摘要：基于銅離子對羅丹明B標記的多肽的熒光猝滅作用, 構(gòu)建了一種用于銅離子檢測的熒光傳感器. 利用共振光散射分析、 紫外-可見吸收光譜、 熒光壽命測試和圓二色光譜研究了銅離子檢測的傳感機理, 發(fā)現(xiàn)銅離子的加入誘導多肽結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而使羅丹明B熒光團彼此靠近, 從而導致銅離子與多肽之間發(fā)生聚集誘導熒光猝滅. 實驗結(jié)果表明, 該傳感器檢測銅離子的線性范圍為5×10‒4~1×10‒2 μmol/L和0.1~7 μmol/L, 檢出限為0.29 nmol/L, 且擁有良好的選擇性, 能用于湖水樣品中銅離子的檢測.
銅是水中一種微量的金屬元素， 在生物體的新陳代謝過程中發(fā)揮重要作用， 但過量的銅對生物體危害極大. 銅離子污染的環(huán)境水常被用作生活用水或灌溉用水， 直接影響生物體的生長和發(fā)育， 因此探索快速、 靈敏、 選擇檢測水樣中銅離子的方法對于環(huán)境監(jiān)測具有重要意義［1，2］. 目前， 環(huán)境水中銅離子的檢測方法有原子吸收光譜法［3］、 電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法［4］和電感耦合等離子體-質(zhì)譜法等［5］， 然而這些方法操作復雜， 樣品處理較為煩瑣且成本較高. 相比較而言， 熒光光譜法由于靈敏度高、 操作簡單和響應(yīng)快等優(yōu)點近年來受到廣泛關(guān)注［6］. 然而， 銅離子本身不具有熒光， 因此不能使用直接熒光分析方法進行定量檢測， 這就需要采用借助于熒光探針的間接熒光法來對銅離子進行檢測. 這種間接熒光法檢測銅離子通常選擇性不佳， 因此迫切地需要開發(fā)出分子識別受體結(jié)合熒光探針實現(xiàn)銅離子的選擇靈敏檢測.
多肽因易于制備、 成本相對較低、 生物相容性優(yōu)良、 水溶性好及對分析物具有高親和力等優(yōu)點而成為優(yōu)良的分子識別受體［7］. 據(jù)文獻［8~12］報道， 精氨酸、 組氨酸和賴氨酸對銅離子有高親和力， 基于此， 本文設(shè)計了羅丹明B標記的多肽序列（RBP）作為識別銅離子的選擇性生物受體， 發(fā)現(xiàn)低濃度的銅離子能夠猝滅該多肽的熒光， 據(jù)此構(gòu)建了檢測銅離子的傳感器， 檢測原理如Scheme 1所示.
1 實驗部分
1.1 試劑與儀器
羅丹明B標記的多肽（RNRHTHLRTRPRK-Rhodamin B， RBP， 結(jié)構(gòu)見Scheme 2）， 每條多肽標記1個羅丹明B熒光團， 標記過程中羅丹明B熒光團通過羧基與多肽末端賴氨酸側(cè)鏈的氨基進行鍵合；三羥甲基氨基甲烷購自中國醫(yī)藥集團有限公司；羅丹明B、 醋酸和醋酸鈉購自上海試劑廠；鹽酸、 六水合硝酸銅購自西隴化工股份有限公司（汕頭）；所用化學試劑均為分析純. 用醋酸鈉和醋酸配制100 mmol/L pH=3~6的緩沖溶液；用三羥甲基氨基甲烷和鹽酸配制100 mmol/L pH=7~8的緩沖溶液. 實驗用水為二次蒸餾水.
F-4600型熒光分光光度計（日本日立公司）；UV-2550型分光光度計（日本島津公司）；C11367-11型熒光壽命測試儀（日本濱松光子學公司）；MOS-450型多功能圓二色光譜儀（法國Bio-Logic公司）.
1.2 實驗過程
1.2.1 熒光測定銅離子
在含1.0 μmol/L RBP的醋酸鈉/醋酸緩沖液（10 mmol/L， pH=5）中加入不同濃度的銅離子， 混合均勻后于室溫下反應(yīng)3 min， 用熒光分光光度計檢測.
1.2.2 湖水中銅離子的預處理及測定
水樣取自南昌市潤溪湖， 先將水樣在10000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min， 取上層液用0.22 μm濾膜過濾， 按照1.2.1節(jié)方法對銅離子進行測定.
2 結(jié)果與討論
2.1 不同pH下RBP多肽對銅離子的熒光行為
圖1（A）和（B）分別為在不同pH的10 mmol/L醋酸鈉/醋酸緩沖液中有、 無銅離子存在時的RBP多肽的熒光光譜. 可見， 無論有無銅離子存在， 在激發(fā)波長為550 nm處， RBP多肽的熒光發(fā)射強度均隨著緩沖液pH值的增大而降低， 其原因可能是增加pH加大了RBP多肽分子的聚集程度. 基于RBP多肽分子的等電點值（pI=12.71）， RBP多肽分子在整個研究的pH范圍內(nèi)（pH=3.0~ 8.0）均帶正電， 而增加溶液pH值將導致RBP多肽分子中的氨基去質(zhì)子化， 從而有利于RBP分子的聚集， 這將有利于羅丹明B的非熒光二聚體或聚集體的形成， 從而增強其熒光猝滅［13，14］. 由圖1（C）和（D）可見， 當緩沖溶液pH=5.0時， 在600 nm處無銅離子存在下的RBP 多肽熒光發(fā)射強度（F0）與有銅離子存在下的RBP 多肽熒光強度（F）之差最大， 因此選擇pH=5.0作為熒光檢測銅離子的最優(yōu)條件.
2.2 反應(yīng)時間的選擇
考察了反應(yīng)時間對Cu2+檢測的影響， 結(jié)果表明， 將3.0 μmol/L的Cu2+加入到RBP溶液中時， RBP的熒光發(fā)生猝滅， 反應(yīng)3 min即可達到穩(wěn)定. 因此， 選擇反應(yīng)時間為3 min.
2.3 銅離子的熒光檢測
圖2（A）為向pH=5.0的10 mmol/L醋酸鈉/醋酸緩沖液中加入不同濃度銅離子后RBP多肽的熒光光譜. 可見， 隨著銅離子濃度的增加， RBP多肽的熒光強度逐漸減小. 有、 無銅離子存在下的RBP多肽熒光強度比（F/F0）與銅離子濃度（c， μmol/L）之間存在2個良好的線性關(guān)系［圖2（B）］， 這2個線性范圍分別為0.0005~0.01 μmol/L和0.1~7 μmol/L， 相應(yīng)的線性回歸方程分別為F/F0=0.96‒22.56c， 相關(guān)系數(shù)為0.999；F/F0=0.74‒0.04c， 相關(guān)系數(shù)為0.996. 根據(jù)3倍信噪比估算出銅離子的檢出限為0.29 nmol/L， 此檢出限遠低于世界衛(wèi)生組織和美國環(huán)境保護署對水中銅離子最大污染水平的規(guī)定［15］.
2.4 熒光傳感機理研究
圖3（A）為在pH=5.0的10 mmol/L醋酸鈉/醋酸緩沖液中有、 無銅離子存在時羅丹明B的熒光光譜. 可見， 加入銅離子后羅丹明B的熒光光譜幾乎無變化， 說明銅離子誘導RBP多肽的熒光猝滅不是由RBP多肽中的羅丹明B單元與銅離子的相互作用導致， 而可能是因為RBP多肽中的多肽單元和銅離子的結(jié)合導致. 因此， 進一步利用共振光散射和紫外-可見吸收光譜探究了RBP多肽與銅離子的相互作用. 由圖3（B）可見， 加入銅離子后， RBP多肽的共振光散射增強， 說明銅離子的加入促進了RBP多肽的聚集. 此外， 由圖3（C）可見RBP多肽在562 nm處有強吸收譜帶， 低濃度銅離子在此波長范圍無吸收， 當銅離子加入到RBP多肽溶液中后吸收譜帶藍移557 nm， 這說明銅離子促進了RBP多肽的聚集， RBP多肽的聚集很可能增強羅丹明B的非熒光二聚體或聚集體的形成［16，17］. 同時， 紫外-可見吸收光譜也表明， 熒光猝滅機理與RBP多肽和銅離子之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移或它們之間的內(nèi)濾效應(yīng)無關(guān). 另外， 實驗還測定了有、 無銅離子存在時RBP多肽的熒光壽命， 發(fā)現(xiàn)RBP多肽的熒光壽命約為2.11 ns， 而加入銅離子后RBP多肽的熒光壽命幾乎無變化， 約為2.04 ns， 進一步說明熒光猝滅機理可能是因為銅離子與RBP多肽結(jié)合， 從而誘導羅丹明B的非熒光二聚體或聚集體的形成. 將圓二色光譜進一步用于有、 無銅離子存在時RBP多肽的結(jié)構(gòu)表征. 由圖3（D）可見， RBP多肽在200， 206和214 nm 處的紫外區(qū)間有強的負譜帶， 而在196 nm處顯示強的正譜帶， 這些譜帶歸屬于多肽的β折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)［18］；當加入銅離子后， 200和206 nm處的譜帶強度減弱而224和240 nm處的譜帶強度增強， 說明銅離子的加入增加了RBP多肽的α螺旋和β轉(zhuǎn)角的含量， 而減少了β折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的含量［18］， 此外， 還表明銅離子的加入可能導致RBP多肽結(jié)構(gòu)變化， 進而使羅丹明B熒光團彼此接近形成非熒光二聚體或聚集體.
2.5 傳感器的選擇性
為了評價此RBP多肽熒光傳感器對銅離子的選擇性， 測試了加入不同金屬離子（Ag+， Sn2+， Ba2+， Ni2+， Cd2+， Cr3+， Pb2+， Mn2+， Al3+， Hg2+， Ca2+， Zn2+， K+， Fe3+， Fe2+， Li+）后RBP多肽的熒光響應(yīng)［圖4（A）］. 由圖4（B）可見， 加入銅離子后F/F0顯著減小， 而加入其它金屬離子所導致的F/F0的變化很小， 表明基于RBP的熒光傳感器對銅離子有高選擇性. 此外， 考察了RBP多肽與銅離子作用的共存離子效應(yīng)， 測試了在RBP多肽中加入Cu2+和上述其它金屬離子后RBP多肽的熒光響應(yīng)［圖4（C）］. 由圖4（D）可見， 在RBP多肽中同時加入Cu2+和其它不同金屬離子后的F/F0值與僅加入Cu2+的接近， 進一步說明此熒光傳感器對銅離子有高選擇性.
2.6 實際水樣分析
為了評價該熒光傳感器檢測實際樣品中的實用性， 對南昌市潤溪湖的水樣進行了測定， 發(fā)現(xiàn)水 樣中含有0.002 μmol/L的銅離子， 隨后將不同濃度的銅離子加入到湖水樣中評價了該方法的可靠性. 由表1可見， 添加值和測量值接近， 相對標準偏差RSD<4.4%， 說明該方法可用于水樣中銅離子的檢測.
3 結(jié) 論
基于銅離子對羅丹明B標記的多肽的熒光猝滅作用， 構(gòu)建了一種用于檢測銅離子的高選擇、 高靈敏熒光傳感器. 該傳感器檢測銅離子的線性范圍為5×10‒4~1×10‒2 μmol/L和0.1~7 μmol/L， 檢出限為0.29 nmol/L， 可用于實際水樣中銅離子的檢測. 預期此熒光傳感原理結(jié)合選擇性多肽可用于構(gòu)建檢測食品或環(huán)境中其它有毒有害物質(zhì)的傳感器.
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