摘要：系統(tǒng)總結(jié)了彈性肽(ELPs)的自組裝及其組裝體的生物應(yīng)用研究現(xiàn)狀, 討論了ELPs的溫控相變?cè)跇?gòu)建超分子組裝體方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì), 探討了ELPs納米結(jié)構(gòu)的序列敏感性, 展望了ELPs在超分子組裝中的實(shí)際應(yīng)用.
彈性肽(ELPs)是一類(lèi)具有多個(gè)五肽重復(fù)單元的多肽. ELPs的一級(jí)結(jié)構(gòu)為(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)n, Xaa是除脯氨酸外的其它氨基酸. ELPs由于具有溫度響應(yīng)自組裝性質(zhì), 引起了科研人員的廣泛興趣; 并且由于具有易修飾、 組裝效率高和生物相容性好等特點(diǎn), ELPs得到了廣泛應(yīng)用[1,2,3]. ELPs來(lái)源于彈性蛋白, 是胞外基質(zhì)的主要組成部分. 當(dāng)溫度低于相變溫度時(shí), ELPs以可溶形式存在, 當(dāng)溫度高于其相變溫度時(shí), ELPs從隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu)變?yōu)棣罗D(zhuǎn)角或β螺旋結(jié)構(gòu), 通過(guò)增加疏水作用形成組裝體. 許多ELPs誘導(dǎo)策略直接利用多聚Val-Pro-Gly-Val-Gly[poly(VPGVG)]作為誘導(dǎo)基元連接親水分子, 溫度達(dá)到相變溫度時(shí)形成兩親性分子, 在水溶液中組裝成納米結(jié)構(gòu)[4,5,6]. 從組裝結(jié)構(gòu)可以看出, Val和Pro分別參與疏水組裝和β轉(zhuǎn)角形成, 在形成組裝體方面起到重要作用, 因而在設(shè)計(jì)和應(yīng)用ELPs時(shí)常保留這2種氨基酸. ELPs結(jié)構(gòu)對(duì)序列敏感, 如果用其它氨基酸替換重復(fù)序列中的氨基酸, 會(huì)使組裝結(jié)構(gòu)發(fā)生改變. ELPs可以被修飾, 從而顯現(xiàn)出與ELPs不同的性質(zhì). 在ELPs主鏈上引入帶電氨基酸, 離子化的ELPs在電荷被中和時(shí)會(huì)發(fā)生相變, 利用這一特點(diǎn)可以構(gòu)建pH響應(yīng)納米結(jié)構(gòu)[7]; 用精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸(RGD)等分子修飾后, ELPs可以靶向細(xì)胞; 用半胱氨酸修飾后, ELPs具有氧化還原性質(zhì); 用客體分子修飾后, ELPs具有主客體組裝能力. 因此, ELPs的組裝及調(diào)控備受關(guān)注[8,9,10].
1 ELPs在調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用
ELPs作為一種大分子量的多肽, 既可以采用基因工程方法合成, 也可以用肽合成法或化學(xué)法合成. 利用點(diǎn)擊化學(xué)手段, Guan等[11]以ELPs基序?yàn)榻Y(jié)構(gòu)單元進(jìn)行聚合反應(yīng), 合成了ELPs模擬物, 研究了其疏水水合作用對(duì)ELPs力學(xué)性質(zhì)的影響. 基因工程常用的方法主要有滾動(dòng)循環(huán)擴(kuò)增(Rolling cycle amplification)、 同尾酶法、 單酶法和遞歸定向連接法(Recursive directional ligation). 滾動(dòng)循環(huán)擴(kuò)增是近年來(lái)發(fā)展的用于擴(kuò)增多聚DNA的有效方法, 該方法以長(zhǎng)度為26~74 nt的單鏈環(huán)狀DNA為模板, 不需要常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的升溫和降溫過(guò)程[12]. Li等[13]用同尾酶法構(gòu)建了一系列彈性蛋白, 成功用于蛋白質(zhì)折疊-解折疊研究. 如果基因兩端含有同種內(nèi)切酶序列, 可用單酶法進(jìn)行體外多聚基因的快速篩選. 遞歸定向連接法則利用Ⅱs型限制性?xún)?nèi)切酶, 可以進(jìn)行無(wú)縫連接[14]. 這些方法在ELPs合成方面的成功應(yīng)用促進(jìn)了ELPs在超分子組裝領(lǐng)域的發(fā)展.
1.1 1D結(jié)構(gòu)
在自然界中, ELPs首先形成線(xiàn)形纖維, 纖維通過(guò)團(tuán)聚作用逐漸長(zhǎng)成彈性蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu). 設(shè)計(jì)并構(gòu)筑一維(1D)彈性肽纖維是探索彈性肽材料的一個(gè)重要環(huán)節(jié). Poly(VPGVG)(富含脯氨酸, 用P表示)作為彈性肽模擬物, 由于缺少形成定向氫鍵的能力, 難以在體外組裝形成納米纖維. 天然彈性肽含有poly(VGGVG)(富含甘氨酸, 用G表示), 當(dāng)poly(VPGVG)兩端連接序列poly(VGGVG)可以得到嵌段共聚物GPG[圖1(A)和(B)], GPG首先形成納米粒, 然后在7 d內(nèi)形成串珠形狀的線(xiàn)形結(jié)構(gòu)[15]. 用圓二色(CD)光譜和原子力顯微鏡(AFM)進(jìn)行組裝動(dòng)力學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 當(dāng)在溶液中加入10%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙醇后, 在15 min到48 h內(nèi), 嵌段共聚物GPG可以組裝成納米粒、 納米纖維及成熟纖維, 最后形成串珠結(jié)構(gòu)[圖1(C1~C4)]. 當(dāng)用帶正電的多肽KAAK修飾C端形成GPG2, GRGDS修飾GPG2形成GPG3后, 可以靶向整合蛋白-胞外基質(zhì). 富含G的區(qū)域互相作用形成β片層結(jié)構(gòu), 促進(jìn)了GPG3納米纖維的形成. CCK-8檢測(cè)或細(xì)胞數(shù)檢測(cè)和細(xì)胞形態(tài)分析結(jié)果表明, GPG3是最佳的細(xì)胞黏附材料或類(lèi)纖維連接蛋白組織. 因此, 基于天然彈性蛋白結(jié)構(gòu), 設(shè)計(jì)并引入β片層結(jié)構(gòu), 是一種構(gòu)建ELPs納米線(xiàn)的有效方法.
線(xiàn)形ELPs的成功構(gòu)建激發(fā)了人們用超分子方法構(gòu)建多功能蛋白質(zhì)納米線(xiàn)或彈性蛋白模擬物的興趣. 本課題組[16]在C2對(duì)稱(chēng)的谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的N末端修飾三肽Phe-Gly-Gly(FGG), 利用FGG與葫蘆脲(CB[8])的主客體作用(結(jié)合常數(shù)超過(guò)1011 mol/L2, 摩爾比為2:1)構(gòu)建了蛋白質(zhì)納米線(xiàn), 并用硒酶模擬方法構(gòu)建硒酶功能化納米線(xiàn), 該酶組裝體顯示出高抗氧化活性和高穩(wěn)定性. 利用CB[8]與FGG的主客體作用, 我們[17]構(gòu)建了鈣調(diào)蛋白納米線(xiàn), 實(shí)現(xiàn)了金屬離子響應(yīng)的超分子組裝. 上述研究表明, 利用蛋白質(zhì)獨(dú)特的對(duì)稱(chēng)性, 在超分子主-客體作用下可以制備多功能的彈性蛋白模擬物, 為彈性蛋白的生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).
1.2 球形結(jié)構(gòu)
球形納米粒子的比表面積較高, 常用于修飾熒光分子、 細(xì)胞靶向分子或細(xì)胞膜穿透肽, 在藥物傳遞等方面發(fā)揮著重要作用. ELPs被廣泛用于構(gòu)建球形膠束或囊泡, 構(gòu)建這些結(jié)構(gòu)的方法包括改變客體氨基酸(氨基酸或非天然氨基酸)、 改變聚合度和嵌段共聚(AB/ABA)等方法[18]. 其中, 一個(gè)有效的方法是改變氨基酸的種類(lèi), 如引入帶電氨基酸, 使其具有pH響應(yīng)性, 或引入疏水氨基酸改變其相變溫度. Callahan等[19]設(shè)計(jì)了富含His的ELPs, 在37 ℃, pH=7.4和Zn2+存在下組裝成球形膠束, 在pH值降至6.4時(shí)解離, 與pH不敏感膠束相比, 球形ELPs納米結(jié)構(gòu)具有較好的腫瘤穿透性. 研究結(jié)果表明, ELPs納米結(jié)構(gòu)對(duì)氨基酸序列具有敏感性. Vanrell等[20]設(shè)計(jì)了poly(VPAVG), 用于構(gòu)建納米粒子, 即在不影響脯氨酸與纈氨酸之間形成氫鍵情況下, 甘氨酸被更疏水的丙氨酸代替. DSC表征結(jié)果表明, poly(VPAVG)在升溫時(shí)呈吸熱反應(yīng), 而降溫時(shí)呈放熱反應(yīng), 降溫曲線(xiàn)具有明顯滯后效應(yīng). 這是因?yàn)榻禍貢r(shí), 與poly(VPGVG)相比, 水結(jié)合到酰胺鍵的量減少, 而納米粒子穩(wěn)定性與重新溶解相關(guān).
共聚是調(diào)控聚合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的有效方法[21,22,23]. 嵌段共聚是用來(lái)設(shè)計(jì)兩親分子的常用方法. AB型多肽具有易制備、 分子量均一和結(jié)構(gòu)易優(yōu)化等特點(diǎn), 已成功用于構(gòu)建球形膠束. 研究結(jié)果表明, ELPs在第4位氨基酸負(fù)載疏水氨基酸或帶電氨基酸后, 可形成具有不同相變溫度的囊泡. Kim等[24]設(shè)計(jì)了C4G3作為連接基團(tuán)的AB共聚物[圖2(A)和(B)], 同時(shí)在A中引入Glu避免聚集, 在B中引入Ile增加疏水性. 不同層次結(jié)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果顯示其組裝形成了球形膠束. CD光譜顯示, 在210 nm處出現(xiàn)正峰, 表明形成β轉(zhuǎn)角. 動(dòng)態(tài)光散射(DLS)分析結(jié)果表明, 在10~37 ℃之間, 由于二硫鍵交聯(lián)使結(jié)構(gòu)大小穩(wěn)定在25 nm. 透射電子顯微鏡(TEM)、 核磁共振波譜(1H NMR)和AFM分析結(jié)果表明, 共聚物組裝形成了膠束[圖2(C)和(D)], 與DLS分析結(jié)果一致. 該策略可用于設(shè)計(jì)制備刺激響應(yīng)性膠束, 或構(gòu)建藥物傳遞系統(tǒng), 在還原性硫醇分子存在時(shí)實(shí)現(xiàn)可控釋放.
1.3 樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)
樹(shù)枝狀分子具有明確的大小、 結(jié)構(gòu)和大量處于分子末端的功能基團(tuán). 這些基團(tuán)可被VPGVG共價(jià)修飾, 使末端暴露出幾十至數(shù)百個(gè)VPGVG, 從而形成樹(shù)枝狀的ELPs模擬物. Tanaka等[25]以HATU/HOAt為縮合試劑, 將VPGVG和(VPGVG)2交聯(lián)到樹(shù)枝狀分子G3, G4和G5上. 圓二色光譜分析顯示, 在218 nm處出現(xiàn)β轉(zhuǎn)角峰. 在濁度實(shí)驗(yàn)中, 大量VPGVG共價(jià)結(jié)合在樹(shù)枝狀分子或者納米粒子多個(gè)末端時(shí), 具有poly(VPGVG)的相變性質(zhì)[圖3(A~C)], 因此該聚合物是一種彈性肽模擬物.
1.4 柱狀結(jié)構(gòu)
ELPs納米結(jié)構(gòu)具有序列敏感性, 即ELPs納米結(jié)構(gòu)不僅受一級(jí)結(jié)構(gòu)影響, 而且受氨基酸相互作用的影響. 球形結(jié)構(gòu)的構(gòu)建激發(fā)了學(xué)者構(gòu)建更加復(fù)雜納米結(jié)構(gòu)的興趣. McDaniel等[26]將(XGG)8(X為疏水氨基酸)引入到ELPs的C末端. A160-(YGG)8不能組裝成任何結(jié)構(gòu), 但通過(guò)移除甘氨酸部分增強(qiáng)其疏水性后, A160-(YG)8能夠組裝成水動(dòng)力學(xué)半徑為71 nm的納米粒子, 甚至在pH=12時(shí)也保持很好的組裝能力, 而此時(shí)離子化的Tyr比中性的Tyr親水性提高了10倍. 盡管A160-(YG)8和A160-(Y)8均可組裝成柱狀膠束, 但A160-(YG)8具有更高的長(zhǎng)寬比(圖4), 因此它們的組裝結(jié)構(gòu)不同.
1.5 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)
Sun等[27]用ELPs作為可溶性連接分子, 連接RGD和貽貝足蛋白的酪氨酸富含區(qū)(黏附蛋白, 重復(fù)單元為5~7個(gè)氨基酸). 在酪氨酸酶調(diào)節(jié)氧化反應(yīng)中, 酪氨酸轉(zhuǎn)化為DOPA和多巴醌, 從而促進(jìn)交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和凝膠(圖5). 這些凝膠表現(xiàn)出序列依賴(lài)性的力學(xué)性質(zhì). 細(xì)胞包覆和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 它們可以作為生物相容性材料用作細(xì)胞生長(zhǎng)模板.
2 ELPs在生物功能方面的應(yīng)用
ELPs及其組裝體在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)方面應(yīng)用廣泛. 在醫(yī)學(xué)方面, 由于彈性蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分, Lee等[28,29,30]將溫度響應(yīng)的ELPs與整合素靶向的RGD連接, 進(jìn)而利用溫度刺激包覆胰島, 發(fā)現(xiàn)可以重構(gòu)損傷基質(zhì)并提供胰島周質(zhì)環(huán)境, 保護(hù)其免于免疫排斥. 此外, ELPs本身也具有一定的生物學(xué)活性, 利用ELPs與細(xì)胞表面彈性蛋白受體復(fù)合物的作用, 可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖; 或利用其與細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖的作用, 誘導(dǎo)金屬蛋白酶在成纖維細(xì)胞中表達(dá)[31].
2.1 ELPs誘導(dǎo)蛋白質(zhì)組裝
蛋白質(zhì)組裝體是同源或異源蛋白質(zhì)形成的有序結(jié)構(gòu), 其有序性是發(fā)揮生物功能的基礎(chǔ). 病毒、 微管和鐵蛋白等高級(jí)有序蛋白質(zhì)組裝體在侵染、 維持結(jié)構(gòu)和體內(nèi)鐵平衡方面具有重要作用. 目前, 構(gòu)建蛋白質(zhì)組裝體是一個(gè)重要的研究方向. 利用主-客體作用、 金屬配位作用和親疏水作用, 已成功構(gòu)建出具有光俘獲、 催化和輔助蛋白質(zhì)折疊功能的蛋白質(zhì)組裝體. ELPs作為疏水域可用于誘導(dǎo)肽、 聚合物和樹(shù)枝狀分子等組裝, 證明ELPs是一個(gè)有效的誘導(dǎo)基元. 因此, 近年來(lái)ELPs被用于誘導(dǎo)蛋白質(zhì)組裝, 這些組裝體不僅可以保持蛋白質(zhì)的活性, 而且可以利用ELPs的刺激響應(yīng)性實(shí)現(xiàn)藥物傳遞. Champion等[32]設(shè)計(jì)了球-拉鏈-彈性肽(globule-zipper-ELPs)系統(tǒng), 并提出了理論模型予以解釋(圖6). 通過(guò)相反電荷的拉鏈的二聚作用, 連接mCherry到ELPs上, 該球-拉鏈-彈性肽與彈性肽共組裝獲得了囊泡. Jang等[33]進(jìn)一步研究了mCherry-ZE/ZR-ELPs組裝成囊泡的詳細(xì)參數(shù). 動(dòng)力學(xué)研究表明, mCherry-ZE/ZR-ELPs形成了團(tuán)聚體、 單層囊泡和雙層囊泡3種類(lèi)型結(jié)構(gòu). 當(dāng)溫度達(dá)到相變溫度時(shí), 首先形成單層囊泡, 進(jìn)一步加熱促進(jìn)ELPs分子間作用, 形成雙層囊泡結(jié)構(gòu), 表明溫度差ΔT(T0-Tt)決定囊泡結(jié)構(gòu).
鹽濃度的作用可以用堆積參數(shù)(P)表示, 可用公式P=V/(a0lc)進(jìn)行計(jì)算(V為疏水基元ELP的體積, a0為親水頭部的平均面積, lc為臨界長(zhǎng)度[32]). a0可表示為a0=(1-χ)a1/2+χa2, χ為mCherry-ZE(或EGFP-ZE)與ZR-ELP的比值, a1和a2分別為ZR/ZR和mCherry(EGFP)-ZE/ZR的頭部面積[圖6(B)]. 由于球形的蛋白質(zhì)與卷曲螺旋形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu), a0的大小不受鹽離子濃度影響. 增加鹽離子濃度可促進(jìn)ELP發(fā)生相變, 導(dǎo)致堆積參數(shù)V和P均降低. 因此, 高于臨界鹽濃度時(shí)形成囊泡, 此時(shí)參數(shù)P的范圍為1/2<P<1[32]. 由于球形蛋白比卷曲螺旋頭部面積大, 即mCherry-ZE/ZR的面積要比ZE/ZR的面積大, 而EGFP傾向于二聚, 使a2降低, V也相應(yīng)降低, 因此EGFP組裝體系(1/2<P<1)需要的鹽濃度要高于mCherry. 另一方面, 當(dāng)固定鹽濃度而增大χ時(shí), mCherry-ZE囊泡直徑減小, 而EGFP-ZE囊泡直徑則增大. 由于mCherry-ZE/ZR-ELP比卷曲螺旋ZE/ZR對(duì)囊泡表面的曲率貢獻(xiàn)大, 所以在χ增大后, 對(duì)于mCherry-ZE囊泡, a2>a1, 而對(duì)于EGFP-ZE囊泡, a2<a1. 以上研究結(jié)果表明, 根據(jù)理論模型利用堆積參數(shù)可以有效調(diào)控ELP囊泡納米結(jié)構(gòu), 因此擴(kuò)大了ELP納米結(jié)構(gòu)的應(yīng)用范圍.
Hassouneh等[34]將ELPs嵌段共聚物(ELPBC)與硫氧還蛋白或纖維連接蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域連接, 發(fā)現(xiàn)其不僅保留了ELPBC的球形組裝能力, 還保留了Ⅲ型纖維連接蛋白靶向過(guò)表達(dá)αvβ3整合素細(xì)胞的能力. Mills等[35]發(fā)現(xiàn), 當(dāng)ELPs引入部分負(fù)電氨基酸時(shí), SAXS表征結(jié)果顯示ELPs-mCherry的組裝能力顯著降低.
2.2 光響應(yīng)性彈性肽
光響應(yīng)分子在光照下可發(fā)生構(gòu)象變化或化學(xué)反應(yīng). 由于光照是一種非破壞非添加的刺激方式, 因此, 光控被視為一種綠色的超分子誘導(dǎo)方法. 偶氮苯是超分子領(lǐng)域常用的光響應(yīng)分子, Wu等[36]將其引入交替的兩親共聚物(EG4-a-NAzoOME)中, 形成了光響應(yīng)性膠束結(jié)構(gòu), 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明偶氮苯在聚合物中表現(xiàn)出良好的光響應(yīng)能力. 由于偶氮苯與α-環(huán)糊精有較好的復(fù)合能力, 在超分子研究中備受關(guān)注. Cabello等[37,38]將偶氮苯引入ELPs中, 在加入α-環(huán)糊精后, 偶氮苯的非極性側(cè)鏈進(jìn)入α-環(huán)糊精空腔, 使α-環(huán)糊精的極性表面暴漏, 因而導(dǎo)致ELPs相變溫度增加, 而α-環(huán)糊精的存在不阻礙偶氮苯的順?lè)串悩?gòu)變化(圖7).
2.3 ELPs應(yīng)用于脂類(lèi)的組裝
磷脂是細(xì)胞膜的主要成分, 脂類(lèi)分子的組裝備受關(guān)注. 為了促進(jìn)脂類(lèi)分子組裝, Luginbuhl等[39]、 Meins等[40]和Liu等[41]利用翻譯后修飾方法將脂鏈連接到ELPs上[圖8(B)和(C)]. 在pETDuet共表達(dá)系統(tǒng)中, 當(dāng)肉豆蔻酰轉(zhuǎn)移酶(NMT)、 外源肉豆蔻酸和ELPs存在時(shí), 通過(guò)催化甘氨酸的氨基與肉豆蔻酰-輔酶A的活化硫酯反應(yīng), 產(chǎn)生脂-彈性肽(lipid-ELPs)組裝基元. 由于脂肪鏈的引入增加了ELPs的疏水性, 使M-ELPs的相變溫度比ELPs降低了20 ℃. 疏水頭部誘導(dǎo)lipid-ELPs組裝形成不同結(jié)構(gòu). 研究結(jié)果表明, lipid-ELPs具有較高的DOX負(fù)載率, 在4T1腫瘤細(xì)胞中的生命周期與積累均高于游離的DOX. 該研究提供了一種構(gòu)建脂類(lèi)組裝體系的有效方法, 并在細(xì)胞成像和藥物傳遞等方面顯示出良好的應(yīng)用前景.
Mozhdehi等[42]利用同樣的技術(shù), 在脂肪鏈與ELPs之間引入β-片層肽基序(M-B-ELPs), 形成刺激響應(yīng)材料[圖8(C)和(D)]. 研究結(jié)果表明, 與單獨(dú)的ELPs相比, 相變溫度降低了15 ℃, 這是由于通過(guò)肉豆蔻�；胫炬�?zhǔn)沟肊LPs疏水性增加, 同時(shí)N末端氨基的移除也有一定貢獻(xiàn). 熒光檢測(cè)結(jié)果顯示, 在β-片層加入硫磺素探針后, 當(dāng)?shù)陀谙嘧儨囟葧r(shí), M-B3-ELPs比M-B1-ELPs顯示出更強(qiáng)的熒光, 這是由于B3形成β-片層的能力更強(qiáng). 由TEM照片可以看出, M-B3-ELPs在相變溫度下組裝成線(xiàn)形串珠結(jié)構(gòu), 超過(guò)相變溫度后, 由于ELPs去溶劑化產(chǎn)生聚集, 進(jìn)一步組裝成分形結(jié)構(gòu).
如果ELPs與疏水藥物分子共價(jià)連接, Lipid-ELPs有望應(yīng)用于癌癥靶向治療. McDaniel等[43]根據(jù)組成和序列, 提出了預(yù)測(cè)ELPs的Tt的有效模型, 使含阿霉素的ELPs相變溫度處在39~42 ℃之間, 研究發(fā)現(xiàn), 適當(dāng)升溫可以顯著提升DOX-ELPs納米粒子靶向腫瘤的能力并增加在腫瘤內(nèi)的積累. 與共價(jià)連接相比, 包覆等方式更有利于藥物釋放. Choi等[44]合成了Lipid-ELPs, 用于包覆作為藥物模型的熒光素, 證明該體系增加了控制釋放能力. 以上研究表明, 通過(guò)控制相變溫度, 負(fù)載藥物的ELPs有望成為生物相容且高效的藥物傳遞系統(tǒng).
2.4 ELPs應(yīng)用于小肽組裝
由于具有形成納米管(FF苯丙二肽)、 β-片層(FKFEFKFE)和三螺旋束(CLP)的能力, 小肽或寡肽組裝引起了研究人員的廣泛興趣.
在許多ELPs組裝系統(tǒng)中, 當(dāng)重復(fù)數(shù)n或聚合度達(dá)到幾十或幾百時(shí), 才能獲得足夠的兩親性而組裝[45,46,47]. 如何降低重復(fù)數(shù)n并促進(jìn)ELPs組裝是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一. 研究表明, 短肽自組裝能夠形成多聚體, 從而在局部促進(jìn)ELPs組裝. Qin等[49]構(gòu)建了智能的組裝基元, 通過(guò)點(diǎn)擊反應(yīng)將(VPGFG)5交聯(lián)到膠原蛋白CLP上(圖9), 得到了具有低相變溫度的ELPs-CLP. TEM表征結(jié)果表明, 在室溫下ELPs-CLP可組裝成80~100 nm納米粒子. 這是由于CLP可以形成三螺旋結(jié)構(gòu), 在低溫時(shí)能使3個(gè)ELPs聚集在一起. 在高溫時(shí), 解折疊的ELPs-CLP具有高相變溫度, 這是因?yàn)榻庹郫BCLP作為親水域加入到ELPs可以提高ELPs的相變溫度. 因此, 小肽組裝是調(diào)節(jié)ELPs組裝的一種有效方法, 通過(guò)改變ELPs序列可以得到更豐富的結(jié)構(gòu). 當(dāng)將(GPO)8引入到含有GFOGER序列的ELPs中時(shí)[49], ELPs-CLP(FWWF, FWWW和WWWW)可以組裝成不同類(lèi)型的納米片層[50,51]. 進(jìn)一步研究表明, 納米片由2層ELP-CLP分子組裝而成, 其中ELPs呈現(xiàn)塌陷結(jié)構(gòu), 而CLP呈現(xiàn)三螺旋結(jié)構(gòu), 且這些具有不同轉(zhuǎn)角的組裝結(jié)構(gòu)具有序列依賴(lài)性.
2.5 ELPs應(yīng)用于水凝膠構(gòu)筑
水凝膠被普遍應(yīng)用于藥物傳遞、 組織工程和診斷治療方面. 與合成水凝膠相比, 生物水凝膠具有良好的生物相容性和生物可降解性等優(yōu)勢(shì). 通過(guò)合理設(shè)計(jì), 可利用基因重組法或化學(xué)方法合成ELPs, 使其具有合適的細(xì)胞靶向能力, 有望應(yīng)用于癌癥治療方面[52,53]. Kaufmann等[54]設(shè)計(jì)了基于(EMM)7-(VPGXG)42(X代表K, E, V或I)的水凝膠, 并利用賴(lài)氨酸側(cè)鏈交聯(lián)RGD配體用于細(xì)胞黏附(圖10). 如果交聯(lián)后修飾RGD, FGRGDS修飾的凝膠不顯示任何細(xì)胞黏附[54,55,56,57]. 這是由于配基的空間位阻和非均相反應(yīng)導(dǎo)致了RGD交聯(lián)效率較低. 如果ELPs交聯(lián)前修飾RGD, 則顯示出較好的細(xì)胞黏附行為. 重要的是, 具有環(huán)狀RGD配基和己酸作為連接基團(tuán)的ELPs水凝膠{(EMM)7-Ahx-c-[RGDFK]}顯示出100%的細(xì)胞黏附能力, 明顯高于線(xiàn)狀RGD的ELPs水凝膠.
3 結(jié)論與展望
由于在誘導(dǎo)超分子組裝方面具有的顯著優(yōu)勢(shì), ELPs誘導(dǎo)法已成為構(gòu)建結(jié)構(gòu)復(fù)雜、 功能靈活多變超分子結(jié)構(gòu)的一種有效手段. 通過(guò)改變客體氨基酸、 引入疏水鏈或化學(xué)修飾等方法, ELPs不僅可用于組裝線(xiàn)形、 片層、 球形和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu), 而且可用于制備光響應(yīng)系統(tǒng)、 蛋白質(zhì)組裝體和水凝膠體系. 研究結(jié)果表明, ELPs納米結(jié)構(gòu)具有序列敏感性, 即氨基酸序列和聚合度對(duì)相變溫度有很大影響, 同時(shí), 蛋白質(zhì)濃度、 鹽離子種類(lèi)和濃度等也起一定作用. 因此, 通過(guò)合理設(shè)計(jì), 有望進(jìn)一步豐富基于ELPs的超分子組裝體的結(jié)構(gòu)和種類(lèi).
盡管如此, ELPs應(yīng)用于在超分子組裝領(lǐng)域仍面臨許多問(wèn)題. 首先, 低聚合度的ELPs難以進(jìn)行超分子組裝, 主要原因是其相變溫度較高; 其次, 線(xiàn)形組裝體仍難以構(gòu)建, 目前體外線(xiàn)形組裝體組裝時(shí)間較長(zhǎng), 而線(xiàn)形組裝體是天然彈性蛋白網(wǎng)絡(luò)形成的中間體; 第三, 光響應(yīng)組裝體動(dòng)力學(xué)研究較少, 人們對(duì)光照循環(huán)過(guò)程中ELPs納米結(jié)構(gòu)變化的認(rèn)識(shí)有限. 此外, 盡管已經(jīng)有研究報(bào)道稱(chēng), 根據(jù)ELPs的組成和分子量可以定量預(yù)測(cè)ELPs的相變溫度, 但仍然缺乏pH值響應(yīng)ELPs的相變溫度的預(yù)測(cè)研究. 將來(lái), ELPs的超分子組裝體納米結(jié)構(gòu)和組裝動(dòng)力學(xué)有望更加可控, 這些ELPs組裝體有望保持高效組裝和高穩(wěn)定性, 并進(jìn)一步應(yīng)用在細(xì)胞成像、 藥物傳遞、 生物技術(shù)和組織工程等領(lǐng)域.
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