摘要：基于多肽和蛋白質的水凝膠體系作為生物材料的一個重要種類,受到了廣泛關注,近年來更得到了 長足的進步。其凝膠化的機制既可以是側基之間的物理組裝和聚集,也可以是反應性殘基之間的可控化學反 應。兩者協同作用可進一步促進其功能改性。多肽和蛋白質獨有的生物活性及其結構和功能上的多樣性和可 調性為生物材料的發(fā)展提供了諸多可能,展現出廣泛的應用前景。本文對基于多肽和蛋白質的水凝膠的設計、制備和應用等研究進展進行了簡要的介紹與總結,并對該領域的進一步發(fā)展進行了展望。
引言：材料科學與生命科學的交叉,推動了生物材料的迅猛發(fā)展。水凝膠是一類非常重要的生物材料。它 是由親水性三維網狀結構與大量水構成的獨特分散體系,能夠在水中溶脹而不溶解。多數軟組織就是由 蛋白質和聚糖等生物高分子組成的水凝膠。因此,水凝膠在生物醫(yī)學領域,特別是藥物釋放、組織工程、再生醫(yī)學、生物傳感器、柔性促動器以及人工細胞外基質等方面具有廣泛的應用前景[1~3] 。近年來,基于 多肽和蛋白質的水凝膠,因其結構上的精確性和功能上的多樣性得到特別的關注,本文將就該體系做簡 要的介紹和總結。
1 背景
構建水凝膠可以通過物理交聯和化學交聯的方法 。前者基于非共價鍵相互作用 , 如靜電作用 、疏水 作用 、氫鍵等作用;后者則是基于共價鍵作用 。評價水凝膠作為生物材料的應用前景的兩個方面是生理 活性和機械性能[4, 5] 。生理活性主要取決于高分子的組成 、分布及其與細胞之間的相互作用;而機械性能 主要取決于交聯點的強度和密度 。兩者直接影響細胞的生長和分化行為[3, 6] 。近年來 , 圍繞水凝膠的功 能化和機械性能改性涌現了很多出色的工作 。一方面 , 人們通過加入納米復合物或大分子聚集體參與交 聯[7] , 改變交聯點的性質 , 結合兩個甚至多個性質互補的網絡[8, 9] 或者利用不同交聯機理協同作用[10, 11] 等方法來改進水凝膠的力學性能;另一方面 , 通過引入具有生理活性的基元并控制它們在時間空間上的 表現來改進水凝膠的生理活性 。綜合調控這兩方面的性質是水凝膠研究的重要方向 。
多肽和蛋白質均為一類由α-氨基酸以肽鍵相連而成的化合物。一般把含有100個(有時是50個)以 上氨基酸的多肽稱為蛋白質。它們在體內起到了極為重要的生理功能,可以說是構成生命的物質基礎。
雖然其組成僅包含20種天然氨基酸,它卻能在生命過程中起到復雜多樣的關鍵功能。這主要歸因于其精確的序列結構和多級的空間結構。氨基酸上不同性質的官能團(疏水、親水、電中性、電負性、極性基團)的微妙平衡和巧妙結合正是蛋白質能進行有序折疊和實現多種功能的關鍵。
多肽可以通過固相合成,也可以通過蛋白質降解得到。多肽的固相合成雖然只適用有限長度分子的合成(通常小于50個氨基酸),但是可以方便地引入各種非天然氨基酸[12] 。蛋白質的生物合成則是由DNA的轉錄與翻譯實現的一個高度精確可靠的模板聚合反應�，F代基因工程和重組蛋白質生物合成的迅猛發(fā)展為蛋白質生物材料研究提供了很好的基礎,而蛋白質工程更進一步拓展了其可修飾性和功能性。例如,schultz組[13,14]與Tirrell組[15,16]成功將非天然氨基酸引入蛋白質,為設計與操縱特殊蛋白質提供了極大的便利。定點突變和定向進化等技術的成熟更容許人們對于同一種蛋白質的性質進行改進和微調,其結構和功能控制的精確水平是合成高分子體系里所不能比擬的。
2 基于多肽/蛋白質-合成高分子的水凝膠體系
合成高分子雖然不具有生物大分子的結構精確度 , 生理功能也相對有限 , 但是其單體結構復雜多樣 , 也比較容易修飾并實現量產�，F代可控聚合技術的發(fā)展更提供了控制合成高分子分子量 、分散度等重要 結構參數的多種有效方法。因而 , 合成高分子與多肽和蛋白質在作為材料方面具有很多互補的優(yōu)點 , 其 復合水凝膠體系也備受關注。Michael加成 、點擊化學[17] 等一系列快速高效的化學修飾手段為創(chuàng)造復合 水凝膠提供了合適的手段 , 架起了合成體系和生物體系之間的橋梁 , 促進了這個方向的蓬勃發(fā)展。
PEG是一類 具 有 很 好 生 物 相 容 性 的 水溶性合成高分子 , 被廣泛應用于生物高分子的改性和制備水凝膠�；� PEG 的水凝膠因而被認為是水 凝膠體系的“金標準”。已有很多工作將 PEG 和多肽或蛋白質結合在一起制備水凝膠。最常用的反應是 基于半胱氨酸的巰基或者賴氨酸的氨基的反應。例如 , Hubbell組通過 PEG 的乙烯砜端基與含有精氨 酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(RGD)多肽片段上的巰基之間的 Michael加成實現凝膠化 , 發(fā)展支持細胞黏附 與酶降解的細胞外基質[20~22] 。該體系中還引入了能夠被基質金屬蛋白酶(MMP)或血漿酶特異性降解 的多肽序列 。不同多肽序列的降解速率不同 , 以此就可以調節(jié)體系的降解速率。該體系被成功應用在細胞培養(yǎng)過程 。結果表明 , 細胞在更容易被降解的水凝膠中舒展和遷移的速度更快 。
相比于點擊化學 , 酶催化的可控偶聯也許和細胞過程更為兼容 。比如谷氨酰胺轉胺酶可以有效地催 化谷氨酰胺和賴氨酸之間的異肽鍵形成 。Ehrbar與 Lutolf、weber等制備了兩種八臂 PEG, 其末端分別 攜帶兩類多肽:一類含有谷酰胺受體底物(Gln),一類是含有供基質金屬蛋白酶降解的多肽序列的賴氨酸 底物(Lys)。兩種大分子在谷氨酰胺轉胺酶的作用下共價相連 , 就可以形成網絡結構 。因為這個方法也 適用于和生物大分子的共價偶聯 , 所以該復合水凝膠也可被用于固定含有特定標簽的融合蛋白 , 比如捕獲人胚腎細胞(HEK-293T)分泌出的標簽生長因子 。加載了生長因子的水凝膠體系可以作為指導細胞 行為的智能人工細胞外基質[29] 。
蛋白質相互作用也是構建復合水凝膠的有效驅動力 。組報道了利用卷曲螺旋聚集交聯的 蛋白質-高分子復合水凝膠[36] 。該體系組成為 N-(2-羥丙基)-甲基丙烯酰胺和 N-(N’, N’-二羧甲基氨丙 基)-甲基丙烯酰胺兩種單體的共聚物(HPMA-co-DAMA),以及具有卷曲螺旋(coiled-coil)結構的兩種蛋 白質 CC1 與 CC2。其中 CC1 來源于驅動蛋白的莖部區(qū)域(~150個氨基酸), CC2則是基于從頭設計的 多肽鏈(~50個氨基酸),具有極高的熱穩(wěn)定性 。蛋白質與合成高分子之間首先通過組氨酸標簽和高分 子側鏈羧基之間的 Ni2十 離子配位絡合接枝相連 , 而卷曲螺旋的進一步聚集則有效導致了物理凝膠的形 成 。這種方法具有一定的普適性 , 也適用于比如 zn2十 、Ca2十 、Mg2十 等離子 , 將有可能允許體系作為生物環(huán)境下對金屬離子響應的微型傳感器 。
總的來說 , 制備蛋白質-高分子復合水凝膠 , 主要是為了利用蛋白質的生物活性和合成體系的易制備 和易修飾性 , 這類體系具有一定的促進細胞生長與分化的能力 。目前的挑戰(zhàn)主要在于進一步開發(fā)和利用 與生物過程相容的化學反應 , 在最大程度保證蛋白質生理活性的基礎上實現凝膠化 , 并進一步改進機械 性能 , 實現水凝膠功能多樣化 、圖案化和智能化 , 更好地模擬天然細胞外基質的特性 , 開拓其在組織工程 中的運用 。
3 完全基于多肽和蛋白質的水凝膠體系
多肽或蛋白質與合成高分子的復合水凝膠體系結合了兩者的優(yōu)點 , 但是在不影響生理活性的前提下 實現可控偶聯的方法相當有限 。同時 , 對于大多數體內應用來講 , 合成高分子的生物相容性及可降解性質等也需要慎重考慮 。因此 , 完全基于多肽或蛋白質的水凝膠體系成為一個非常吸引人的方向 。它取法自然 , 能夠更好地對生物體系進行模擬 。
多肽的自組裝是豐富多彩的。多肽的組成并不限于傳統(tǒng)的20種天然氨基酸,還包括各種非天然氨基酸。同時,即使僅含有數個殘基,多肽仍然可以展現強烈的組裝現象,形成有序結構。徐兵和楊志謀等[41]構建了D構型的四肽,這種四肽具有萘基端基ADA苯丙氨酸ADA苯丙氨酸ADA賴氨酸ADA酪氨酸的結構,能夠結合紫杉醇等生物活性分子。磷酸化的多肽前體一經去磷酸化,就能組裝形成具有纖維骨架的凝膠。由于D型氨基酸有一定的抗降解能力,該體系能夠長時間保持穩(wěn)定,并緩慢釋放藥物。ulijn等[42]僅利用一種末端是芴甲氧羰基(Fmoc)的二肽,就實現了多肽凝膠化過程,其中π-π相互作用被認為是凝膠化的關鍵。隨后Gough與ulijn等將芴甲氧羰基-二苯丙氨酸多肽(FmocFF)與芴甲氧羰基-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽(Fmoc-RGD)的水溶液混合,也得到了具有納米纖維結構的水凝膠,并可用于增強封裝在其中的人類真皮成纖維細胞的增殖與生長[43,44] 。
多肽也可以通過更為復雜的二級結構的相互作用實現凝膠化。多肽β折疊的有序組裝率先激發(fā)了研究者對多肽凝膠的研究。例如,具有16個谷氨酸(E)-甘氨酸(A)-賴氨酸(K)重復單元的多肽(EAK16),可以通過多肽鏈間氫鍵作用形成β折疊的平面,這些平面再通過殘基間的靜電作用進行堆疊,從而形成特定的三維結構[45~46] 。另一種IsK蛋白中的轉膜結構域具有富含賴氨酸的多肽片段,也能夠基于上述方式形成凝膠[47] 。在該工作中,Aggeli等把能夠發(fā)生凝膠化的多肽體系的理性設計總結為三個原則:(1)不同鏈的側基間要具有吸引力(如疏水相互作用、靜電相互作用、氫鍵作用、π-π堆疊等);(2)肽鏈段側基在某方向上(通常為垂直于β折疊平面的方向)具有一定的識別作用,可以限制一個方向上的自組裝;(3)結構表面要對溶劑分子有較強的吸附性[47] 。
多肽水凝膠的進一步功能化也是研究者青睞的熱點 。張曙光等[51] 發(fā)現具有納米纖維結構的多肽水 凝膠體系可以包藏并緩釋溶菌酶 、免疫球蛋白 G 等不同結構不同電性的蛋白質 , 其緩釋速度取決于蛋白 質大小而非蛋白質電性 , 并且釋放的蛋白質仍可以保持原來的高級結構[52] 。這說明方法具有一定的普 適性 , 換言之 , 通過合理設計調整水凝膠的骨架尺寸 , 就可以精確調控其緩釋過程[53] 。這為研究細胞生 理和組織工程提供了有利的平臺 。但是另一方面 , 相比蛋白質而言 , 多肽在其生理功能多樣性和生物過 程的角色上都比較有限 。因此 , 全蛋白質水凝膠的研究也正方興未艾 。
基因重組和生物合成手段的成熟使得重組蛋白質的制備和性質調控變得常規(guī)。在生物體內,蛋白質基元之間的交聯是形成細胞外基質和其它蛋白質材料的重要過程。因此,完全基于蛋白質的水凝膠可以最大程度地模擬人工細胞外基質和利用天然蛋白質的生物活性。目前,多數全蛋白質水凝膠都是基于可控確定的蛋白質-蛋白質相互作用或較不規(guī)整的蛋白質聚集所形成的物理交聯。前者如亮氨酸拉鏈(Leucinezipper)的聚集作用[54,55]、二價離子耐受蛋白(cutA)的三聚[56,57] 以及鈣-鈣調蛋白(calmodulin)的結合等[58] ,后者如彈性蛋白的熱聚集[59] 和富含脯氨酸的肽段的聚集等[60] 。
亮氨酸拉鏈(Leucine zipper)是一種能形成卷曲螺旋結構的蛋白質,由多個71 螺旋聚集形成,其七 元重復單元可以表示成abcdefg,其中兩組螺旋的a與d為疏水基團,通常為亮氨酸,e與g為帶電殘基 (見圖10a)。它們通過亮氨酸的疏水作用形成卷曲螺旋。Tirrell組利用亮氨酸拉鏈的疏水相互作用作 為交聯手段,設計了三嵌段組蛋白質基元Ac10A[61] (見圖10b),A代表亮氨酸拉鏈,c10代表親水柔性鏈。它可以形成水凝膠,并具有pH響應性。當pH升高時,亮氨酸拉鏈A上谷氨酸的離子化使亮氨酸拉鏈 解聚。核磁表征進一步發(fā)現,體系中水溶性的柔性鏈段是動態(tài)變化的,而亮氨酸拉鏈則表現為比較剛性 的結構,這與設想的結構是相吻合的[62] 。
Kennedy等發(fā)現亮氨酸拉鏈存在二聚體-四聚體的平衡 , 這些聚集體共同構成了水凝膠的物理交聯 點 , 中間柔性肽鏈的水溶性可以防止多聚體的無規(guī)聚集析出[63] 。然而 , 在開放溶液環(huán)境中 , 蛋白質會逐 漸以環(huán)狀中間體的形式溶解到溶液中去 。為了穩(wěn)定此類水凝膠 , 他們將亮氨酸拉鏈 A 重復單元上的 d 位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?見圖 10c)。因為 A傾向于反平行聚集 , 這種設計使之更傾向形成分子間二硫 鍵而非分子內二硫鍵 , 減少了成環(huán)的可能性 , 提高了水凝膠的穩(wěn)定性[64] 。
利用天然蛋白質的反應性殘基也可以實現交聯的全蛋白質網絡。同時,對蛋白質的簡單修飾可以允 許以多種多樣的方法來實現凝膠化。雖然這并不完全是全蛋白質基水凝膠,但它大大拓展了蛋白質基水 凝膠的范疇和功能,提供了其改性的新思路。例如,自然界中的貝類能夠牢牢固定在巖石上,主要歸功于 其貝類黏附蛋白(MAP)中關鍵成分3,4-二羥基苯丙氨酸(DOPA)的存在,其原理被Messersmith等在基 于PEG體系的合成高分子水凝膠中已有體現[73,74] 。Cha組進一步在蛋白質體系里也做了詳細的工作。他們首先利用蘑菇酪氨酸酶對重組fp-1型MAP進行后修飾,獲得含有DOPA的MAP蛋白質[75] 。它 既能與Fe3+ 形成多齒配合物[76,77] ,又能在氧化條件(如IO4- )下形成共價交聯。這為全面提升全蛋白質 水凝膠的粘附性和機械性能提供新的一種思路。
由此可見,具有高度特異性和強親和力的蛋白質-蛋白質相互作用在全蛋白質水凝膠中可以發(fā)揮其強大的功能。通過基因工程的方法可以編輯凝膠前體的結構和功能,而生物合成則保證我們能夠簡便地獲得具有相應結構和功能的凝膠前體蛋白質。兩種方式結合,能夠更加快速簡便地獲得不同功能的凝膠前體蛋白質,從而實現模塊化構建全蛋白質水凝膠。例如,在前體蛋白質中嵌入一段結構域,同時在另一前體蛋白質中引入與之結合的互補結構域,就可以結合不同的功能蛋白設計重組融合蛋白質,以制備功能性水凝膠。結構域之間結合的不同動力學和不同穩(wěn)定性可以被用來微調水凝膠的宏觀性質。
4 總結與展望
在近幾十年的科學道路上,蛋白質工程經歷了飛速的發(fā)展,而材料研究也日新月異�？梢哉f,對合成高分子水凝膠的研究已經相當成熟。目前,生物大分子-合成高分子的復合水凝膠方向取得了相當大的進展,完全基于多肽和蛋白質的水凝膠體系也正日新月異。有理由相信,利用蛋白質的優(yōu)勢構建水凝膠材料,在未來仍具有極其廣闊的前景以及應用潛力。然而該領域仍然存在一系列重大的挑戰(zhàn)。首先,如何找到一種合適、簡便可行而又生物相容的凝膠化方法,以適應廣泛的生物用途? 其次,如何利用其特殊的功能性,為體系增添豐富的刺激響應性和智能性,進一步提升蛋白質水凝膠的生物價值? 如何真正將材料從惰性變成活性,從被動變成主動? 自然界具有各式各樣、功能豐富的蛋白質,要在浩如煙海的蛋白質庫中尋找合適的蛋白質,并運用到水凝膠的構建和功能化中,需要結構生物學和生物信息學的合作發(fā)展。全蛋白質水凝膠是一個可以以基因編碼的方式去調控材料宏觀性能的獨特體系,為我們研究材料結構功能關系提供了強有力的手段。相信在未來幾年內,全蛋白質水凝膠將會脫穎而出,成為生物材料中極具生命力和實際應用潛力的一個領域。
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