摘要：設(shè)計(jì)合成了多個(gè)具有 2 個(gè)活性序列的線性和環(huán)狀多肽及具有單個(gè)活性序列的短鏈多肽, 研究了它們的殺菌活性, 發(fā)現(xiàn)其殺菌活性順序?yàn)殚L(zhǎng)鏈肽>環(huán)狀肽>短鏈肽, 特別是線性的 Linear-KT 和 Linear-KS 對(duì)多種革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌均具有較高的殺菌活性. 采用 MTT 法考察了 Linear-KT 和 Linear-KS 對(duì)正常細(xì)胞的毒性, 其中 Linear-KS 表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性, 優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照多粘菌素 B. 利用計(jì)算模擬的方法計(jì)算了多肽與細(xì)菌細(xì)胞膜中磷脂酰甘油(DMPG)的相互作用. 結(jié)果表明, 多肽和 DMPG 的結(jié)合能也表現(xiàn)出長(zhǎng)鏈肽>環(huán)狀肽>短鏈肽的規(guī)律, 特別是 Linear-KT 和 Linear-KS 具有較高的結(jié)合能. 長(zhǎng)鏈肽含有 2 個(gè)活性序列, 可提供多個(gè)荷正電的氨基酸與荷負(fù)電的磷脂結(jié)合, 結(jié)合能較大, 殺菌活性較強(qiáng). 同時(shí), 柔性的結(jié)構(gòu)及 Linear-KT 和Linear-KS 中絲氨酸和蘇氨酸的B碳上的羥基可與磷脂上的羰基形成多個(gè)氫鍵, 進(jìn)一步增大了結(jié)合能. 計(jì)算模擬的方法為抗菌肽的殺菌活性從理論上提供了一定的依據(jù).
抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)是宿主防御體系中天然免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生的具有一定殺菌效果的短肽類物質(zhì), 廣泛分布于自然界中, 具有廣譜抗菌性. 很多抗菌肽不僅對(duì)革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽(yáng)性菌具有殺菌作用, 而且對(duì)某些真菌、 原生生物、 甚至腫瘤細(xì)胞和病毒也具有一定的抑制作用[1 ~ 4].研究表明, 抗菌肽的主要作用機(jī)理是針對(duì)生物膜, 通過破壞生物膜的完整性, 使其產(chǎn)生孔洞或者生物膜瓦解而使內(nèi)部物質(zhì)外流, 或者穿透生物膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部, 干預(yù)一些重要的細(xì)胞過程, 從而起到殺菌的作用[5]. 由于抗菌肽作用主要針對(duì)于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu), 其普遍具有比較低的抗藥性, 因此也被認(rèn)為是抗生素的替代品和增效劑, 用以解決日益嚴(yán)重的細(xì)菌抗藥性問題[6].
根據(jù)天然抗菌肽的特性進(jìn)行全新的抗菌肽設(shè)計(jì)是發(fā)現(xiàn)新抗菌肽的重要途徑[7], 其中很多含有多個(gè)活性片段的多肽具有較高的生物活性. 如含有 2 個(gè)堿性溶解單位的 24 個(gè)氨基酸殘基的多肽 WLBU2 比具有單個(gè)堿性溶解單位的多肽 LBU 及色氨酸取代的 WLBU 表現(xiàn)出更高的殺菌活性及選擇性[8]. Frecer等[9]從頭設(shè)計(jì)出新型的具有雙活性序列 HBHPHBH 或 HBHBHBH(B: 帶正電的氨基酸; H: 疏水性氨基酸; P: 極性氨基酸)的環(huán)狀抗菌肽. 其中 1 個(gè)環(huán)狀抗菌肽(V4, CVKVQVKVGSGVKVQVKVC)具有較高的抗菌性, 其雙活性序列使兩親性加強(qiáng), 有助于抗菌肽生物活性的表現(xiàn). 但該肽由于含有大量疏水性纈氨酸, 水溶性差, 限制了其應(yīng)用[10,11]. 除 WLBU2 和 V4 外, 不少抗菌肽也存在類似的現(xiàn)象. 根據(jù)抗菌肽 Tritrpticin 設(shè)計(jì)的對(duì)稱模擬肽具有比 Tritrpticin 高 2 ~ 8 倍的抗菌肽活性[12]. Sushi 3 抗菌肽的二聚體比單體具有更高的破壞脂多糖膠團(tuán)的能力[13]. Pexiganan(MSI-78) 和 PG-1 在溶液中是單體, 當(dāng)其與生物膜相結(jié)合時(shí), 形成兩親的二聚體, 表明二聚體是活性構(gòu)象[14]. 二聚體也可看成是分子中含有 2個(gè)活性序列. 此外, 某些天然抗菌肽序列中也包含有 2 個(gè)相同的多肽片段, 如 Gramicidin S( CycloVOLdFPVOLdFP)由 2 個(gè)相同的片段環(huán)化而成[15]. 因此, 具有雙活性序列的多肽可能具有潛在的生物活性. 本文設(shè)計(jì)了含有雙活性序列的抗菌肽并考察了其活性, 研究了雙活性序列是否有助于提高抗菌肽的活性. 鑒于多肽的化學(xué)合成成本, 具備抗菌活性的短肽具有大批量生產(chǎn)的潛力, 因此選取具有較短序列的多肽作為活性序列, 設(shè)計(jì)了包含 2 個(gè)相同活性序列的多肽, 測(cè)試了其抗菌活性及毒性, 并運(yùn)用計(jì)算模擬的方法計(jì)算了所設(shè)計(jì)的多肽與細(xì)菌的細(xì)胞膜中一種重要的磷脂———磷脂酰甘油(DMPG)的結(jié)合能, 并對(duì)二者進(jìn)行了比較. 由于二硫鍵的環(huán)化有助于穩(wěn)定多肽的結(jié)構(gòu), 因此還設(shè)計(jì)了同時(shí)具有單個(gè)二硫鍵和環(huán)狀結(jié)構(gòu)的多肽, 研究了其抗菌活性和環(huán)狀結(jié)構(gòu)的關(guān)系, 為具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的抗菌肽的結(jié)構(gòu)和活性關(guān)系研究以及抗菌肽的設(shè)計(jì)提供依據(jù).
1 實(shí)驗(yàn)部分
1. 1 試劑與儀器
革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌(Escherichia coli)、 銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)和鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii); 革蘭氏陽(yáng)性菌包括金黃色葡萄球菌( Staphyloccocus aureus)和藤黃微球菌(Micrococcus luteus). 其中, 大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌及藤黃微球菌由河南省藥品檢驗(yàn)所提供, 其余菌株由臨床分離得到. 人支氣管上皮細(xì)胞株(BEAS-2B 細(xì)胞)由鄭州大學(xué)吳衛(wèi)東教授饋贈(zèng); 多粘菌素B(Polymyxin B, PB)和四甲基偶氮(MTT)購(gòu)自 Sigma 公司; 其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純; 實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.
Spectra MR 酶標(biāo)儀(美國(guó) DYNEX 公司); IS10-OMNIL8 型紅外吸收光譜儀(美國(guó) Thermo Fisher 公司); J-815 型圓二色光譜儀(日本 JASCO 公司)
1. 2 實(shí)驗(yàn)過程
1. 2. 1 殺菌實(shí)驗(yàn) 挑取適量菌種在固體 Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中劃線, 置于 37 度培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng). 挑取適量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌于生理鹽水中, 配制 0.5 ~ 1 麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙? 此時(shí)細(xì)菌菌落數(shù)約為 1X10^8cfu / mL, 使用時(shí)稀釋至 1X10^6cfu / mL. 配制濃度為 2 mg / mL 的多肽溶液. 采用微量肉湯二倍稀釋法測(cè)定合成多肽對(duì)各細(xì)菌的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration, MIC)[16], 同時(shí)進(jìn)行溶劑、 只加菌液不加多肽的陰性對(duì)照和加入多粘菌素 B 的陽(yáng)性對(duì)照, 每個(gè)多肽平行進(jìn)行 3 次. 于 37度恒溫箱中培養(yǎng) 12 h, 觀察孔內(nèi)溶液的混濁情況, 96 孔板同排中肉眼所見澄清孔所對(duì)應(yīng)的最小濃度即為該多肽的 MIC 值. 采用半數(shù)有效劑量(ED50 )評(píng)價(jià)多肽的殺菌效率. 采用酶標(biāo)儀測(cè)定上述 96 孔板600 nm 處的光密度值(OD600 ). 按下式計(jì)算殺菌百分?jǐn)?shù), 作圖得出多肽殺傷細(xì)菌的半數(shù)有效劑量.
1. 2. 2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 采用 MTT 法測(cè)定細(xì)胞毒性[17]. 用含 10% (體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的 RPMI1640(含 100 U/ mL 青霉素和 100 U/ mL 鏈霉素)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng) BEAS-2B 細(xì)胞. 采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 BEAS-2B 細(xì)胞, 用含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為 5X10^4Cell / mL, 接種到 96 孔板上,每孔 200 uL. 培養(yǎng) 12 h 后, 加入不同濃度的多肽(終濃度分別為 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 和 320ug / mL), 每種多肽濃度設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔, 并設(shè)不加細(xì)胞液的調(diào)零孔和只加細(xì)胞液、 不加肽液的空白對(duì)照孔. 培養(yǎng) 4 h 后, 每孔加入 180 uL 不含血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)液和 20 uL 5 g / L 的 MTT 試劑, 繼續(xù)孵育 4 h, 棄去上清液, 加入 180 uL DMSO, 輕輕振蕩 10 min, 于 490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值.
1. 2. 3 紅外光譜測(cè)定 取多肽試樣約 1 mg 與 KBr 混勻, 壓片, 測(cè)定多肽的紅外光譜.
1. 2. 4 圓二色光譜測(cè)定 在室溫下, 采用 0.1 mm 石英比色皿測(cè)定多肽在水溶液中的遠(yuǎn)紫外圓二色光譜. 掃描范圍 175 ~ 260 nm, 每條多肽掃描 3 次, 掃描速度 1000 nm / min, 多肽濃度為 1 mg / mL.
1. 2. 5 計(jì)算方法 磷脂酰甘油(DMPG)是細(xì)菌的細(xì)胞膜中的一種重要組成成分, 帶有負(fù)電荷, 在抗菌肽和細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合過程中具有重要作用. 采用 DMPG 模擬細(xì)菌細(xì)胞膜, 對(duì)多肽和 DMPG 的結(jié)合能進(jìn)行了計(jì)算. 多肽與 DMPG 分子的初始構(gòu)型由 Gaussian View 和 Amber 軟件中的 leap 模塊共同構(gòu)建, 計(jì)算使用 Gaussian 09 軟件[18], 采用 PM3 半經(jīng)驗(yàn)算法對(duì) DMPG 及各個(gè)多肽分子進(jìn)行構(gòu)型優(yōu)化. 然后對(duì)多肽與 DMPG 分子的復(fù)合物進(jìn)行優(yōu)化來模擬多肽與 DMPG 分子的相互作用, 由于多肽與 DMPG 分子的復(fù)合物分子量較大, 模擬時(shí)仍然采用 PM3 半經(jīng)驗(yàn)算法進(jìn)行優(yōu)化. 多肽與 DMPG 分子主要通過靜電作用結(jié)合在一起, 同時(shí)還會(huì)形成氫鍵, 計(jì)算時(shí)需要同時(shí)考慮 2 種作用. 通過結(jié)合能來衡量多肽與 DMPG 分子間的相互作用程度, 結(jié)合能計(jì)算方法如下:
式中, E 為優(yōu)化后各組分的單點(diǎn)能. 計(jì)算時(shí)盡量考慮不同的結(jié)合模式, 以使多肽與 DMPG 達(dá)到最好的結(jié)合.
2 結(jié)果與討論
2. 1 多肽的設(shè)計(jì)
內(nèi)毒素又稱脂多糖, 是革蘭氏陰性菌外層細(xì)胞膜的重要成分之一, 主要位于膜的外側(cè), 是與各種外源性物質(zhì)最先接觸的部分. Lipid A 是內(nèi)毒素中具有生物活性的保守部分. 研究表明[9], 與內(nèi)毒素結(jié)合的宿主防御蛋白由富含帶正電的氨基酸組成兩親性結(jié)構(gòu), 具有殺菌功能, 因此基于宿主防御蛋白的結(jié)合基元設(shè)計(jì)合成的多肽可能保留其殺菌活性, 具有潛在的應(yīng)用價(jià)值. Frecer 等[19]基于此計(jì)算了多個(gè)多肽片斷和 Lipid A 的結(jié)合能, 發(fā)現(xiàn) KFNFK, KFTFK 及 KFSFK 序列多肽與 Lipid A 結(jié)合釋放了較高的結(jié)合能, 構(gòu)象較穩(wěn)定, 從理論上預(yù)測(cè)了這 3 個(gè)多肽片斷可能具有抗菌活性. KFNFK, KFTFK 和 KFSFK的極性和非極性氨基酸交叉排列, 分別形成疏水面和親水面, 氨基酸序列符合 BHPHB 分布規(guī)律. 具有與 Lipid A 較高的結(jié)合能表明這 3 個(gè)多肽可能更容易和細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)合. 因此本文將這 3 個(gè)多肽視為一個(gè)活性序列, 參照 V4 抗菌肽的設(shè)計(jì), 采用 GSG 將 2 個(gè)活性序列連接形成含有雙活性序列的線性多肽 Linear-KT, Linear-KS 和 Linear-KN. 為進(jìn)一步固定多肽的構(gòu)象, 使疏水面更疏水, 親水面更親水,采用二硫鍵環(huán)化線性多肽, 形成環(huán)狀的含有雙活性序列的多肽 Cyclic-KS, Cyclic-KN 和 Cyclic-KT(具體序列見表 1).
2. 2 多肽的最小抑菌濃度的確定
采用目視法, 觀察肉眼所見的澄清孔所對(duì)應(yīng)的最小濃度, 考察了多肽對(duì)多種革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌的抗菌活性, 結(jié)果列于表 1. 由表 1 數(shù)據(jù)可以看出, 具有單個(gè)活性序列的多肽 KT, KS 及 KN 對(duì) 5 種細(xì)菌的殺菌活性均不理想, 最小抑菌濃度均不低于 500 mg / mL, 說明具有單個(gè)結(jié)合序列的多肽活性不高. 具有雙活性序列的線性多肽對(duì)細(xì)菌的殺菌活性較具有單個(gè)活性序列的多肽有所提高, 特別是 Line-ar-KT 和 Linear-KS, 對(duì)金黃色葡萄球菌及藤黃微球菌的最小抑菌濃度低至 16 mg / mL. 而環(huán)狀的多肽對(duì)細(xì)菌的殺菌活性普遍較低, 介于具有單個(gè)活性序列和雙活性序列的線性多肽之間. 在對(duì) 5 種細(xì)菌的殺菌活性檢驗(yàn)中, 含有雙活性序列的多肽 Linear-KT 和 Linear-KS 均比 Linear-KN 表現(xiàn)出較高的殺菌活性,而 Linear-KT 和 Linear-KS 的活性則相近. 具有一定活性的多肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的殺菌活性均略強(qiáng)于革蘭氏陰性菌
2. 3 多肽對(duì)細(xì)菌的半數(shù)有效劑量的確定
由公式(1)計(jì)算得出多肽在各濃度下的殺菌百分?jǐn)?shù), 繪制其殺菌率曲線并獲得半數(shù)有效劑量ED50 , 結(jié)果列于表 2. 圖 1 為 Linear-KT 和 Linear-KS 對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌率曲線.
2. 4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
選取所設(shè)計(jì)多肽中殺菌效果較好的 Linear-KT 和 Linear-KS 進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn), 結(jié)果見圖 2. 陽(yáng)性對(duì)照多肽類抗菌素多粘菌素 B 雖具有較強(qiáng)的殺菌活性(表 1), 但也引起部分正常細(xì)胞的死亡, 特別是其濃度高于 80 mg / mL 時(shí), 多粘菌素 B 可導(dǎo)致較高的細(xì)胞死亡率. Linear-KT 的細(xì)胞毒性較大, 在大部分的研究濃度下均對(duì)細(xì)胞有毒性. 相比之下,Linear-KS 對(duì)細(xì)胞的毒性較小, 在濃度不高于 160ug / mL 時(shí), 其對(duì)細(xì)胞的抑制率均不超過 15% , 低濃度時(shí)毒性更低. Linear-KS 具有較高的殺菌活性且細(xì)胞毒性較低, 因此 Linear-KS 具有進(jìn)一步研究的價(jià)值和潛在的應(yīng)用價(jià)值.
2. 5 紅外光譜解析
紅外光譜是解析多肽以及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的有力手段. 多肽和蛋白質(zhì)在紅外光譜區(qū)有若干特征吸收帶, 主要有酰胺I帶(1600 ~ 1700 cm-1)和酰胺II帶(1600 ~ 1500 cm-1). 酰胺I帶主要由多肽骨架肽鏈 C O 的伸縮振動(dòng)引起, 對(duì)研究二級(jí)結(jié)構(gòu)最有價(jià)值[20]. 圖3 為 KT, Linear-KT 和 Cyclic-KT 的紅外光譜圖. 可見, KT 在 1600 ~ 1700 cm-1處有 1 個(gè)明顯的強(qiáng)峰, 峰形較寬; Linear-KT 在 1679 及 1632 cm-1處有 2 個(gè)很強(qiáng)的吸收峰; 而 Cyclic-KT 在 1677 及 1631 cm-1處也有 2 個(gè)很強(qiáng)的吸收峰. 因此, Linear-KT和 Cyclic-KT 均可能形成折疊結(jié)構(gòu). 采用紅外光譜雖然可從一定程度上提供多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息, 但由于 1600 ~ 1700 cm-1波段受干擾因素較多, 且紅外光譜測(cè)試中多肽處于固體狀態(tài), 不能反映出多肽在水溶液中的狀態(tài), 因此進(jìn)一步采用圓二色光譜考察了多肽在水中的二級(jí)結(jié)構(gòu).
2. 6 圓二色光譜測(cè)定
圖 4 為短鏈多肽 KT、 線性多肽 Linear-KT 及環(huán)狀多肽 Cyclic-KT 的圓二色光譜. 短鏈多肽 KT 在200 nm 處有 1 個(gè)負(fù)峰, 為無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的特征峰[21,22]. KT 只包含 5 個(gè)氨基酸殘基, 肽鏈長(zhǎng)度較短, 不足以形成二級(jí)結(jié)構(gòu), 因此以無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)存在于溶液中. 多肽 Linear-KT 在 200 nm 處也有 1 個(gè)負(fù)峰, 表明 Linear-KT在水溶液中也呈無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu). 環(huán)狀多肽 Cyclic-KT 在 202及 213 nm 處有 2 個(gè)負(fù)峰, 且在 195 nm 處有 1 個(gè)正峰.典型的 B-sheet 結(jié)構(gòu)在 216 nm 處有 1 個(gè)負(fù)峰, 195 nm 處有 1 個(gè)正峰, 因此 Cyclic-KT 在溶液中可能以無(wú)規(guī)及部分 B-sheet 結(jié)構(gòu)存在. Cyclic-KT 以二硫鍵將多肽鏈環(huán)化,使得多肽的構(gòu)象相對(duì)固定, 因此表現(xiàn)出部分 B-sheet 二級(jí)結(jié)構(gòu). 本研究中所用多肽長(zhǎng)度較短, 因此不足以形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu), 圓二色光譜信號(hào)總體較低.
2. 7 模擬計(jì)算
Linear-KT 和 Linear-KS 對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌均表現(xiàn)出較好的殺菌活性, 特別是對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌. 這 2 條多肽均含有雙活性序列, 是由 2 條具有單活性序列的多肽通過簡(jiǎn)單的氨基酸殘基相連而形成, 但比相應(yīng)的具有單活性序列的多肽表現(xiàn)出顯著提高的殺菌活性. 因此本文采用計(jì)算模擬的方法計(jì)算了所設(shè)計(jì)的多肽與磷脂相互作用時(shí)的結(jié)合能, 以評(píng)價(jià)多肽和細(xì)胞膜的結(jié)合程度. 磷脂是細(xì)胞膜的主要組成成分, 細(xì)菌的細(xì)胞膜含有較高含量的 DMPG, 而哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜中 DMPG 的含量則很少, 因此本文采用 DMPG 為研究對(duì)象考察其與多肽的結(jié)合能力. 采用 Gaussian 09 中的 PM3 半經(jīng)驗(yàn)算法優(yōu)化DMPG 及各多肽的分子構(gòu)型. 紅外光譜圖提示線性和環(huán)狀的多肽形成折疊結(jié)構(gòu), 圓二色光譜也表明環(huán)狀多肽可能具有部分 B-sheet 二級(jí)結(jié)構(gòu), 因此以折疊結(jié)構(gòu)優(yōu)化線性及環(huán)狀多肽, 在優(yōu)化過程中將多肽與DMPG 分子的骨架部分進(jìn)行固定以縮短優(yōu)化時(shí)間, 結(jié)果見圖 5. 根據(jù)多肽和 DMPG 的構(gòu)型優(yōu)化結(jié)果構(gòu)建多肽和 DMPG 形成的復(fù)合物, 并對(duì)復(fù)合物進(jìn)一步優(yōu)化, 復(fù)合物的構(gòu)型見圖 6. 計(jì)算時(shí)主要考慮多肽與 DMPG 分子的靜電和氫鍵結(jié)合, 同時(shí)考慮盡可能多的結(jié)合模式. 以結(jié)合能最低為原則[23], 根據(jù)公式(2)計(jì)算出多肽與 DMPG 形成的復(fù)合物和各單體之間的能量差即得到結(jié)合能, 數(shù)據(jù)列于表 3. 由表 3 可見, 所有多肽與 DMPG 分子結(jié)合過程的能量差均為負(fù)值, 說明多肽與 DMPG 的相互作用過程釋放能量, 能量差的絕對(duì)值越大說明二者的結(jié)合能越大. 長(zhǎng)鏈肽和環(huán)狀肽與 DMPG 分子結(jié)合時(shí)具有較大的結(jié)合能, 遠(yuǎn)高于短鏈肽. 結(jié)合能越大, 說明該類多肽更易與 DMPG 分子產(chǎn)生相互作用, 進(jìn)而產(chǎn)生殺菌效果. DMPG 分子頭基帶負(fù)電, 可與帶正電的氨基酸產(chǎn)生靜電作用. DMPG 的負(fù)電頭基在與長(zhǎng)鏈肽和環(huán)肽結(jié)合的過程中, 可同時(shí)與 2 個(gè)帶正電的賴氨酸產(chǎn)生靜電作用, 而在與短鏈肽的結(jié)合過程中只能與 1個(gè)帶正電的賴氨酸產(chǎn)生靜電作用. 這是造成短鏈肽的結(jié)合能遠(yuǎn)小于長(zhǎng)鏈肽與環(huán)狀肽的主要原因. 此結(jié)果和實(shí)驗(yàn)所得的殺菌活性數(shù)據(jù)基本一致, 即具有 2 個(gè)活性序列的長(zhǎng)鏈肽和環(huán)狀肽比具有單個(gè)活性序列的短鏈肽殺菌活性更強(qiáng).
在長(zhǎng)鏈肽和環(huán)狀肽中, 序列中含有絲氨酸和蘇氨酸的多肽比相應(yīng)的含有天冬酰胺的多肽結(jié)合能大, 這是因?yàn)榻z氨酸和蘇氨酸的 茁 碳上的羥基可與磷脂分子 2 條碳鏈上的羰基形成氫鍵, 從而增大了結(jié)合能. 殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明含有絲氨酸和蘇氨酸的多肽活性高于含天冬酰胺的多肽. Frecer 等[19]計(jì)算表明, KFTFK, KFSFK 和 KFNFK 與內(nèi)毒素的活性部分 Lipid A 結(jié)合的 Gibbs 自由能分別為-67, -75和-55 kJ/ mol; KFTFK 和 KFSFK 序列與 Lipid A 的結(jié)合能更大, 該結(jié)果與本文結(jié)果一致.
與環(huán)狀肽相比, 長(zhǎng)鏈肽與 DMPG 分子的結(jié)合能略高于環(huán)狀肽, 這可能是由于多肽結(jié)構(gòu)的影響. 長(zhǎng)鏈肽在水溶液中基本以無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)存在, 因此多肽結(jié)構(gòu)柔性較大, 可根據(jù)所結(jié)合的對(duì)象采取更適合的結(jié)構(gòu)與之結(jié)合. 特別是 Linear-KT 和 Linear-KS, 其柔性結(jié)構(gòu)使絲氨酸和蘇氨酸的 B碳上的羥基均可與DMPG 分子中 2 條碳鏈上的羰基形成氫鍵, 增大結(jié)合能. 而環(huán)狀肽由于受折疊結(jié)構(gòu)和二硫鍵的限制,肽的結(jié)構(gòu)相對(duì)固定, 肽環(huán)的大小受限, 使磷脂分子不能完全插入肽環(huán)中, 只能在肽環(huán)平面的側(cè)面與其結(jié)合, 只與 DMPG 分子中 1 條碳鏈上的羰基形成氫鍵, 氫鍵數(shù)目減少, 結(jié)合能降低, 因此環(huán)狀肽的活性不及長(zhǎng)鏈肽.
3 結(jié) 論
設(shè)計(jì)合成了多個(gè)具有 2 個(gè)活性序列的線性和環(huán)狀多肽及具有單個(gè)活性序列的短鏈多肽, 研究了其殺菌活性, 并采用計(jì)算模擬的方法計(jì)算了多肽與細(xì)菌細(xì)胞膜中重要成分磷脂酰甘油的結(jié)合能, 從理論上解釋了其活性. 結(jié)果表明, 靜電作用和氫鍵在多肽與磷脂的結(jié)合過程中起重要作用. 線性的 Linear-KT 和 Linear-KS 具有雙活性序列, 可同時(shí)提供 2 個(gè)荷正電氨基酸與磷脂結(jié)合, 殺菌活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單活性序列. 將雙活性序列引入同一分子, 可起到提高殺菌活性的作用. 同時(shí) Linear-KT 和 Linear-KS 的柔性結(jié)構(gòu)能夠使多肽與磷脂上的羰基形成多個(gè)氫鍵, 因此結(jié)合能較大, 具有較強(qiáng)的殺菌活性. 計(jì)算模擬的方法為抗菌肽的殺菌活性預(yù)測(cè)從理論上提供了一定的依據(jù). 利用該方法可在一定程度上預(yù)測(cè)抗菌肽的殺菌活性, 提高抗菌肽的研發(fā)效率, 為抗菌肽的設(shè)計(jì)與開發(fā)提供了新途徑.
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