摘要 將羧基化的水溶性葡聚糖(Dex) 與紫杉醇( PTX) 化學(xué)偶聯(lián), 制得載藥納米膠束 M( PTX), 再將M(PTX)與嗜神經(jīng)性病毒衍生肽(RVG29)化學(xué)偶聯(lián), 得到 RVG29 靶向的載藥納米膠束 M(RVG,PTX). 采用核磁共振氫譜(1H NMR)測(cè)定了 Dex-PTX 及 RVG-Dex-PTX 鍵合物的分子量, 并對(duì) 2 種膠束進(jìn)行了表征, 考察了 2 種膠束對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果及細(xì)胞凋亡情況, 觀察了 C6細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記 M(RVG,PTX)和M(PTX)的攝取情況. 結(jié)果表明, 羧基化葡聚糖鄄紫杉醇鍵合物的分子量約為 16500, 紫杉醇的質(zhì)量約為葡聚糖的20% , RVG29 的質(zhì)量約為葡聚糖的 10% . 2 種膠束的粒徑在 45 ~ 60 nm 之間; M(RVG,PTX)膠束對(duì) C6細(xì)胞的抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性, 細(xì)胞抑制率隨著作用時(shí)間和藥物濃度增加而增加, 且 M(RVG,PTX)膠束對(duì) C6細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于 M(PTX)膠束. 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 與 M(PTX)相比, C6細(xì)胞攝取了更多的M(RVG,PTX)膠束. 如果先用游離的 RVG29 處理 C6細(xì)胞, 再進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn), 則 M(RVG,PTX)膠束對(duì) C6細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及被 C6細(xì)胞攝取的比率顯著降低, 與 M(PTX)相當(dāng). 表明靶向載藥膠束 M(RVG,PTX)中的 RVG29 保留了游離 RVG29 的活性, 對(duì) C6細(xì)胞依然具有靶向效應(yīng), 從而介導(dǎo)了 M(RVG,PTX)被 C6細(xì)胞的攝取, 增強(qiáng)了對(duì) C6細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用. 由于 M(RVG,PTX)膠束只使用水溶性葡聚糖作載體, 不涉及疏水高分子鏈段, 不需要分別制備載藥高分子和靶向高分子然后再共組裝, 因而制備過程比較簡(jiǎn)單, 同時(shí)具有載藥和靶向功能.
腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見惡性腫瘤, 發(fā)病率約占顱內(nèi)腫瘤的 40% . 高復(fù)發(fā)率和高惡性度導(dǎo)致患者 5 年存活率極低. 目前治療方法有手術(shù)、 放射和化學(xué)治療, 對(duì)芋鄄郁級(jí)膠質(zhì)瘤主要采用化學(xué)治療[1 ~ 3]. 但由于血腦屏障和腫瘤的耐藥性, 現(xiàn)有腦膠質(zhì)瘤化療藥物品種有限, 療效欠佳, 對(duì)延長(zhǎng)患者存活期幾乎無貢獻(xiàn)[4]. 隨著納米技術(shù)的發(fā)展, 納米藥物在癌癥治療中顯示出巨大的潛力和優(yōu)越性. 其中, 腫瘤靶向給藥體系將藥物選擇性地送到病變部位或病變細(xì)胞, 可以提高藥物的生物利用度, 降低毒副作用, 因而備受關(guān)注[5]. 紫杉醇(PTX)是多種腫瘤的一線化療藥物, 但其水溶性差, 臨床劑型難以通過血腦屏障, 對(duì)腦膠質(zhì)瘤幾乎無效[6]. Jing 等[7 ~ 11]設(shè)計(jì)了多種納米給藥系統(tǒng), 將 PTX 鍵合在兩親性嵌段共聚物分子鏈上再自組裝成納米膠束. 與傳統(tǒng)的物理包裹不同, 這種鍵合型納米膠束可有效地增溶難溶性藥物, 避免初期暴釋, 延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間, 提高生物利用度. 通過載藥高分子和靶向高分子的共組裝, 可以制得具有靶向功能的載藥納米膠束, 將藥物選擇性地送到病變部位或病變細(xì)胞, 進(jìn)一步提高藥物的生物利用度, 降低毒副作用. 但此類制劑使用兩親性嵌段共聚物作為基本載體, 合成難度較高, 新藥審批的難度也比較大[12,13].
狂犬病病毒是自然界存在的嗜神經(jīng)病毒, 其衣殼中包含有嗜神經(jīng)性蛋白質(zhì)(RVG), 能被神經(jīng)細(xì)胞表面的尼古丁乙酰膽堿受體(nAchR)特異性地識(shí)別. 在 RVG 作用下, 狂犬病病毒很容易越過血腦屏障, 侵襲腦組織和神經(jīng)中樞, 引發(fā)狂犬病. 研究發(fā)現(xiàn), RVG 中的 29 個(gè)氨基酸序列嗜神經(jīng)性病毒衍生肽(RVG29)[13 ~ 15](YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)同樣可被 nAchR 特異性地別. Liu 等[16]和Gong 等[17]將 RVG29 鍵合到聚酰胺鄄胺樹狀聚合物(PAMAM)和聚亞乙胺(PEI)上, 用以擔(dān)載和輸送核酸類藥物, 具有一定的腦靶向效果. 經(jīng) RVG29 修飾的 PAMAM 和 PEI 能夠通過血腦屏障(BBB)模型,但對(duì)細(xì)胞毒類抗癌藥物的腦靶向輸送鮮有報(bào)道.
葡聚糖可以在肝、 脾、 腎和消化道被葡聚糖酶降解, 毒性極低, 用葡聚糖修飾的高分子膠束在體內(nèi)具有類似聚乙二醇(PEG)的“隱形冶效果. 載藥葡聚糖納米顆�？蓽p少肝臟對(duì)藥物的清除, 提高在高度血管化的癌變組織中的藥物濃度[18,19]. 本文首先將葡聚糖羧基化, 然后將羧基化的葡聚糖與紫杉醇( PTX)化學(xué)偶聯(lián), 制得載藥納米膠束 M(PTX), 將 M(PTX)與 RVG29 化學(xué)偶聯(lián), 得到 RVG29 靶向的載藥納米膠束 M(RVG,PTX), 考察腦膠質(zhì)瘤 C6 細(xì)胞對(duì) M(PTX)和 M(RVG,PTX)的攝取能力和 2 種膠束對(duì) C6 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制能力, 通過比較 M(PTX)和 M(RVG,PTX)被細(xì)胞攝取和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力研究 RVG29 的引入對(duì)細(xì)胞攝取及細(xì)胞凋亡的貢獻(xiàn), 判斷 M(RVG,PTX)膠束越過 BBB, 實(shí)現(xiàn)腦靶向的可能性。
1 實(shí)驗(yàn)部分
N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、 4-二甲氨基吡啶(DMAP)、 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、 N-羥基硫代琥珀酰亞胺( sulfo-NHS)和狂犬病病毒衍生肽(RVG29), 葡聚糖(Dex, 分子量 10000)負(fù)責(zé); 紫杉醇(PTX); 二氯甲烷(DCM)和三乙胺(TEA), 分析純, 北京化工廠, 使用前用氫化鈣干燥后蒸餾; 乙腈, 色譜純, 上海復(fù)旦化學(xué)試劑有限公司; 二次蒸餾水, 用 SZ-93 型自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)制備; 磷酸鹽緩沖溶液(PBS), 濃度為 0.01 mol / L (pH = 7.4); 醋酸纖維素材質(zhì)的透析袋, 截留分子量 3500; 鼠 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(C6細(xì)胞), 吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室; 培養(yǎng)基: DMEM(美國(guó) Sigma 公司)+10% (體積比)熱滅活小牛血清+青霉素 100 U/ mL+鏈霉素 100 ug / mL,pH = 7.2 ~ 7.3, 過濾消毒; 小牛血清, 杭州四季青生物材料有限公司; 青霉素和鏈霉素, 華北制藥廠;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT), 上海阿拉丁試劑公司.
德國(guó) Varian 公司 Unity-400 型或 300 型核磁共振儀(1 H NMR), 溶劑為 DMSO-d6 , 以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo); 美國(guó) Perkin Elmer 公司 LS-55 型熒光光譜儀; 德國(guó) Leica 公司 TCS SP2 型共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM); 英國(guó) Malvern 公司 Nano ZS90 型激光粒度儀; 日本 JEOL 公司 JEM-1011 型透射電子顯微鏡(TEM); 美國(guó) Wyatt Technology 公司 DAWN EOS 型動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS); 美國(guó) BD Bioscience 公司 FACS Calibur 型流式細(xì)胞儀(FCM).
在 50 mg M(PTX)納米膠束溶液(10 mL)中加入 23 mg EDC 和 26 mg sulfo-NHS, 室溫?cái)嚢?4 h 后,加入 5 mg RVG29, 繼續(xù)攪拌 24 h, 透析除去未反應(yīng)的 RVG29, 獲得 RVG29 靶向膠束 M(RVG,PTX),凍干備用. 構(gòu)成該膠束的聚合物即為 RVG-Dex-PTX.
將消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 C6細(xì)胞制成 2*105 Cell / mL 的懸液, 接種于 96 孔培養(yǎng)板, 每孔 100 滋L 細(xì)胞懸液(2 *104 Cell), 并加入 200 uL 羧基化葡聚糖的 DMEM 溶液, 濃度分別為 20, 40, 80, 160, 320ug / mL, 培養(yǎng) 1 ~ 5 d, 以 DMEM 培養(yǎng)液作為對(duì)照, 采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)各組的細(xì)胞數(shù), 考察載體材料的生物相容性.
1. 4. 1 MTT 實(shí)驗(yàn) 將消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 C6細(xì)胞制成 2*10^5 Cell / mL 的細(xì)胞懸浮液, 接種于 96 孔培養(yǎng)板上, 每孔 100 滋L 懸浮液(2*10^4 Cell), 貼壁生長(zhǎng) 24 h 后, 加入 200 uL M(RVG,PTX)膠束或M(PTX)膠束溶液(其紫杉醇含量分別為 40, 20, 10, 5.0 ug / mL), 分別培養(yǎng) 24, 48 和 72 h, 以 DMEM 培養(yǎng)液為對(duì)照, 采用 MTT 法檢測(cè). 細(xì)胞抑制率(CI) 由公式 CI(% ) = ( AControl -AExp. ) / AControl *100% [ AControl 和AExp. 分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組 MTT 反應(yīng)產(chǎn)物甲瓚(Formazan)溶液在 570 nm 的吸光度]計(jì)算.
1. 4. 2 FCM 檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將消化 C6細(xì)胞接種于 25 cm2培養(yǎng)瓶中, 細(xì)胞密度 5*10^5 Cell / mL, 于37 益培養(yǎng) 24 h 后更換培養(yǎng)液, 分別加入 PTX 濃度為 0, 20 和 40 ug / mL 的 M(PTX)或 M(RVG,PTX)膠束溶液, 計(jì)時(shí). 在 24 和 48 h 分別收集各組細(xì)胞, 加入 0.5 mL 冰冷的 70% 乙醇溶液中, 于-20度冰箱保存. 將單細(xì)胞懸液以 1000 r/ min 離心 10 min, 棄去固定液, 用冷 PBS 緩沖液漂洗 2 次(1000r/ min, 5 min), 調(diào)整細(xì)胞為 1*10^9 Cell / L, 加入 5 滋L Annexin V, 195 uL PBS 緩沖液及 20 uL PI, 室溫避光孵育 20 min, 用 FCM 檢測(cè)細(xì)胞凋亡率. 每個(gè)劑量組檢測(cè) 3 個(gè)平行樣, 取平均值.
用 1% PBS 緩沖液沖洗預(yù)先培養(yǎng)在 NEST 玻底培養(yǎng)皿(上海耐思科學(xué)有限公司)上的 C6細(xì)胞 3 次,加入等體積相同熒光強(qiáng)度的 M(Cy5,PTX)和 M(Cy5, RVG,PTX)膠束溶液, 于 37度避光孵育 1 ~ 2 h,用 PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞, 加入 3.7% 多聚甲醛固定細(xì)胞 12 min, 用 PBS 緩沖液沖洗, 滴加 50 uL PBS /甘油混合溶液(體積比 1:1), 蓋上專用蓋玻片, 進(jìn)行 CLSM 觀察.
1. 5. 2 FCM 檢測(cè) 將 1 mL 密度為 1*10^6 Cell / mL 的細(xì)胞懸液種植在 6 孔板中, 以 DMEM 為培養(yǎng)基, 于 37度無菌培養(yǎng), 觀察到細(xì)胞均勻貼壁生長(zhǎng)后, 加入等體積等熒光強(qiáng)度的 M(Cy5,PTX) 和M(Cy5, RVG, PTX)膠束溶液, 反應(yīng) 1 ~ 2 h 后倒掉培養(yǎng)基, 加入 1 mL 胰蛋白酶, 孵育 1 min 左右, 在顯微鏡下觀察細(xì)胞由貼壁狀態(tài)變?yōu)閼腋顟B(tài). 收集細(xì)胞懸液, 以 1000 r/ min 的速度離心 5 min, 棄去上清液, 離心管底部細(xì)胞重新用新鮮的 0度 PBS 緩沖液吹打懸浮. 重復(fù) 3 次后, 取 3 mL 細(xì)胞懸液, 用200 目尼龍布過濾后, 用流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)進(jìn)行測(cè)試, 記錄 10000 個(gè)細(xì)胞的熒光信號(hào), 計(jì)算平均值.
在以上細(xì)胞攝取和生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)中, 為了證明 RVG 納米膠束是通過 RVG 受體介導(dǎo)的途徑進(jìn)入細(xì)胞, 專門設(shè)立一個(gè)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組, 在孵育介質(zhì)中加入游離 RVG29, 使其濃度為 40 ug / mL, 孵育 30 min 后再加入 M(RVG,PTX) 或 M(Cy5, RVG,PTX) 膠束溶液, 其它條件與正常 M(RVG,PTX) 或 M(Cy5,RVG,PTX) 組 相 同. 這 一 過 程 稱 為 “ RVG 封 閉 ( RVG-shielding), 相 應(yīng) 樣 品 稱 為 “ RVG-shieldedM(RVG,PTX)冶或“RVG-shielded M(Cy5,RVG,PTX)
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表述為“平均值(X)依標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)冶. 采用 t-檢驗(yàn)方法分析各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的統(tǒng)計(jì)偏差, p < 0.05 視為實(shí)驗(yàn)偏差有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.
2 結(jié)果與討論
靶向載藥膠束 M(RVG,PTX)的腫瘤細(xì)胞抑制率明顯高于非靶向載藥膠束 M(PTX), 在每個(gè) PTX濃度值和每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都可觀察到這種差別. 當(dāng) PTX 濃度為 5 ug / mL 時(shí), 在 24, 48 和 72 h 時(shí), M(PTX)組的 C6細(xì)胞抑制率分別為(32+-1.8)% , (44+-1.8)% 和(50+-1.8)% , 而 M(RVG,PTX)組的 C6細(xì)胞抑制率分別為(43+-2.8)% , (58+-3.1)% 和(62+-3.1)% , 差別顯著(p<0.05).
為進(jìn)一步證實(shí)腫瘤細(xì)胞抑制率的增加是通過 RVG29 的靶向作用實(shí)現(xiàn)的, 采用游離 RVG29 多肽預(yù)先封閉相關(guān)受體, 再給予靶向載藥膠束 M(RVG,PTX), 結(jié)果如圖 2 中“RVG-shielded冶組所示. 可見封閉后 M(RVG,PTX)的細(xì)胞抑制率與 M(PTX)膠束組的抑制率無明顯差別. 當(dāng) PTX 濃度為 5 ug / mL 時(shí),24, 48 和 72 h 時(shí) M(RVG,PTX)組的 C6細(xì)胞抑制率分別為(43+-2.8)% , (58+-3.1)% 和(62+-3.1)% ,而 RVG-shielded 組的 C6細(xì)胞抑制率分別為(34+-2.6)% , (43+-2.2)% , (52+-2.2)% , 均明顯低于靶向載藥膠束組, 與未經(jīng)封閉的 M(PTX)組相當(dāng)[(32 +-1.8)% , (44+-1.8)% 和(50+-1.8)% ]. 說明游離RVG29 與 C6細(xì)胞上受體的結(jié)合能力強(qiáng)于鍵合后的 RVG29, 而且在不封閉條件下 M(RVG,PTX)的抑制效果是與 RVG29 的存在分不開的, RVG29 與細(xì)胞表面受體作用所介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)納米膠束的攝取, 提高了細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度, 增強(qiáng)了抑制效果.
3 結(jié) 論
將羧基化后的葡聚糖與紫杉醇化學(xué)偶聯(lián), 制備了載藥納米膠束 M( PTX), 進(jìn)而將 M( PTX) 與RVG29 化學(xué)偶聯(lián), 制備了 RVG29 靶向的載藥納米膠束 M(RVG,PTX), 實(shí)現(xiàn)了在同一個(gè)載體高分子鏈上既鍵合藥物分子, 又鍵合靶向分子. 與通常的基于雙親高分子的靶向載藥膠束相比, 本文方法充分利用了葡聚糖的生物相容性、 水溶性和可反應(yīng)性以及紫杉醇的疏水性, 避免了分別合成載藥高分子和靶向高分子然后進(jìn)行共組裝的麻煩, 不需要使用專門的疏水聚合物鏈段, 就能使紫杉醇的含量達(dá)到20% , 且膠束的水溶性和凍干后的復(fù)溶性都很好, 因而具有實(shí)際應(yīng)用的潛力. 體外 MTT, CLSM 和 FCM實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 靶向載藥膠束 M(RVG,PTX)對(duì) C6細(xì)胞增殖的抑制能力強(qiáng)于載藥膠束 M(PTX). 這種抑制作用主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的凋亡, 這種增強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡與 M(RVG,PTX)膠束表面的 RVG29 相關(guān). RVG29 經(jīng)過與葡聚糖鍵合和膠束化后依然保持對(duì) C6細(xì)胞的靶向性, 即與 C6細(xì)胞表面 RVG 受體的特異性識(shí)別和結(jié)合能力. M(RVG,PTX)正是通過 RVG29 的靶向作用提高了藥物的攝入效率, 增強(qiáng)了對(duì)腦膠質(zhì)瘤 C6 細(xì)胞的抑制作用, 具有良好的應(yīng)用前景.
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