摘要：分裂內(nèi)含肽通過剪接反應(yīng)實(shí)現(xiàn)多肽片段的連接， 具有高效且無痕的特點(diǎn)， 受到了廣泛關(guān)注. 本文基于分裂內(nèi)含肽的結(jié)構(gòu)特征與剪接反應(yīng)過程， 結(jié)合近年來關(guān)于分裂內(nèi)含肽性能優(yōu)化和應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行了綜合評(píng)述， 揭示其作為一種日漸成熟的蛋白質(zhì)工程化技術(shù)在蛋白質(zhì)化學(xué)合成領(lǐng)域的前景， 并簡(jiǎn)要分析了目前分裂內(nèi)含肽工具面臨的問題與挑戰(zhàn)， 并對(duì)可能的解決方案進(jìn)行了展望.
翻譯后修飾極大地豐富了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的多樣性［1］. 這些修飾蛋白在藥物開發(fā)［2］、 蛋白質(zhì)組學(xué)［3］以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系解析［4~8］等方面具有重要的應(yīng)用. 目前， 翻譯后修飾蛋白可以通過天然提取和生物表達(dá)等方法獲取. 但這些方法仍存在一系列問題， 例如， 天然提取難以獲得均一修飾的蛋白樣品， 而生物表達(dá)獲取含多種翻譯后修飾的蛋白樣品依然存在困難等. 蛋白質(zhì)化學(xué)合成技術(shù)是獲得翻譯后修飾蛋白的一種新興技術(shù)， 該技術(shù)基于固相多肽合成技術(shù)和多肽片段連接技術(shù). 固相多肽合成技術(shù)［9］可以直接將各種非天然氨基酸及帶有修飾基團(tuán)的氨基酸方便地引入多肽鏈中特定的位點(diǎn). 盡管固相多肽合成技術(shù)的合成能力上限一直在不斷提高［10］， 但大部分蛋白仍然難以通過固相合成一次性獲取. 因此， 使用多肽片段連接技術(shù)能夠?qū)⒑囟ㄐ揎椀亩嚯钠芜M(jìn)行連接， 極大地?cái)U(kuò)展了蛋白樣品的獲取范圍（圖1）. 通過多肽片段連接， 研究者們已經(jīng)合成了帶有熒光標(biāo)記［11］， C13和N15等同位素標(biāo)記［12］， 磷酸化、 甲基化及泛素化等翻譯后修飾［13］， 以及含非天然氨基酸［14］等功能的蛋白質(zhì).
目前， 應(yīng)用最廣泛的化學(xué)連接技術(shù)是自然化學(xué)連接（NCL）. 該技術(shù)由芝加哥大學(xué)的Kent等［15］于1994年提出， 通過一個(gè)多肽片段的C-端硫酯與另一個(gè)N-端Cys多肽片段的選擇性化學(xué)反應(yīng)， 在連接位點(diǎn)處形成天然酰胺鍵. 早期， C-端硫酯的合成受到穩(wěn)定性差的困擾；近年來通過酰肼氧化的C-端硫酯原位合成及連接策略極大地促進(jìn)了這一方法的應(yīng)用［16~20］. 然而， 由于NCL反應(yīng)依靠隨機(jī)碰撞， 其連接效率受底物濃度的制約， NCL通常需要mmol/L級(jí)別的底物濃度. 當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀? mmol/L時(shí)連接效率低， 使得NCL在脂蛋白、 膜蛋白等難溶蛋白片段連接時(shí)產(chǎn)生困難. 為增加NCL在低濃度條件下的反應(yīng)效率， 研究者們提出了多種解決方案， 主要有：向反應(yīng)體系加入有機(jī)溶劑或者去垢劑以增加片段溶解度［21］；在主鏈上引入可移除的增溶修飾以打破氫鍵網(wǎng)絡(luò)、 削弱聚集傾向［22，23］；通過DNA-DNA、 蛋白-蛋白/小分子等強(qiáng)相互作用模板輔助片段連接， 使片段連接在近似分子內(nèi)反應(yīng)的條件下進(jìn)行［24］等. 此外， 使用活性更高的硒酯代替硫酯作為�；w的方案也能使得反應(yīng)在更低濃度下進(jìn)行［25］. 雖然這些策略有助于合成具有挑戰(zhàn)性的目標(biāo)， 但也存在增加安裝和移除標(biāo)簽或模板的額外操作、 標(biāo)簽最佳安裝位置難以預(yù)測(cè)及硒酯的穩(wěn)定性較低等固有問題， 導(dǎo)致這些方法在穩(wěn)健性和操作便捷性方面存在不足.
另一方面， 化學(xué)酶法因其能夠在低濃度下高效反應(yīng)， 在蛋白質(zhì)合成中也被廣泛應(yīng)用［26~28］. 但這類連接反應(yīng)通常需要在底物中引入酶特異性識(shí)別序列， 這些識(shí)別序列在反應(yīng)后往往會(huì)保留在產(chǎn)物蛋白的序列中， 留下序列“疤痕”， 如Sortase A酶的殘留序列LPXTG［29］. 雖然可以通過選擇目標(biāo)蛋白質(zhì)固有存在的酶的識(shí)別序列作為連接位點(diǎn)， 但這些情況是極其偶然的；通過高通量篩選技術(shù)對(duì)Sortase A進(jìn)行序列進(jìn)化［30~33］， 以及使用預(yù)先制備成硫酯的蛋白片段作為連接底物［34］等策略可以減少Sortase A酶的序列依賴性， 并減少反應(yīng)的可逆性［35］， 但要實(shí)現(xiàn)完全無痕的片段連接仍然困難.
因此， 尋找一種能夠高效連接蛋白片段且連接后無痕的蛋白連接工具， 成為研究者關(guān)注的方向. NCL反應(yīng)和Sortase A酶連接過程中都經(jīng)歷了硫酯和酰基S-N遷移過程；在生命進(jìn)化過程中， 泛素化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)等過程中也觀察到硫酯中間體和酰基S-N遷移過程［36］， 由此可見這是生成新的肽鍵的一種有效途徑. 事實(shí)上， 人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一類能夠通過硫酯中間體和�；w移路徑實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)片段的高效無痕連接的蛋白：內(nèi)含肽（Intein）. 內(nèi)含肽可以分為順式內(nèi)含肽（Cis-intein）與分裂內(nèi)含肽（Split intein）兩大類. 其中， 分裂內(nèi)含肽可以與需要進(jìn)行連接的蛋白片段分別相連， 已經(jīng)在大量蛋白質(zhì)連接與合成中展現(xiàn)出應(yīng)用價(jià)值， 受到了研究者的廣泛關(guān)注. 本文主要介紹分裂內(nèi)含肽作為一種蛋白質(zhì)合成工具， 結(jié)合分裂內(nèi)含肽在蛋白質(zhì)合成修飾領(lǐng)域的應(yīng)用案例， 分析了分裂內(nèi)含肽相比其它方法的優(yōu)勢(shì)， 總結(jié)分裂內(nèi)含肽的發(fā)展現(xiàn)狀， 并展望了其未來的發(fā)展前景.
1 分裂內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)
1969年， Anfinsen等［40］發(fā)現(xiàn)在特定的條件下， 分裂成2個(gè)片段的酶能夠非共價(jià)結(jié)合并恢復(fù)完整酶的催化功能. 1998年， Perler等［41］將這一思想運(yùn)用到內(nèi)含肽的設(shè)計(jì)改造中. 他們將Psp Pol-1內(nèi)含肽中的一個(gè)肽鍵切斷， 將其分裂為N-端片段（IntN）和C-端片段（IntC）， 將2個(gè)片段分別表達(dá)純化后在體外共復(fù)性， 結(jié)果表明2個(gè)片段通過非共價(jià)作用形成復(fù)合物并恢復(fù)剪接活性.
1998年， Liu等［49］在Ssp DnaE（藍(lán)藻的DNA聚合酶Ⅲ的催化亞基A）蛋白中鑒定出首個(gè)天然的分裂內(nèi)含肽. DnaE的N-端和C-端部分由2個(gè)單獨(dú)的基因DnaE-N和DnaE-C分別編碼. 在大腸桿菌中測(cè)試時(shí)， 2個(gè)分裂內(nèi)含肽片段通過非共價(jià)作用結(jié)合形成內(nèi)含肽復(fù)合物. 該復(fù)合物不僅具有類似內(nèi)含肽的序列特征， 而且表現(xiàn)出蛋白質(zhì)反式剪接活性， 剪接后得到完整的DNA聚合酶Ⅲ亞基A. 這一發(fā)現(xiàn)表明， 分裂內(nèi)含肽是天然存在的. 與人工分裂內(nèi)含肽相比， 天然分裂內(nèi)含肽具有可在非變性條件下組裝及剪接效率更高等優(yōu)勢(shì).
分裂內(nèi)含肽可以根據(jù)其寄主基因歸類為具有遺傳同源關(guān)系的家族類. 此外， 不同的分裂內(nèi)含肽在反應(yīng)過程中中間體存在差異， 也可以據(jù)此對(duì)分裂內(nèi)含肽進(jìn)行類別劃分. 在結(jié)構(gòu)上， 內(nèi)含肽一般呈現(xiàn)多個(gè)β片層的結(jié)構(gòu)， 分裂的位點(diǎn)一般在β片層之間的Loop區(qū)， 從不同區(qū)域斷裂的內(nèi)含肽具有不同的特性， 能夠豐富分裂內(nèi)含肽的應(yīng)用場(chǎng)景， 因此研究者也根據(jù)分裂內(nèi)含肽的分裂位點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行歸納.
分裂內(nèi)含肽催化的剪接反應(yīng)過程涉及多步關(guān)鍵的�；D(zhuǎn)移反應(yīng)， 關(guān)鍵氨基酸殘基在這些酰基轉(zhuǎn)移過程中形成硫酯或者氧酯中間體， 對(duì)反應(yīng)性質(zhì)產(chǎn)生顯著影響. 一般而言， 硫酯中間體穩(wěn)定性較差， 在體外應(yīng)用中經(jīng)常觀察到中間體硫酯鍵水解導(dǎo)致的副產(chǎn)物， 而采用氧酯中間體的分裂內(nèi)含肽則反應(yīng)速率較慢. 因此研究者根據(jù)分裂內(nèi)含肽1位和C端外顯肽+1位的氨基酸， 將其分為CC和CS（T）兩類. CC類分裂內(nèi)含肽（如Ssp DnaE及Sce VMA等）1位和C端外顯肽+1位的氨基酸均為半胱氨酸， 反應(yīng)經(jīng)歷2個(gè)硫酯中間體過程. CS（T）類分裂內(nèi)含肽（如Ssp DnaB， gp41等）1位為半胱氨酸， C端外顯肽+1位為絲氨酸或蘇氨酸， 反應(yīng)中經(jīng)歷1個(gè)硫酯中間體和1個(gè)氧酯中間體過程. 除此兩大類外， 還有少數(shù)分裂內(nèi)含肽在反應(yīng)中經(jīng)歷2個(gè)氧酯中間體過程， 如Neq DNA polymerase分裂內(nèi)含肽［55］.
分裂內(nèi)含肽一般分為2個(gè)片段， 2個(gè)片段非共價(jià)結(jié)合后在結(jié)構(gòu)和功能上接近于連續(xù)的內(nèi)含肽. 無論是人工分裂的內(nèi)含肽還是天然來源的分裂內(nèi)含肽， 其分裂位點(diǎn)均位于結(jié)構(gòu)上的環(huán)區(qū)（Loop）， 從而避免影響結(jié)合和剪接反應(yīng)活性. 根據(jù)分裂位點(diǎn)不同， 內(nèi)含肽可以被分為S0， S1和S11內(nèi)含肽［63］. S0內(nèi)含肽從原始內(nèi)含肽中歸巢核酸內(nèi)切區(qū)域位點(diǎn)切割， 如Ssp DnaE和Npu DnaE等. S1內(nèi)含肽從接近N端的位置切割， 如Ssp DnaB和M86 DnaB等. S11內(nèi)含肽從接近C端的位置切割， 如Ssp GyrB S11和Ssp DnaB S11等. 此外， Liu等［63］將DnaB從S1和S0位點(diǎn)分為3段， 依然保留結(jié)合及剪接功能.
2 分裂內(nèi)含肽的反應(yīng)原理
分裂內(nèi)含肽有多種可能的分裂方式， 多數(shù)分裂內(nèi)含肽分裂成一大一小2個(gè)片段， 分裂位點(diǎn)可能在靠近C端的一側(cè)， 也可能在靠近N端的一側(cè). 其中， 靠近C端的分裂被稱為經(jīng)典（Typical）分裂， 其小片段一般包括中央垂直的一組β折疊和繞平面β折疊的一部分. 靠近N端的分裂被稱為非經(jīng)典（Atypical）分裂， 其小片段一般包括中央垂直的loop和平面一側(cè)ββα motif的一部分. 此外， Liu等［63］通過人工篩選Ssp DnaB可能的分裂位點(diǎn)， 實(shí)現(xiàn)了3段分裂內(nèi)含肽的剪切反應(yīng). 已經(jīng)在Npu DnaE上實(shí)現(xiàn)類似的3片段分裂內(nèi)含肽剪切反應(yīng)， 說明通過改造得到多于2片段的分裂內(nèi)含肽是可能的［圖4（B）和（C）］.
分裂內(nèi)含肽需要各組分結(jié)合后才能折疊成正確的構(gòu)象. 2013年， Muir等［66］通過核磁共振波譜（NMR）觀測(cè)了溶液中Npu DnaE分裂內(nèi)含肽結(jié)合前后的構(gòu)象， 發(fā)現(xiàn)分裂內(nèi)含肽片段結(jié)合前， 小片段處于無序狀態(tài)， 大片段處于構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化的狀態(tài). 兩片段的相互作用誘導(dǎo)小片段從無序結(jié)構(gòu)折疊為穩(wěn)定構(gòu)象， 并誘導(dǎo)大片段形成更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu). 類似的NMR信號(hào)特征也在Ssp DnaE和Cat兩種分裂內(nèi)含肽上被驗(yàn)證［67，68］. 2018年， Ribó等［64］解析了Neq B-type DNA polymerase1（Neq Pol1） N端大片段和兩片段復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)， 發(fā)現(xiàn)IntC單獨(dú)存在的結(jié)構(gòu)與形成復(fù)合物后的結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)別. 這些結(jié)果說明分裂內(nèi)含肽各組分無法獨(dú)立穩(wěn)定折疊成正確的構(gòu)象.
第二步， C-端外顯肽的Cys側(cè)鏈巰基進(jìn)攻N-端外顯肽與N-端內(nèi)含肽之間的硫酯鍵， 通過硫酯交換使兩段外顯肽通過硫酯鍵相連， 從線性硫酯中間體轉(zhuǎn)化為支鏈硫酯中間體. QM/MM計(jì)算結(jié)果表明， F-Block Asp在此過程中同樣起到堿催化的作用， 促進(jìn)了C-端外顯肽的Cys的去質(zhì)子化. 點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)表明， 將這個(gè)Asp突變?yōu)镚lu， Asn， Ala或Gly都會(huì)顯著抑制支鏈中間體的形成［圖7（B）］［76］.
第三步， C-端內(nèi)含肽的C-端Asn側(cè)鏈酰胺進(jìn)攻C-端內(nèi)含肽與C-端外顯肽之間連接的酰胺鍵， 形成二酰亞胺五元環(huán)， 內(nèi)含肽與外顯肽脫離. F-Block和G-Block中的2個(gè)His起到了催化作用. 其中， F-Block His促進(jìn)了C-端Asn側(cè)鏈酰胺的去質(zhì)子化， 起到堿催化作用. 質(zhì)子化后的G-Block His與酰胺鍵羰基氧相互作用， 起到了增強(qiáng)羰基親電性的酸催化作用. 上述相互作用在Ssp DnaB的晶體結(jié)構(gòu)中得到了觀測(cè)［77］， 也得到了計(jì)算結(jié)果的支持［78］. 此外， Muir等［79］發(fā)現(xiàn)對(duì)于Npu DnaE內(nèi)含肽， 在無法形成支鏈中間體的C1A突變體中， Asn環(huán)化速率會(huì)降低至突變前的1/200， 說明支鏈中間體的形成促進(jìn)了Asn的環(huán)化［圖7（C）］.
最后， 在內(nèi)含肽從體系中脫離后， 兩段外顯肽間的硫酯鍵通過S-N酰基遷移形成天然肽鍵， 進(jìn)而得到剪切產(chǎn)物. 該過程不需要其它輔助， 在中性條件下能夠自發(fā)進(jìn)行［80］.
在一些分裂內(nèi)含肽中， 上述機(jī)理中的Cys被Ser和Thr替代， 反應(yīng)過程中形成相應(yīng)的氧酯中間體 （表1和表2）. 此外， 部分內(nèi)含肽第一步剪切的親核氨基酸位于內(nèi)含肽內(nèi)部而不是N端， Mootz等［58］報(bào)道了第一個(gè)遵循這種機(jī)理的天然分裂內(nèi)含肽NrdHF， NrdHF參與第一步N-S�；w移的Cys位于IntC序列的中間部位.
除了內(nèi)含肽序列內(nèi)部氨基酸的催化作用， 分裂內(nèi)含肽還表現(xiàn)出對(duì)外顯肽序列的敏感性：靠近剪接位點(diǎn)的外顯氨基酸突變對(duì)反應(yīng)效率和產(chǎn)率有明顯影響， 暗示外顯序列可能與關(guān)鍵氨基酸存在相互作用. Muir等［81］將Npu*內(nèi)含肽（Ssp DnaE-N和Npu DnaE-C的組合）C-端外顯肽從天然的CFN改為SGV， 發(fā)現(xiàn)C端剪接效率明顯下降. 通過定向進(jìn)化， 得到了可以更有效剪接SGV作為C-端外顯肽的mNpu*， 其中包括F-Block D124Y突變. 晶體結(jié)構(gòu)研究顯示， C端外顯肽CFN中的Phe與促進(jìn)Asn環(huán)化的F-Block His125存在π-π堆疊作用， 使His125處于有利于催化的取向， 而D124Y突變使Tyr代替了Phe的作用， 從而減輕了分裂內(nèi)含肽對(duì)C-端外顯肽的敏感性. Mootz等［82］發(fā)現(xiàn)將Ssp DnaB N-端外顯肽的Gly改變?yōu)長-Ala會(huì)導(dǎo)致剪接效率明顯下降， 而改變?yōu)镈-Ala的效率下降幅度較小. 通過觀察晶體結(jié)構(gòu)， 認(rèn)為N-外顯肽的氨基酸側(cè)鏈可能與B-Block His側(cè)鏈產(chǎn)生位阻沖突， 干擾His的催化功能， 而其它朝向的側(cè)鏈（如D-Ala）產(chǎn)生的位阻沖突較小. 這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明外顯肽與內(nèi)含肽之間存在互作， 可能是外顯序列敏感性的重要原因.
3 分裂內(nèi)含肽的工程化改造與性能優(yōu)化
分裂內(nèi)含肽已經(jīng)成為一種廣泛應(yīng)用的蛋白質(zhì)連接工具， 但在其應(yīng)用過程中依然存在一些挑戰(zhàn)， 因此研究者希望能獲得具有更優(yōu)性能的內(nèi)含肽， 包括剪切活性和穩(wěn)定性高、 對(duì)外顯肽剪接位點(diǎn)附近氨基酸序列的耐受性強(qiáng)， 不同分裂內(nèi)含肽間的反應(yīng)正交， 分裂內(nèi)含肽序列短， C-端或N-端長度在固相合成范圍內(nèi)等. 為獲得具有上述特性的分裂內(nèi)含肽， 研究者們進(jìn)行了廣泛的探究與嘗試.
2016年， Muir等［83］使用理性設(shè)計(jì)方法獲得了具有強(qiáng)穩(wěn)定性和高剪切活性的分裂內(nèi)含肽. 通過分析DnaE家族的Npu（快）和Ssp（慢）分裂內(nèi)含肽之間剪接效率的差異發(fā)現(xiàn)， 大多數(shù)關(guān)鍵殘基在空間結(jié)構(gòu)上與活性位點(diǎn)直接鄰近. 以這些關(guān)鍵氨基酸殘基作為對(duì)齊位點(diǎn)， 對(duì)73個(gè)DnaE家族的內(nèi)含肽進(jìn)行比對(duì)， 最終得到了一個(gè)新型分裂內(nèi)含肽Cfa. Cfa顯示出快速的蛋白質(zhì)剪接活性以及高的熱穩(wěn)定性和變性穩(wěn)定性. 在30 ℃下， Cfa的剪切速率比此前報(bào)道的DnaE家族中最快的Npu DnaE快2.5倍， 其t1/2僅為20 s. 同時(shí)， Cfa對(duì)變性條件具有很強(qiáng)的耐受性， 在3~4 mol/L Gn·HCl或8 mol/L尿素等強(qiáng)變性體系中都保持良好的剪接活性， 剪接反應(yīng)平衡常數(shù)K>1×10-2 s-1.
天然斷裂的gp41-1內(nèi)含肽是目前報(bào)道的最小的分裂內(nèi)含肽之一， 具有非常高的反式剪接活性［56］， gp41-1內(nèi)含肽由88個(gè)殘基的IntN和37個(gè)殘基的IntC組成. 為了使內(nèi)含肽對(duì)外顯肽性質(zhì)的干擾更小， 人們通常希望使內(nèi)含肽盡可能小. Iwaï等［86］嘗試從gp41-1內(nèi)含肽的自然分裂位點(diǎn)處截短2個(gè)殘基， 從而獲得更小的分裂內(nèi)含肽. 然而， 這種缺失使內(nèi)含肽的蛋白質(zhì)剪接效率降低了約40%， 作者后續(xù)試圖優(yōu)化內(nèi)含肽的氨基酸序列以恢復(fù)截短的gp41-1內(nèi)含肽的剪接活性到原有水平， 但沒有成功. 這表明gp41-1內(nèi)含肽的大小可能已達(dá)到實(shí)現(xiàn)功能的最小值.
2014年， Mootz等［59］從宏基因組數(shù)據(jù)中鑒定并表征了新的分裂內(nèi)含肽AceL-TerL. 這是首次發(fā)現(xiàn)存在天然非典型分裂的內(nèi)含肽. 只有25個(gè)氨基酸的N端片段是迄今為止最短的天然IntN片段， 易于通過固相合成獲取. 在8 ℃的低溫下， 該內(nèi)含肽具有最高達(dá)90%的蛋白質(zhì)反式剪接效率. 作者通過定向蛋白質(zhì)進(jìn)化選擇了進(jìn)一步改進(jìn)的突變體. 工程化的內(nèi)含肽突變體在37 ℃下具有更高的剪接效率， 反應(yīng)速率常數(shù)k>1.8×10-3 s-1， 并在化學(xué)標(biāo)記多種蛋白質(zhì)應(yīng)用中展現(xiàn)出天然序列最高50倍的效率.
4 分裂內(nèi)含肽在蛋白質(zhì)離體與在體合成中的應(yīng)用
通過PTS完成半合成的目標(biāo)蛋白（POI）將被拆分為N端（POIN）與C端（POIC）2個(gè)前體片段， 其作為外顯肽分別與相應(yīng)的分裂內(nèi)含肽片段相連接， 由此組成的融合體片段分別都可以在PTS反應(yīng)之前單獨(dú)制備并將所需的修飾引入相應(yīng)的片段中. 由于許多經(jīng)過優(yōu)化的分裂內(nèi)含肽片段較小， 故含有較小分裂內(nèi)含肽片段的目標(biāo)蛋白前體片段（POIN⁃IntN或 IntC⁃POIC）可通過固相多肽合成獲得， 從而可以容易地將修飾基團(tuán)選擇性引入目標(biāo)蛋白的N-端或C-端.
Liu等［93］報(bào)道了一種新型工程化S11 Ssp GyrB分裂內(nèi)含肽. 其分裂位點(diǎn)在C-端附近， 產(chǎn)生長度約150個(gè)氨基酸殘基的IntN片段和長度僅為6個(gè)氨基酸殘基的IntC片段， 可用于將合成肽連接到表達(dá)蛋白的C端［圖14（B）］［94］. 這些新穎的包含非常短的N端或C端片段的分裂內(nèi)含肽顯著擴(kuò)展了其在蛋白質(zhì)半合成中的應(yīng)用， 使得將修飾基團(tuán)添加到目標(biāo)蛋白的N端或C端更加方便.
利用分裂內(nèi)含肽還可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的位點(diǎn)選擇性修飾. 為了克服對(duì)含有多個(gè)半胱氨酸的目標(biāo)蛋白難以實(shí)現(xiàn)選擇性修飾的限制， 即在其中一個(gè)特定半胱氨酸位點(diǎn)的側(cè)鏈巰基引入修飾而不影響其余半胱氨酸殘基， Mootz等［13］將半胱氨酸修飾與PTS結(jié)合使用. 具體來說， 人工分裂的Ssp DnaB和Mxe GyrA的IntC片段的外顯肽+1位點(diǎn)分別由絲氨酸或蘇氨酸而非半胱氨酸來介導(dǎo)PTS. 將這些分裂內(nèi)含肽片段與具有單個(gè)半胱氨酸的短肽序列（稱為CysTag）融合表達(dá)， 在該片段中引入熒光團(tuán)、 生物素及聚乙二醇（PEG）等修飾后， 經(jīng)PTS獲得全長的目標(biāo)蛋白. 該方法實(shí)現(xiàn)了在含有多個(gè)半胱氨酸的目標(biāo)蛋白， 如硫氧還蛋白［13］、 β-內(nèi)酰胺酶［13］、 人生長激素和非核糖體肽合成酶TycA［95］等蛋白質(zhì)中的單一半胱氨酸位點(diǎn)的選擇性修飾.
近期， Pless等［96］將該策略應(yīng)用于體內(nèi)蛋白質(zhì)修飾， 允許將多種修飾（包括磷酸化、 乙�；M物和非天然氨基酸等）同時(shí)引入活的真核細(xì)胞中. 通過體內(nèi)tPTS策略， 在NaV1.5離子通道的胞內(nèi)域和P2X2受體的胞外域中引入了修飾， 研究了翻譯后修飾在離子通道功能以及受體與配體結(jié)合中的作用. 正交分裂內(nèi)含肽介導(dǎo)的串聯(lián)蛋白反式剪接在體外和體內(nèi)的蛋白多片段剪接都展現(xiàn)了良好的效果， 有望在蛋白質(zhì)半合成中得到更多的應(yīng)用.
在目標(biāo)蛋白質(zhì)中引入具有NMR效應(yīng)的15N及13C等重原子核的同位素標(biāo)記可看作是上述通過PTS將化學(xué)修飾引入蛋白質(zhì)的一個(gè)具體例子， 這一技術(shù)最重要的應(yīng)用是用于核磁共振波譜研究來表征蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué). 然而對(duì)于較大蛋白質(zhì)來說， 全長同位素標(biāo)記的樣品中顯著的峰重疊使得核磁共振譜的解析變得困難.
盡管最初標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)僅有約9000 Da， 但該系統(tǒng)后來成功地用于制備分段同位素標(biāo)記的麥芽糖結(jié)合蛋白（42000 Da）［97］及F0F1ATP酶β亞基（52000 Da）［98］， 證明了通過分裂內(nèi)含肽實(shí)現(xiàn)的分段同位素標(biāo)記可用于更大目標(biāo)蛋白質(zhì)的NMR結(jié)構(gòu)分析.
Iwaï等［12］開發(fā)了一種通過三片段蛋白質(zhì)剪接來實(shí)現(xiàn)片段同位素標(biāo)記的新策略. 利用具有相同序列但分裂位點(diǎn)不同的NpuDnaE工程化分裂內(nèi)含肽， 對(duì)來自Lyngbya majuscula的Curacin A（CurA）蛋白通過三片段蛋白剪接來實(shí)現(xiàn)部分片段同位素標(biāo)記. 該蛋白包含3個(gè)順序的酰基載體蛋白（ACP）結(jié)構(gòu)域. 這 3個(gè)結(jié)構(gòu)域之間高度的序列同一性（93%~100%）導(dǎo)致其所有3個(gè)結(jié)構(gòu)域均被同位素標(biāo)記的樣品的NMR信號(hào)嚴(yán)重重疊. 因此， 選擇性地對(duì)該三結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的中心結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了同位素標(biāo)記， 通過分裂內(nèi)含肽介導(dǎo)的PTS， 以約40%的收率獲取了用于NMR分析的部分片段同位素標(biāo)記的全長CurA蛋白. 該方法將部分片段同位素標(biāo)記策略在核磁共振研究中的應(yīng)用拓展到了多結(jié)構(gòu)域蛋白中的結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域相互作用研究.
Iwaï等［99］還開發(fā)了將同位素標(biāo)記的片段與未標(biāo)記的片段在同一細(xì)菌培養(yǎng)物中一次生成， 隨后直接發(fā)生剪接反應(yīng)來體內(nèi)獲取分段同位素標(biāo)記的全長蛋白的策略. 其基本原理是在單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過程中的不同時(shí)間表達(dá)含分裂內(nèi)含肽的蛋白片段前體， 并在各個(gè)表達(dá)步驟之間更換未標(biāo)記或同位素標(biāo)記條件的培養(yǎng)基. 這樣， 只有一種前體蛋白片段是被同位素標(biāo)記的， 剪接反應(yīng)后得到的即是只有一個(gè)片段被同位素標(biāo)記的目標(biāo)蛋白， 實(shí)現(xiàn)了分段同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)的直接體內(nèi)獲�。�98］.
為此， Benkovic等［2］開發(fā)了分裂內(nèi)含肽介導(dǎo)的多肽和蛋白質(zhì)環(huán)狀連接（SICLOPPS）技術(shù). 這項(xiàng)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的環(huán)肽文庫構(gòu)建， 并結(jié)合功能篩選， 得到了許多具有生物活性的環(huán)肽， 如酪氨酸酶抑制劑pseudostellarin F［2］及甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑等［100］.
為了開發(fā)可以調(diào)控蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的環(huán)肽分子， Benkovic等［103］整合了SICLOPPS與反向雙雜交系統(tǒng)（RTHS）2種技術(shù). 在宿主細(xì)胞中經(jīng)SICLOPPS技術(shù)產(chǎn)生的環(huán)肽文庫通過RTHS系統(tǒng)直接進(jìn)行篩選， 鑒定出了調(diào)節(jié)FKBP12-雷帕霉素-FRAP相互作用和HIV-1蛋白酶和核糖核苷酸還原酶相互作用的環(huán)肽分子， 展示了SICLOPPS技術(shù)構(gòu)建環(huán)肽文庫并用于獲取可調(diào)控蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的環(huán)肽的潛力.
另外， 研究者們還開發(fā)了將分裂內(nèi)含肽與連續(xù)內(nèi)含肽聯(lián)用來構(gòu)建環(huán)肽的方法［104］， 以及通過PTS形成肽鍵完成肽環(huán)化后， 再利用半胱氨酸殘基形成大環(huán)肽內(nèi)部的二硫鍵來構(gòu)建雙環(huán)肽產(chǎn)物的策略［105］， 這體現(xiàn)了分裂內(nèi)含肽相關(guān)方法用于構(gòu)建環(huán)肽類分子的良好效果及廣泛應(yīng)用.
基于分裂內(nèi)含肽的多肽環(huán)化還可與其他新興篩選技術(shù)結(jié)合， Park等［106］開發(fā)了一種稱為CWCPS（Custom-designed warhead-armed cyclic peptide screening）的策略， 將可與靶蛋白活性位點(diǎn)結(jié)合的彈頭化學(xué)基團(tuán)引入由分裂內(nèi)含肽介導(dǎo)的PTS生成的環(huán)肽抑制劑， 再通過酵母雙雜交進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)篩選. 構(gòu)象穩(wěn)定的環(huán)肽中的彈頭化學(xué)基團(tuán)與活性位點(diǎn)結(jié)合后的的解離更慢， 親和力顯著增強(qiáng). 通過該方法發(fā)現(xiàn)了一種針對(duì)癌癥靶點(diǎn)HDAC8有效的抑制劑CY5-6Q， 其表現(xiàn)出很強(qiáng)的結(jié)合親和力（KD=15.1 nmol/L）和抑制作用（IC50=0.61 μmol/L）. 這表明基于分裂內(nèi)含肽的方法是細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建環(huán)肽的一個(gè)相對(duì)穩(wěn)健的策略， 在有前途的環(huán)肽藥物前體的發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮作用.
5 總結(jié)與展望
經(jīng)過研究者的持續(xù)探索， 分裂內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)反式剪接已經(jīng)由一種有趣的蛋白質(zhì)翻譯后現(xiàn)象發(fā)展成為一種應(yīng)用廣泛的高效連接方法. 對(duì)蛋白質(zhì)反式剪接的化學(xué)過程的解析， 使人們更好地理解分裂內(nèi)含肽結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系. 快速反式剪接分裂內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)、 內(nèi)含肽的序列進(jìn)化、 內(nèi)含肽無痕剪接策略的開發(fā)、 正交內(nèi)含肽庫的建立等， 都大大改進(jìn)了基于內(nèi)含肽的連接技術(shù)， 使其成為日漸成熟的蛋白質(zhì)連接工具， 分裂內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)反式剪接技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)蓬勃發(fā)展. 分裂內(nèi)含肽系統(tǒng)促進(jìn)了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展， 特別是核磁共振波譜結(jié)構(gòu)解析中的應(yīng)用；分裂內(nèi)含肽系統(tǒng)也促進(jìn)了合成或半合成更大、 更復(fù)雜、 帶有多種修飾的蛋白質(zhì)；此外， 基于分裂內(nèi)含肽技術(shù)的環(huán)狀肽庫也已成為藥物發(fā)現(xiàn)的有效策略.
然而， 人們也必須認(rèn)識(shí)到目前對(duì)分裂內(nèi)含肽的理解和研究尚不完善. 雖然對(duì)于分裂內(nèi)含肽結(jié)合以及后續(xù)反應(yīng)過程已經(jīng)進(jìn)行了研究， 但是對(duì)于反應(yīng)過程中更細(xì)致的結(jié)構(gòu)變構(gòu)與催化功能變化的分析還比較粗糙. 更好地理解硫酯交換過程中2個(gè)巰基如何靠近， 支鏈硫酯如何對(duì)天冬酰胺環(huán)化過程產(chǎn)生促進(jìn)， 都有助于更好地協(xié)調(diào)剪接反應(yīng)的各個(gè)步驟的動(dòng)力學(xué)， 從而提高整體的連接效率， 避免C-端或N-端水解副產(chǎn)物的出現(xiàn). 此外， 目前對(duì)分裂內(nèi)含肽在強(qiáng)變性、 高溫、 氧化性等條件下的穩(wěn)健性研究尚不充足， 可能在與其它化學(xué)反應(yīng)聯(lián)用時(shí)帶來不確定性.
隨著更多的微生物基因組被測(cè)序， 分裂內(nèi)含肽的數(shù)量將迅速增長， 未來有望發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特性質(zhì)（例如能夠耐受高溫、 高鹽等極端條件）的新型分裂內(nèi)含肽， 豐富人類對(duì)分裂內(nèi)含肽的認(rèn)識(shí)， 揭示現(xiàn)今尚未認(rèn)識(shí)到的潛力， 為分裂內(nèi)含肽技術(shù)的發(fā)展帶來新的機(jī)遇， 并最終獲得通用型內(nèi)含肽， 能夠?qū)θ魏瓮怙@肽序列均具有剪快速接動(dòng)力學(xué)， 產(chǎn)率高， 分裂片段易于通過化學(xué)合成技術(shù)獲取， 且連接活性易于通過外源刺激控制等.
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