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新型抗菌肽的設計、 活性研究及與磷脂相互作用的計算模擬
瀏覽量:216 | 2024/6/12 17:42:51


摘要:設計合成了多個具有 2 個活性序列的線性和環(huán)狀多肽及具有單個活性序列的短鏈多肽, 研究了它們的殺菌活性, 發(fā)現(xiàn)其殺菌活性順序為長鏈肽>環(huán)狀肽>短鏈肽, 特別是線性的 Linear-KT 和 Linear-KS 對多種革蘭氏陰性菌和陽性菌均具有較高的殺菌活性. 采用 MTT 法考察了 Linear-KT 和 Linear-KS 對正常細胞的毒性, 其中 Linear-KS 表現(xiàn)出較低的細胞毒性, 優(yōu)于陽性對照多粘菌素 B. 利用計算模擬的方法計算了多肽與細菌細胞膜中磷脂酰甘油(DMPG)的相互作用. 結果表明, 多肽和 DMPG 的結合能也表現(xiàn)出長鏈肽>環(huán)狀肽>短鏈肽的規(guī)律, 特別是 Linear-KT 和 Linear-KS 具有較高的結合能. 長鏈肽含有 2 個活性序列, 可提供多個荷正電的氨基酸與荷負電的磷脂結合, 結合能較大, 殺菌活性較強. 同時, 柔性的結構及 Linear-KT 和Linear-KS 中絲氨酸和蘇氨酸的B碳上的羥基可與磷脂上的羰基形成多個氫鍵, 進一步增大了結合能. 計算模擬的方法為抗菌肽的殺菌活性從理論上提供了一定的依據(jù).


抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)是宿主防御體系中天然免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生的具有一定殺菌效果的短肽類物質, 廣泛分布于自然界中, 具有廣譜抗菌性. 很多抗菌肽不僅對革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌具有殺菌作用, 而且對某些真菌、 原生生物、 甚至腫瘤細胞和病毒也具有一定的抑制作用[1 ~ 4].研究表明, 抗菌肽的主要作用機理是針對生物膜, 通過破壞生物膜的完整性, 使其產(chǎn)生孔洞或者生物膜瓦解而使內部物質外流, 或者穿透生物膜進入細胞內部, 干預一些重要的細胞過程, 從而起到殺菌的作用[5]. 由于抗菌肽作用主要針對于細胞膜結構, 其普遍具有比較低的抗藥性, 因此也被認為是抗生素的替代品和增效劑, 用以解決日益嚴重的細菌抗藥性問題[6].


根據(jù)天然抗菌肽的特性進行全新的抗菌肽設計是發(fā)現(xiàn)新抗菌肽的重要途徑[7], 其中很多含有多個活性片段的多肽具有較高的生物活性. 如含有 2 個堿性溶解單位的 24 個氨基酸殘基的多肽 WLBU2 比具有單個堿性溶解單位的多肽 LBU 及色氨酸取代的 WLBU 表現(xiàn)出更高的殺菌活性及選擇性[8]. Frecer等[9]從頭設計出新型的具有雙活性序列 HBHPHBH 或 HBHBHBH(B: 帶正電的氨基酸; H: 疏水性氨基酸; P: 極性氨基酸)的環(huán)狀抗菌肽. 其中 1 個環(huán)狀抗菌肽(V4, CVKVQVKVGSGVKVQVKVC)具有較高的抗菌性, 其雙活性序列使兩親性加強, 有助于抗菌肽生物活性的表現(xiàn). 但該肽由于含有大量疏水性纈氨酸, 水溶性差, 限制了其應用[10,11]. 除 WLBU2 和 V4 外, 不少抗菌肽也存在類似的現(xiàn)象. 根據(jù)抗菌肽 Tritrpticin 設計的對稱模擬肽具有比 Tritrpticin 高 2 ~ 8 倍的抗菌肽活性[12]. Sushi 3 抗菌肽的二聚體比單體具有更高的破壞脂多糖膠團的能力[13]. Pexiganan(MSI-78) 和 PG-1 在溶液中是單體, 當其與生物膜相結合時, 形成兩親的二聚體, 表明二聚體是活性構象[14]. 二聚體也可看成是分子中含有 2個活性序列. 此外, 某些天然抗菌肽序列中也包含有 2 個相同的多肽片段, 如 Gramicidin S( CycloVOLdFPVOLdFP)由 2 個相同的片段環(huán)化而成[15]. 因此, 具有雙活性序列的多肽可能具有潛在的生物活性. 本文設計了含有雙活性序列的抗菌肽并考察了其活性, 研究了雙活性序列是否有助于提高抗菌肽的活性. 鑒于多肽的化學合成成本, 具備抗菌活性的短肽具有大批量生產(chǎn)的潛力, 因此選取具有較短序列的多肽作為活性序列, 設計了包含 2 個相同活性序列的多肽, 測試了其抗菌活性及毒性, 并運用計算模擬的方法計算了所設計的多肽與細菌的細胞膜中一種重要的磷脂———磷脂酰甘油(DMPG)的結合能, 并對二者進行了比較. 由于二硫鍵的環(huán)化有助于穩(wěn)定多肽的結構, 因此還設計了同時具有單個二硫鍵和環(huán)狀結構的多肽, 研究了其抗菌活性和環(huán)狀結構的關系, 為具有環(huán)狀結構的抗菌肽的結構和活性關系研究以及抗菌肽的設計提供依據(jù).


1 實驗部分


1. 1 試劑與儀器

革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌(Escherichia coli)、 銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)和鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii); 革蘭氏陽性菌包括金黃色葡萄球菌( Staphyloccocus aureus)和藤黃微球菌(Micrococcus luteus). 其中, 大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌及藤黃微球菌由河南省藥品檢驗所提供, 其余菌株由臨床分離得到. 人支氣管上皮細胞株(BEAS-2B 細胞)由鄭州大學吳衛(wèi)東教授饋贈; 多粘菌素B(Polymyxin B, PB)和四甲基偶氮(MTT)購自 Sigma 公司; 其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純; 實驗用水為二次蒸餾水.


Spectra MR 酶標儀(美國 DYNEX 公司); IS10-OMNIL8 型紅外吸收光譜儀(美國 Thermo Fisher 公司); J-815 型圓二色光譜儀(日本 JASCO 公司)


1. 2 實驗過程
1. 2. 1 殺菌實驗 挑取適量菌種在固體 Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中劃線, 置于 37 度培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng). 挑取適量處于對數(shù)生長期的細菌于生理鹽水中, 配制 0.5 ~ 1 麥氏濁度的菌懸液, 此時細菌菌落數(shù)約為 1X10^8cfu / mL, 使用時稀釋至 1X10^6cfu / mL. 配制濃度為 2 mg / mL 的多肽溶液. 采用微量肉湯二倍稀釋法測定合成多肽對各細菌的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration, MIC)[16], 同時進行溶劑、 只加菌液不加多肽的陰性對照和加入多粘菌素 B 的陽性對照, 每個多肽平行進行 3 次. 于 37度恒溫箱中培養(yǎng) 12 h, 觀察孔內溶液的混濁情況, 96 孔板同排中肉眼所見澄清孔所對應的最小濃度即為該多肽的 MIC 值. 采用半數(shù)有效劑量(ED50 )評價多肽的殺菌效率. 采用酶標儀測定上述 96 孔板600 nm 處的光密度值(OD600 ). 按下式計算殺菌百分數(shù), 作圖得出多肽殺傷細菌的半數(shù)有效劑量.

1. 2. 2 細胞毒性實驗 采用 MTT 法測定細胞毒性[17]. 用含 10% (體積分數(shù))胎牛血清的 RPMI1640(含 100 U/ mL 青霉素和 100 U/ mL 鏈霉素)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng) BEAS-2B 細胞. 采用對數(shù)生長期的 BEAS-2B 細胞, 用含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)液調節(jié)細胞濃度為 5X10^4Cell / mL, 接種到 96 孔板上,每孔 200 uL. 培養(yǎng) 12 h 后, 加入不同濃度的多肽(終濃度分別為 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 和 320ug / mL), 每種多肽濃度設 4 個復孔, 并設不加細胞液的調零孔和只加細胞液、 不加肽液的空白對照孔. 培養(yǎng) 4 h 后, 每孔加入 180 uL 不含血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)液和 20 uL 5 g / L 的 MTT 試劑, 繼續(xù)孵育 4 h, 棄去上清液, 加入 180 uL DMSO, 輕輕振蕩 10 min, 于 490 nm 波長下測定光密度值.
1. 2. 3 紅外光譜測定 取多肽試樣約 1 mg 與 KBr 混勻, 壓片, 測定多肽的紅外光譜.
1. 2. 4 圓二色光譜測定 在室溫下, 采用 0.1 mm 石英比色皿測定多肽在水溶液中的遠紫外圓二色光譜. 掃描范圍 175 ~ 260 nm, 每條多肽掃描 3 次, 掃描速度 1000 nm / min, 多肽濃度為 1 mg / mL.
1. 2. 5 計算方法 磷脂酰甘油(DMPG)是細菌的細胞膜中的一種重要組成成分, 帶有負電荷, 在抗菌肽和細菌細胞膜結合過程中具有重要作用. 采用 DMPG 模擬細菌細胞膜, 對多肽和 DMPG 的結合能進行了計算. 多肽與 DMPG 分子的初始構型由 Gaussian View 和 Amber 軟件中的 leap 模塊共同構建, 計算使用 Gaussian 09 軟件[18], 采用 PM3 半經(jīng)驗算法對 DMPG 及各個多肽分子進行構型優(yōu)化. 然后對多肽與 DMPG 分子的復合物進行優(yōu)化來模擬多肽與 DMPG 分子的相互作用, 由于多肽與 DMPG 分子的復合物分子量較大, 模擬時仍然采用 PM3 半經(jīng)驗算法進行優(yōu)化. 多肽與 DMPG 分子主要通過靜電作用結合在一起, 同時還會形成氫鍵, 計算時需要同時考慮 2 種作用. 通過結合能來衡量多肽與 DMPG 分子間的相互作用程度, 結合能計算方法如下:

式中, E 為優(yōu)化后各組分的單點能. 計算時盡量考慮不同的結合模式, 以使多肽與 DMPG 達到最好的結合.


2 結果與討論


2. 1 多肽的設計
內毒素又稱脂多糖, 是革蘭氏陰性菌外層細胞膜的重要成分之一, 主要位于膜的外側, 是與各種外源性物質最先接觸的部分. Lipid A 是內毒素中具有生物活性的保守部分. 研究表明[9], 與內毒素結合的宿主防御蛋白由富含帶正電的氨基酸組成兩親性結構, 具有殺菌功能, 因此基于宿主防御蛋白的結合基元設計合成的多肽可能保留其殺菌活性, 具有潛在的應用價值. Frecer 等[19]基于此計算了多個多肽片斷和 Lipid A 的結合能, 發(fā)現(xiàn) KFNFK, KFTFK 及 KFSFK 序列多肽與 Lipid A 結合釋放了較高的結合能, 構象較穩(wěn)定, 從理論上預測了這 3 個多肽片斷可能具有抗菌活性. KFNFK, KFTFK 和 KFSFK的極性和非極性氨基酸交叉排列, 分別形成疏水面和親水面, 氨基酸序列符合 BHPHB 分布規(guī)律. 具有與 Lipid A 較高的結合能表明這 3 個多肽可能更容易和細菌的細胞膜結合. 因此本文將這 3 個多肽視為一個活性序列, 參照 V4 抗菌肽的設計, 采用 GSG 將 2 個活性序列連接形成含有雙活性序列的線性多肽 Linear-KT, Linear-KS 和 Linear-KN. 為進一步固定多肽的構象, 使疏水面更疏水, 親水面更親水,采用二硫鍵環(huán)化線性多肽, 形成環(huán)狀的含有雙活性序列的多肽 Cyclic-KS, Cyclic-KN 和 Cyclic-KT(具體序列見表 1).

2. 2 多肽的最小抑菌濃度的確定

采用目視法, 觀察肉眼所見的澄清孔所對應的最小濃度, 考察了多肽對多種革蘭氏陰性菌和陽性菌的抗菌活性, 結果列于表 1. 由表 1 數(shù)據(jù)可以看出, 具有單個活性序列的多肽 KT, KS 及 KN 對 5 種細菌的殺菌活性均不理想, 最小抑菌濃度均不低于 500 mg / mL, 說明具有單個結合序列的多肽活性不高. 具有雙活性序列的線性多肽對細菌的殺菌活性較具有單個活性序列的多肽有所提高, 特別是 Line-ar-KT 和 Linear-KS, 對金黃色葡萄球菌及藤黃微球菌的最小抑菌濃度低至 16 mg / mL. 而環(huán)狀的多肽對細菌的殺菌活性普遍較低, 介于具有單個活性序列和雙活性序列的線性多肽之間. 在對 5 種細菌的殺菌活性檢驗中, 含有雙活性序列的多肽 Linear-KT 和 Linear-KS 均比 Linear-KN 表現(xiàn)出較高的殺菌活性,而 Linear-KT 和 Linear-KS 的活性則相近. 具有一定活性的多肽對革蘭氏陽性菌的殺菌活性均略強于革蘭氏陰性菌


2. 3 多肽對細菌的半數(shù)有效劑量的確定
由公式(1)計算得出多肽在各濃度下的殺菌百分數(shù), 繪制其殺菌率曲線并獲得半數(shù)有效劑量ED50 , 結果列于表 2. 圖 1 為 Linear-KT 和 Linear-KS 對金黃色葡萄球菌的殺菌率曲線.

2. 4 細胞毒性實驗
選取所設計多肽中殺菌效果較好的 Linear-KT 和 Linear-KS 進行細胞毒性實驗, 結果見圖 2. 陽性對照多肽類抗菌素多粘菌素 B 雖具有較強的殺菌活性(表 1), 但也引起部分正常細胞的死亡, 特別是其濃度高于 80 mg / mL 時, 多粘菌素 B 可導致較高的細胞死亡率. Linear-KT 的細胞毒性較大, 在大部分的研究濃度下均對細胞有毒性. 相比之下,Linear-KS 對細胞的毒性較小, 在濃度不高于 160ug / mL 時, 其對細胞的抑制率均不超過 15% , 低濃度時毒性更低. Linear-KS 具有較高的殺菌活性且細胞毒性較低, 因此 Linear-KS 具有進一步研究的價值和潛在的應用價值.

2. 5 紅外光譜解析
紅外光譜是解析多肽以及蛋白質二級結構的有力手段. 多肽和蛋白質在紅外光譜區(qū)有若干特征吸收帶, 主要有酰胺I帶(1600 ~ 1700 cm-1)和酰胺II帶(1600 ~ 1500 cm-1). 酰胺I帶主要由多肽骨架肽鏈 C O 的伸縮振動引起, 對研究二級結構最有價值[20]. 圖3 為 KT, Linear-KT 和 Cyclic-KT 的紅外光譜圖. 可見, KT 在 1600 ~ 1700 cm-1處有 1 個明顯的強峰, 峰形較寬; Linear-KT 在 1679 及 1632 cm-1處有 2 個很強的吸收峰; 而 Cyclic-KT 在 1677 及 1631 cm-1處也有 2 個很強的吸收峰. 因此, Linear-KT和 Cyclic-KT 均可能形成折疊結構. 采用紅外光譜雖然可從一定程度上提供多肽的二級結構信息, 但由于 1600 ~ 1700 cm-1波段受干擾因素較多, 且紅外光譜測試中多肽處于固體狀態(tài), 不能反映出多肽在水溶液中的狀態(tài), 因此進一步采用圓二色光譜考察了多肽在水中的二級結構.

2. 6 圓二色光譜測定
圖 4 為短鏈多肽 KT、 線性多肽 Linear-KT 及環(huán)狀多肽 Cyclic-KT 的圓二色光譜. 短鏈多肽 KT 在200 nm 處有 1 個負峰, 為無規(guī)卷曲結構的特征峰[21,22]. KT 只包含 5 個氨基酸殘基, 肽鏈長度較短, 不足以形成二級結構, 因此以無規(guī)結構存在于溶液中. 多肽 Linear-KT 在 200 nm 處也有 1 個負峰, 表明 Linear-KT在水溶液中也呈無規(guī)結構. 環(huán)狀多肽 Cyclic-KT 在 202及 213 nm 處有 2 個負峰, 且在 195 nm 處有 1 個正峰.典型的 B-sheet 結構在 216 nm 處有 1 個負峰, 195 nm 處有 1 個正峰, 因此 Cyclic-KT 在溶液中可能以無規(guī)及部分 B-sheet 結構存在. Cyclic-KT 以二硫鍵將多肽鏈環(huán)化,使得多肽的構象相對固定, 因此表現(xiàn)出部分 B-sheet 二級結構. 本研究中所用多肽長度較短, 因此不足以形成明顯的二級結構, 圓二色光譜信號總體較低.

2. 7 模擬計算
Linear-KT 和 Linear-KS 對革蘭氏陰性菌和陽性菌均表現(xiàn)出較好的殺菌活性, 特別是對革蘭氏陽性菌. 這 2 條多肽均含有雙活性序列, 是由 2 條具有單活性序列的多肽通過簡單的氨基酸殘基相連而形成, 但比相應的具有單活性序列的多肽表現(xiàn)出顯著提高的殺菌活性. 因此本文采用計算模擬的方法計算了所設計的多肽與磷脂相互作用時的結合能, 以評價多肽和細胞膜的結合程度. 磷脂是細胞膜的主要組成成分, 細菌的細胞膜含有較高含量的 DMPG, 而哺乳動物的細胞膜中 DMPG 的含量則很少, 因此本文采用 DMPG 為研究對象考察其與多肽的結合能力. 采用 Gaussian 09 中的 PM3 半經(jīng)驗算法優(yōu)化DMPG 及各多肽的分子構型. 紅外光譜圖提示線性和環(huán)狀的多肽形成折疊結構, 圓二色光譜也表明環(huán)狀多肽可能具有部分 B-sheet 二級結構, 因此以折疊結構優(yōu)化線性及環(huán)狀多肽, 在優(yōu)化過程中將多肽與DMPG 分子的骨架部分進行固定以縮短優(yōu)化時間, 結果見圖 5. 根據(jù)多肽和 DMPG 的構型優(yōu)化結果構建多肽和 DMPG 形成的復合物, 并對復合物進一步優(yōu)化, 復合物的構型見圖 6. 計算時主要考慮多肽與 DMPG 分子的靜電和氫鍵結合, 同時考慮盡可能多的結合模式. 以結合能最低為原則[23], 根據(jù)公式(2)計算出多肽與 DMPG 形成的復合物和各單體之間的能量差即得到結合能, 數(shù)據(jù)列于表 3. 由表 3 可見, 所有多肽與 DMPG 分子結合過程的能量差均為負值, 說明多肽與 DMPG 的相互作用過程釋放能量, 能量差的絕對值越大說明二者的結合能越大. 長鏈肽和環(huán)狀肽與 DMPG 分子結合時具有較大的結合能, 遠高于短鏈肽. 結合能越大, 說明該類多肽更易與 DMPG 分子產(chǎn)生相互作用, 進而產(chǎn)生殺菌效果. DMPG 分子頭基帶負電, 可與帶正電的氨基酸產(chǎn)生靜電作用. DMPG 的負電頭基在與長鏈肽和環(huán)肽結合的過程中, 可同時與 2 個帶正電的賴氨酸產(chǎn)生靜電作用, 而在與短鏈肽的結合過程中只能與 1個帶正電的賴氨酸產(chǎn)生靜電作用. 這是造成短鏈肽的結合能遠小于長鏈肽與環(huán)狀肽的主要原因. 此結果和實驗所得的殺菌活性數(shù)據(jù)基本一致, 即具有 2 個活性序列的長鏈肽和環(huán)狀肽比具有單個活性序列的短鏈肽殺菌活性更強.

在長鏈肽和環(huán)狀肽中, 序列中含有絲氨酸和蘇氨酸的多肽比相應的含有天冬酰胺的多肽結合能大, 這是因為絲氨酸和蘇氨酸的 茁 碳上的羥基可與磷脂分子 2 條碳鏈上的羰基形成氫鍵, 從而增大了結合能. 殺菌實驗結果也證明含有絲氨酸和蘇氨酸的多肽活性高于含天冬酰胺的多肽. Frecer 等[19]計算表明, KFTFK, KFSFK 和 KFNFK 與內毒素的活性部分 Lipid A 結合的 Gibbs 自由能分別為-67, -75和-55 kJ/ mol; KFTFK 和 KFSFK 序列與 Lipid A 的結合能更大, 該結果與本文結果一致.


與環(huán)狀肽相比, 長鏈肽與 DMPG 分子的結合能略高于環(huán)狀肽, 這可能是由于多肽結構的影響. 長鏈肽在水溶液中基本以無規(guī)結構存在, 因此多肽結構柔性較大, 可根據(jù)所結合的對象采取更適合的結構與之結合. 特別是 Linear-KT 和 Linear-KS, 其柔性結構使絲氨酸和蘇氨酸的 B碳上的羥基均可與DMPG 分子中 2 條碳鏈上的羰基形成氫鍵, 增大結合能. 而環(huán)狀肽由于受折疊結構和二硫鍵的限制,肽的結構相對固定, 肽環(huán)的大小受限, 使磷脂分子不能完全插入肽環(huán)中, 只能在肽環(huán)平面的側面與其結合, 只與 DMPG 分子中 1 條碳鏈上的羰基形成氫鍵, 氫鍵數(shù)目減少, 結合能降低, 因此環(huán)狀肽的活性不及長鏈肽.


3 結 論


設計合成了多個具有 2 個活性序列的線性和環(huán)狀多肽及具有單個活性序列的短鏈多肽, 研究了其殺菌活性, 并采用計算模擬的方法計算了多肽與細菌細胞膜中重要成分磷脂酰甘油的結合能, 從理論上解釋了其活性. 結果表明, 靜電作用和氫鍵在多肽與磷脂的結合過程中起重要作用. 線性的 Linear-KT 和 Linear-KS 具有雙活性序列, 可同時提供 2 個荷正電氨基酸與磷脂結合, 殺菌活性遠遠大于單活性序列. 將雙活性序列引入同一分子, 可起到提高殺菌活性的作用. 同時 Linear-KT 和 Linear-KS 的柔性結構能夠使多肽與磷脂上的羰基形成多個氫鍵, 因此結合能較大, 具有較強的殺菌活性. 計算模擬的方法為抗菌肽的殺菌活性預測從理論上提供了一定的依據(jù). 利用該方法可在一定程度上預測抗菌肽的殺菌活性, 提高抗菌肽的研發(fā)效率, 為抗菌肽的設計與開發(fā)提供了新途徑.


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