯示所有多肽與 DMPG 分子結(jié)合過(guò)程中的能量差均為負(fù)值, 說(shuō)明多肽與DMPG 的相互作用為釋能過(guò)程, 能量差的絕對(duì)值越大說(shuō)明二者結(jié)合的結(jié)合能越大. 線(xiàn)性肽和環(huán)狀肽在與 DMPG 分子結(jié)合時(shí)比短鏈肽具有更大的結(jié)合能, 說(shuō)明該類(lèi)多肽更易與 DMPG 分子發(fā)生相互作用, 進(jìn)而產(chǎn)生殺菌效果. DMPG 分子頭基荷負(fù)電, 易于與帶正電的氨基酸產(chǎn)生靜電作用. 由圖 7 可見(jiàn), DMPG的負(fù)電頭基在與線(xiàn)性肽和環(huán)狀肽結(jié)合的過(guò)程中, 可同時(shí)與 3 個(gè)帶正電的精氨酸產(chǎn)生靜電作用, 而在與短鏈肽的結(jié)合過(guò)程中只能與 2 個(gè)帶正電的精氨酸產(chǎn)生靜電作用. 這是造成短鏈肽的結(jié)合能小于線(xiàn)性肽和環(huán)狀肽的主要原因. 此結(jié)果和實(shí)驗(yàn)所得殺菌活性數(shù)據(jù)基本一致, 即具有 2 個(gè)活性序列的線(xiàn)性肽和環(huán)狀肽比具有單個(gè)活性序列的短鏈肽殺菌活性更強(qiáng). Combi-1 雖然為短鏈肽, 但由于其構(gòu)型的影響, 第 3個(gè)精氨酸距荷負(fù)電的 DMPG 分子頭基相對(duì)較近, 因此結(jié)合能比其它短鏈肽高, 殺菌活性也明顯優(yōu)于其它短鏈肽. 線(xiàn)性肽和環(huán)狀肽與 DMPG 分子的結(jié)合能相近. c-Combi-1 和 c-Combi-2 環(huán)狀肽的肽鏈較長(zhǎng),所形成的肽環(huán)足夠大, 因此磷脂分子可以完全插入肽環(huán)中并與 3 個(gè)精氨酸產(chǎn)生靜電作用, 其作用模式與線(xiàn)性肽類(lèi)似, 因此環(huán)狀肽的活性與線(xiàn)性肽相似.

3 結(jié) 論


設(shè)計(jì)合成了具有 2 個(gè)活性序列的線(xiàn)性和環(huán)狀多肽及具有單個(gè)活性序列的短鏈多肽, 研究了它們的殺菌活性、 對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性和溶血性及與磷脂之間的相互作用, 并采用計(jì)算模擬的方法計(jì)算了多肽與細(xì)菌細(xì)胞膜中重要成分磷脂酰甘油(DMPG)的結(jié)合能, 從理論上解釋了其活性. 結(jié)果表明,含 2 個(gè)活性序列的線(xiàn)性和環(huán)狀多肽比含單個(gè)活性序列的短鏈肽具有較高的殺菌活性, 活性提高幅度視不同的序列而異. 經(jīng)過(guò)計(jì)算模擬, 多肽的殺菌活性與多肽-磷脂的結(jié)合能顯示出較高的相關(guān)性. 線(xiàn)性肽和環(huán)狀肽與 DMPG 的結(jié)合能高于短鏈肽. 計(jì)算模擬的方法為研究抗菌肽的殺菌活性從理論上提供了一定的依據(jù). 線(xiàn)性多肽具有較高的殺菌活性, 生產(chǎn)成本較低, 且對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性和溶血性均較低, 因此具有進(jìn)一步的研究?jī)r(jià)值和潛在的應(yīng)用價(jià)值. 采用固體支撐的磷脂雙層膜及脂質(zhì)體模擬生物膜, 對(duì)多肽的作用機(jī)理進(jìn)行了初步研究. 結(jié)果表明, 多肽 Combi-1, l-Combi-1 和 l-Combi-2 可以使DMPC 膜產(chǎn)生孔洞而使細(xì)胞膜通透性增加. 而對(duì)于 DMPG 膜, 多肽并未在 DMPG 膜上產(chǎn)生明顯孔洞,而是引起了磷脂的聚集, 因此細(xì)菌細(xì)胞膜可能不是該類(lèi)多肽殺菌的主要作用靶點(diǎn).


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