缺乏有效的神經(jīng)退行性疾病 (ND) 治療方法是當(dāng)前的一個重要問題。脂質(zhì)納米顆�？梢赃f送創(chuàng)新的活性分子組合，以靶向神經(jīng)退行性疾病的各種機制。將藥物遞送到大腦進行 ND 治療的一個重大挑戰(zhàn)與血腦屏障有關(guān)，這限制了傳統(tǒng)藥物給藥的有效性。當(dāng)前利用脂質(zhì)納米顆粒和細(xì)胞穿透肽的策略具有各種吸收機制的特點，有可能延長封裝藥物的停留時間和生物利用度。此外，可以遞送具有神經(jīng)營養(yǎng)或神經(jīng)保護特性的生物活性分子，以潛在地介導(dǎo) ND 靶向途徑，例如神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、脂質(zhì)代謝受損、線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、錯誤折疊蛋白質(zhì)或肽片段的積累、有毒蛋白質(zhì)聚集體、氧化應(yīng)激損傷和神經(jīng)炎癥。本綜述討論了脂質(zhì)納米顆粒和 CPP 的最新進展，以期將這兩種方法整合到納米醫(yī)學(xué)開發(fā)和用于神經(jīng)退行性疾病腦部輸送的雙靶向納米顆粒系統(tǒng)中。
1. 簡介
中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 相關(guān)疾病被稱為神經(jīng)退行性疾病 (ND)，主要包括阿爾茨海默病 (AD)、帕金森病 (PD) 和亨廷頓病 (HD) [ 1 , 2 ]。盡管全球約有 15 億人患有 CNS 相關(guān)疾病，但現(xiàn)有的 ND 治療方法主要只是緩解癥狀，而不能治愈潛在的疾病過程 [ 2 ]。治療 ND 的挑戰(zhàn)不僅僅歸因于所涉及的多種致病因素。血腦屏障 (BBB) 的低通透性是另一個重大障礙，它限制了治療藥物進入 CNS [ 3 , 4 , 5 , 6 ,7 ]。
一些最新的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物輸送創(chuàng)新包括：(i) 使用納米技術(shù)設(shè)計納米顆粒或納米載體，(ii) 創(chuàng)建受體介導(dǎo)的運輸系統(tǒng)，(iii) 研究特洛伊木馬模擬物以穿過血腦屏障，(iv) 使用鼻腔內(nèi)的納米顆粒進行鼻內(nèi)輸送，(v) 利用鞘內(nèi)或腦室內(nèi)途徑將藥物直接輸送到腦脊液中，以及 (vi) 使用聚焦超聲暫時破壞血腦屏障。這些有針對性的方法旨在提供傳統(tǒng)藥物輸送的替代方案，可能實現(xiàn)更有效的治療，同時最大限度地減少對中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護屏障的侵入性破壞。
本文旨在簡要回顧基于 CPP 和納米技術(shù)的策略，這些策略促進藥物在 BBB 中的運輸，CPP 介導(dǎo)的細(xì)胞吸收藥物和其他生物分子的可能機制，以及它們在納米醫(yī)學(xué)中的潛在治療用途。此外，還指出了將脂質(zhì)納米顆粒和 CPP 結(jié)合起來以提高納米藥物制劑的功效的優(yōu)勢。我們重點介紹了中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向遞送系統(tǒng)的一些最新進展，特別是液晶脂質(zhì)納米顆粒和 CPP 在腦遞送中的應(yīng)用以及生物分子（生物活性肽、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)）在預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的治療用途。在 CPP 中，我們特別感興趣的是 PACAP（垂體腺苷酸環(huán)化酶活化多肽），因其神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用而聞名。
圖 1顯示了中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管橫截面的電子顯微照片，圖中顯示了由不同細(xì)胞類型構(gòu)成的 BBB 超微結(jié)構(gòu)：神經(jīng)細(xì)胞、支持細(xì)胞（如星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞）和腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 (BCEC) [ 6 , 8 ]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種重要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其細(xì)胞突起延伸至包裹血管、神經(jīng)元突觸和郎飛氏結(jié) [ 11 ]。除星形膠質(zhì)細(xì)胞外，小膠質(zhì)細(xì)胞也在介導(dǎo)這一屏障部位的免疫和神經(jīng)炎癥方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用 [ 3]。過度炎癥、氧化應(yīng)激、血腦屏障破壞、神經(jīng)元損傷和血管功能障礙都可能由小膠質(zhì)細(xì)胞活化失調(diào)引起[ 4、5、6、7 ] 。神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（如星形膠質(zhì)細(xì)胞）和血管細(xì)胞（包括內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞）共同組成神經(jīng)血管單元（圖1 b）。神經(jīng)血管單元的一個重要作用是協(xié)調(diào)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的信號，精細(xì)調(diào)節(jié)腦血流，確保大腦獲得充足的氧氣和營養(yǎng)[ 14]。神經(jīng)血管單元內(nèi)的功能障礙與一系列神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，包括 AD、中風(fēng)和創(chuàng)傷性腦損傷 [ 15 ]。血管細(xì)胞在 BBB 中起著關(guān)鍵作用，因為它們直接與血流交界。BCEC 是神經(jīng)血管單元中的重要血管細(xì)胞，它們在相鄰的內(nèi)皮細(xì)胞之間具有緊密連接，并顯著限制溶質(zhì)的旁細(xì)胞通量 [ 3 ]。血管被兩層基底膜 (BM) 包裹，即內(nèi)層血管 BM 和外層實質(zhì) BM，也稱為血管周圍膠質(zhì)限制層 [ 5]。血管 BM 是由內(nèi)皮細(xì)胞 (EC) 和周細(xì)胞 (PC) 分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，而實質(zhì) BM 主要由延伸至血管系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞突起產(chǎn)生 [ 8 ]。這些特殊的內(nèi)皮細(xì)胞形成中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管壁，并創(chuàng)建具有不同管腔和管腔外膜區(qū)室的極化界面。這使得能夠精確控制血液和大腦之間物質(zhì)的運輸 [ 4 ]。一方面，這些內(nèi)皮細(xì)胞主動調(diào)節(jié)某些物質(zhì)進出大腦，另一方面，它們創(chuàng)建選擇性滲透屏障來保護大腦。這種二元性為向中樞神經(jīng)系統(tǒng)輸送藥物提供了機會。
1.2. 使用細(xì)胞穿透肽和脂質(zhì)基納米載體克服血腦屏障挑戰(zhàn)的策略
在保持血腦屏障完整性的范圍內(nèi)，人們積極研究如何有效地將治療藥物輸送到血腦屏障[ 16、17、18、19、20、21 ]。20世紀(jì)90 年代初，人們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 (TfR) 在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞界面高表達[ 13隨后，在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞界面發(fā)現(xiàn)了幾種受體和轉(zhuǎn)運蛋白，包括胰島素受體 (IR)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 1 (LRP1) 和各種氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白。這些蛋白質(zhì)也被用于受體介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運策略，以實現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向 [ 7,12 ] 。例如，Johnsen 等人研究了免疫脂質(zhì)體與血腦屏障腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，并表明靶向轉(zhuǎn)鐵蛋白受體可增強藥物向大鼠腦內(nèi)的轉(zhuǎn)運 [ 22 ]。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，促進細(xì)胞攝取各種分子的肽被稱為細(xì)胞穿透肽 (CPP) [23，24，25，26，27，28，29，30 ] 。
在 CPP 中，垂體腺苷酸環(huán)化酶活化多肽 (PACAP) 是一種能夠通過位于內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)-6 (PTS-6) 穿越血腦屏障的神經(jīng)肽 [ 31 ]。越來越多的證據(jù)凸顯了 PACAP 的重要性，因為它能夠進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并且具有強大的神經(jīng)保護和神經(jīng)營養(yǎng)特性 [ 32 ]。PACAP 已顯示出顯著的神經(jīng)保護作用和對抗病理狀態(tài)的各種有益作用 [ 33 , 34 ]。對 PACAP 等生物活性肽的探索，對于穿越血腦屏障具有很大的希望，并代表了治療神經(jīng)退行性疾病的潛在策略 [ 35 , 36 , 37 ,38，39，40，41，42 ] 。
據(jù)我們所知，盡管基于 CPP 的遞送系統(tǒng)的臨床試驗數(shù)量不斷增加[ 43、44、45 ] ，但尚未有任何 CPP 或 CPP/貨物組合獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 的批準(zhǔn)。關(guān)于 CPP 的免疫原性、穩(wěn)定性、特異性和毒性的了解仍然有限。親水分子和難溶性藥物的傳統(tǒng)口服給藥途徑的一個主要問題是其生物利用度低。生物活性肽和蛋白質(zhì)對于口服給藥來說非常具有挑戰(zhàn)性。一種預(yù)期的策略是使用替代給藥途徑或納米顆粒載體來保護此類治療劑免于酶降解[ 46、47、48 ]。在此背景下，應(yīng)用基于納米技術(shù)的方法已成為一種有前途的策略，既可以增強藥物對大腦的靶向性，也可以增強載多種藥物的納米載體（親水性或疏水性）的遞送[ 17,49,50 ]。
脂質(zhì)基納米載體已用于制造高效且成功的抗 COVID-19 疫苗，引起了廣泛關(guān)注 [ 51、52、53、54、55、56、57、58 ] 。此類納米顆�？纱龠M藥物穿過血腦屏障，并能夠有效輸送治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物[ 59、60、61、62、63 ]功能化納米粒子具有延長治療藥物在血腦屏障停留時間、增強藥物滲透性等優(yōu)勢 [ 9、20、21、22、23 ] 。此外，利用脂質(zhì)納米載體進行主動靶向治療，可實現(xiàn)腦內(nèi)給藥 [ 64、65、66、67、68、69、70 ] 。主動靶向治療包括將配體附著到納米系統(tǒng)或CPP表面[ 10、12 ]。] 以促進與 BBB 中組成性表達的蛋白質(zhì)相互作用，例如低密度脂蛋白受體 [ 71 , 72 ]、轉(zhuǎn)鐵蛋白 (Tfr) [ 73 ] 和胰島素受體 [ 49 , 50 , 74 ]。除了受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運、肽介導(dǎo)的遞送 (CPPs) [ 75 , 76 , 77 , 78 , 79 ] 和基于納米技術(shù)的策略 [ 46 , 47 , 48 ]，已經(jīng)研究了許多用于增強藥物跨 BBB 滲透性的策略。這些包括藥物的化學(xué)修飾 [80 ]、滲透壓阻斷[ 81 ]、腦內(nèi)植入[ 82 ]和鼻內(nèi)給藥[ 83 ]。
2. 細(xì)胞穿透肽和血腦屏障穿梭肽在中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療中的應(yīng)用
2.1. CPP 類型
CPP 是長度可變的氨基酸序列（在 4-50 個氨基酸范圍內(nèi)），具有出色的穿過細(xì)胞膜和生物屏障的能力 [ 84、85、86 ]。在細(xì)胞模型中，Green 等人展示了合成的轉(zhuǎn)錄激活因子 ( TAT ) 肽（其氨基酸序列源自 HIV-1 蛋白（Tat 47-57：YGRKKRRQRRR））穿透細(xì)胞膜的能力 [ 87 ] 。TAT是第一個被鑒定的 CPP。CPP 的重要優(yōu)勢在于其跨脂質(zhì)膜的高轉(zhuǎn)運能力以及低細(xì)胞毒性和免疫原性[ 24、25 ]]。這些肽可以促進細(xì)胞吸收和遞送貨物，如肽、siRNA、DNA質(zhì)粒、熒光化合物和納米顆粒進入細(xì)胞。人們已經(jīng)探索了使用CPP的各種藥物遞送策略來治療一系列疾病，特別是神經(jīng)退行性疾病[ 26 ]。與治療ND的替代方法（例如滲透破壞或腦內(nèi)植入）相比，CPP提供了一種非破壞性的細(xì)胞內(nèi)遞送方法，不會破壞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)[ 27,28 ]。
根據(jù) CPP 的物理化學(xué)性質(zhì)、來源或序列類型對其進行分類。根據(jù)物理化學(xué)性質(zhì)，CPP 可分為三個亞類：陽離子肽、兩親肽和疏水性肽。陽離子 CPP 是最常見的 CPP 類型。它們在生理 pH 下帶高正電荷。一般而言，陽離子 CPP 含有許多陽離子氨基酸，例如精氨酸 (R) 和賴氨酸 (K)。例如，TAT 肽是一種典型的陽離子 CPP [ 29 ]。盡管能夠穿過細(xì)胞屏障的 TAT 氨基酸序列仍不清楚，但研究表明，帶電殘基（如精氨酸）在跨膜轉(zhuǎn)運的效率中起著重要作用 [ 30]]。CPPs的另一個特點是帶正電荷的CPPs可以與帶負(fù)電荷的分子（如生物膜的磷脂）發(fā)生靜電相互作用[ 88 ] 。因此，CPPs的正電荷可提高細(xì)胞的攝取效率。然而，CPP序列正電荷的過度增加可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性增加，體外和體內(nèi)研究均證實了這一點[ 89,90 ]。Qian等強調(diào)富含精氨酸的CPPs具有嚴(yán)重的毒性。作者通過小鼠靜脈注射測試了TAT及其結(jié)合物的毒性[ 91 ]。TAT的LD50值為27.244mg·kg −1，屬于劇毒化學(xué)物質(zhì)。值得注意的是，毒性隨著TAT結(jié)合復(fù)合物中TAT的質(zhì)量比增加而增大。相比之下，不含任何精氨酸殘基的十一肽衍生物的毒性比TAT或寡精氨酸CPP低得多。這一結(jié)果表明陽離子CPP的毒性與精氨酸殘基的數(shù)量之間存在潛在聯(lián)系。然而，確切的毒性機制仍然難以捉摸。
兩親性 CPP 具有親水區(qū)和疏水區(qū)，可折疊成 α 螺旋和 β 片層狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)兩親性 CPP是否具有兩親性一級序列或在折疊時獲得兩親性，可進一步將其分為一級兩親性 CPP（例如，甘露糖-6-磷酸 (MPG)）[ 92 ] 和二級兩親性 CPP（例如，穿透素）[ 93 ] [ 94 ]。一級兩親性 CPP 僅在細(xì)胞膜存在的情況下才采用折疊構(gòu)象，而二級兩親性 CPP 則傾向于在與脂質(zhì)膜相互作用之前在溶液中形成二級結(jié)構(gòu) [ 95 ]。
與陽離子肽和兩親性肽相比，疏水性 CPP 的數(shù)量很少。這些肽通常由非極性成分組成，或包含對穿透細(xì)胞膜至關(guān)重要的特定疏水性基序。它們來自包含非極性元素的信號肽序列，如異戊烯基化肽 [ 96 ]、pepducins [ 97 ] 或 Staples [ 98 , 99 ]。疏水性 CPP 表現(xiàn)出低凈電荷和低毒性，其疏水片段在與脂質(zhì)膜相互作用中起關(guān)鍵作用 [ 100 ]。正在進行的研究旨在了解疏水性對 CPP 生物治療效果的重要性和功能性 [ 101目前的研究表明，可以利用CPPs的疏水性來預(yù)測蛋白質(zhì)貨物的活性[ 102 ]。
2.2. CPPs 增強細(xì)胞攝取
CPPs 可增強細(xì)胞對各種貨物的攝取，包括納米顆粒、蛋白質(zhì)、藥物和核酸 [ 50,79,80 ] 。將CPPs 與貨物結(jié)合起來可以通過各種方法實現(xiàn)，包括共孵育、封裝、化學(xué)結(jié)合（共價鍵合，如化學(xué)鍵）、非共價絡(luò)合和自組裝 [ 103 ]。自發(fā)現(xiàn)以來，TAT 已被廣泛用作 CPP（表 1 ）。TAT 不僅可以穿過質(zhì)膜，還可以穿過各種細(xì)胞膜，包括神經(jīng)元膜，這使得 TAT 修飾的 NPs 成為用途廣泛且有前途的細(xì)胞內(nèi)遞送工具 [ 98]] Lee 等人研究了半導(dǎo)體納米線 (NW) 器件和 TAT 共軛復(fù)合物 (TAT-NW) 是否可以內(nèi)化到原代神經(jīng)元細(xì)胞中。首先，將 NW 與 Alexa Fluor 555 標(biāo)記的鏈霉親和素 (STV) 共價連接。然后，將它們在生物素-TAT 溶液中孵育。最后，將 TAT-NW (5 μg) 與小鼠海馬神經(jīng)元在 37 °C 下孵育 20 小時。通過熒光顯微鏡檢查內(nèi)化效果（圖2）。熒光顯微鏡成像結(jié)果顯示 TAT-NW 進入神經(jīng)元細(xì)胞，而對照組中裸露的 NW 仍留在細(xì)胞外[ 104 ]。
Wen 等人的研究表明，TAT 與磁性 PLGA/脂質(zhì)納米粒子的結(jié)合可通過穿透細(xì)胞膜大大增強腦源性內(nèi)皮細(xì)胞 3 (BEnd.3 細(xì)胞) 模型中的治療分子遞送[ 105 ]。大量研究證實，TAT 結(jié)合納米粒子可有效克服 BBB，因此可有效用于實現(xiàn)腦內(nèi)藥物的治療劑量[ 106]]。此外，Tat-NR2B9c 是一種 TAT 偶聯(lián)化合物，專門針對 N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA) 受體的 N-甲基-D-天冬氨酸受體亞基 2B 亞基進行設(shè)計，作為一種潛在的神經(jīng)保護劑，表現(xiàn)出良好的效果。它于 2012 年成功完成了一項名為 ENACT（評估動脈瘤栓塞治療中的神經(jīng)保護作用）的 2 期臨床試驗（ClinicalTrials.gov 標(biāo)識符 NCT00728182）。這些臨床發(fā)現(xiàn)刺激了 CPP 偶聯(lián)藥物輸送系統(tǒng)的進一步應(yīng)用[ 107,108 ]。
Neves-Coelho 等人研究了一種名為 PepNeg 的陰離子肽（表 1），它可以有效地將綠色熒光蛋白等貨物轉(zhuǎn)運穿過血腦屏障而不會破壞血腦屏障 [ 25 ]。作者表明，PepNeg 可以通過能量依賴性和能量不依賴性的吸附介導(dǎo)轉(zhuǎn)胞吞機制來轉(zhuǎn)移血腦屏障，挑戰(zhàn)了帶負(fù)電荷的膜表面是這種肽轉(zhuǎn)移的嚴(yán)格要求這一觀點 [ 25 ]。
Alizadeh 等人發(fā)現(xiàn)，組蛋白置換 9（一種富含組氨酸的九聚精氨酸肽，表 1）可大大增強 DNA 向細(xì)胞中的遞送 [ 62 ]。與對照組相比，組蛋白置換 9 復(fù)合物可顯著增加細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)表達 [ 62 ]。這種肽介導(dǎo)的 DNA 遞送系統(tǒng)可被視為一種有前途的非共價基因轉(zhuǎn)移方法。
Ying 等人提出利用腦靶向性血管肽-2 肽（表 1）通過電響應(yīng)水凝膠納米粒子精確遞送苯妥英鈉進行抗癲癇治療。在體內(nèi)成像研究觀察到，改良的水凝膠納米粒子系統(tǒng)顯示，與對照組相比，海馬和腦干區(qū)域的血管肽-2 熒光強度更高。此外，作者在杏仁核點燃癲癇模型中評估了血管肽-2 偶聯(lián) NP 復(fù)合物的抗癲癇功效。結(jié)果證實了這種偶聯(lián)復(fù)合物具有快速、長期和準(zhǔn)確的體內(nèi)腦靶向性，最終增強了苯妥英鈉的抗癲癇效果 [ 109 ]。
穿透素是一種眾所周知的 CPP，來源于觸角足同源結(jié)構(gòu)域蛋白的第三螺旋（表 1）。Alves 等人將穿透素與促凋亡肽 Kappalactone A (KLA) 結(jié)合，后者難以穿透真核生物的質(zhì)膜，因此在哺乳動物細(xì)胞中的細(xì)胞毒性極小 [ 110 ]。進入細(xì)胞后，KLA 肽會破壞線粒體膜完整性，并通過細(xì)胞凋亡啟動程序性細(xì)胞死亡。為了增強 KLA 肽的內(nèi)化，作者最初證實 KLA-Pen 結(jié)合物對來自不同組織的多種人類癌細(xì)胞系表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，包括對某些傳統(tǒng)化療藥物有耐藥性的細(xì)胞 [ 110 ]。
R8 基肽含有一系列帶正電荷的精氨酸 (R) 殘基序列，由于與帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面相互作用，這些殘基具有細(xì)胞穿透特性。Ringhieri 等人證明，當(dāng)用 CCK8 和 R8 肽序列雙重功能化時，脂質(zhì)體阿霉素既可以靶向遞送至特定細(xì)胞，也可以有效內(nèi)化脂質(zhì)體藥物 [ 111 ]。Chen 等人通過體外研究表明，c(RGDfK) 和肽-22 的聯(lián)合作用顯著增強了 U87 細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取。隨后的體內(nèi)成像證實，與用單一配體修飾的脂質(zhì)體相比，c(RGDfK)/Pep-22-LP 脂質(zhì)體在腦腫瘤內(nèi)的分布更廣泛 [ 112 ]。
CPP 還可用于 DNA 疫苗的遞送。Saleh 等人使用了一種基于 MPG 的基因遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)與核酸形成穩(wěn)定的非共價 NP 復(fù)合物，適用于體外和體內(nèi)遞送 HPV16 E7 DNA。后者編碼人乳頭瘤病毒 (HPV) 16 型的模型抗原。結(jié)果令人信服地證明，MPG 有效地將質(zhì)粒 DNA 濃縮成穩(wěn)定的納米顆粒，平均尺寸范圍為 180 至 210 nm，表面帶正電。此外，發(fā)現(xiàn)基于 MPG 的納米顆粒的轉(zhuǎn)染效率與聚乙烯亞胺 (PEI) 的轉(zhuǎn)染效率相似。通過蛋白質(zhì)印跡和流式細(xì)胞術(shù)檢測到的穩(wěn)定蛋白質(zhì)表達凸顯了基于 MPG 的納米顆粒作為 DNA 疫苗制劑中有效遞送系統(tǒng)的巨大潛力 [113 ]。據(jù)報道，從α1-抗胰蛋白酶359–374衍生的合成CPP肽C105Y（表1）在活細(xì)胞中表現(xiàn)出很高的快速內(nèi)化傾向（通過不依賴網(wǎng)格蛋白和洞穴蛋白的途徑），并增強基因向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移以及隨后的基因表達[ 114 ]。膜轉(zhuǎn)運和核定位被認(rèn)為是能量獨立的，而C105Y肽向核仁的運輸則以能量依賴的方式進行。
2.3. 血腦屏障穿梭肽
血腦屏障穿梭肽是 CPP 的一個子類，可使各種貨物穿過血腦屏障，例如結(jié)合小分子、蛋白質(zhì)、納米顆�；蜻z傳物質(zhì)。1986 年，Pardridge 發(fā)現(xiàn)了能夠穿過血腦屏障的小肽，包括腦啡肽、轉(zhuǎn)鐵蛋白片段和胰島素樣生長因子。這一發(fā)現(xiàn)促使人們建議將這些肽用作腦靶向的遞送系統(tǒng) [ 12 ]。隨后，體外和體內(nèi)研究證明了一些肽的腦靶向特性。例如，PepH3 已在體內(nèi)生物分布和體外實驗中證明了其穿過血腦屏障的能力 [ 118目前，人們正在研究小肽作為將物質(zhì)從血液運輸?shù)酱竽X的潛在策略。其中，Angiopep-2 因其能有效運輸治療有效載荷（如 siRNA [ 119 ]、酶 [ 120 ] 和藥物 [ 121 ]）穿過血腦屏障而備受關(guān)注。Demeule 等人在體外血腦屏障模型和原位腦灌注中研究了一類名為 Angiopeps 的肽家族。結(jié)果表明，Angiopep-2 穿過血腦屏障的能力是由其與 LRP1 受體的相互作用介導(dǎo)的 [ 118]。此外，Drappatz 等人報道了一項由 Angiopep-2 和紫杉醇組成的制劑 (GRN1005) 用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的 I 期研究。他們指出，GRN1005 在患者中表現(xiàn)出與紫杉醇類似的毒性特征，但顯著增加了紫杉醇在腫瘤內(nèi)的積累。這說明了 Angiopep-2 有可能作為治療藥物在 BBB 中的轉(zhuǎn)運體，且毒性最小 [ 45 ]。
然而，使用血腦屏障穿梭肽仍存在一些困難。確保這些肽靶向大腦的正確部位而不影響其他區(qū)域（這可能會產(chǎn)生意想不到的影響）是一個主要問題。此外，這些肽可以穿過血腦屏障運輸?shù)奈镔|(zhì)的大小和種類也受到限制。人們還擔(dān)心這些肽在體內(nèi)的停留時間以及產(chǎn)生不良影響的可能性。這些問題表明，在這些肽廣泛應(yīng)用于納米醫(yī)學(xué)之前，還需要進行大量研究。
雖然血腦屏障穿梭肽的應(yīng)用仍然存在局限性，但結(jié)構(gòu)修飾可以改善其應(yīng)用。使用 PepH3 作為模板設(shè)計的非典型陰離子肽 PepNeg 可以有效地通過血腦屏障模型運輸貨物（高達 27 kDa），而不會破壞屏障，而 PepH3 則相反 [ 25]。Li等合成了一種名為轉(zhuǎn)錄激活因子-神經(jīng)降壓素的CPP，它能抑制膜聯(lián)蛋白A1（ANXA1）的核轉(zhuǎn)位，降低caspase-3凋亡途徑的激活，增強體外缺氧缺糖的海馬神經(jīng)元的存活率。采用單側(cè)腦室內(nèi)注射，在腦缺血動物模型中，已經(jīng)證實轉(zhuǎn)錄激活因子-神經(jīng)降壓素肽能有效遞送至缺血的海馬和皮質(zhì)[ 122]。透明質(zhì)酸修飾的肽對腦毛細(xì)血管中的人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 (TfR) 具有親和力，能夠提供轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的跨 BBB 遞送。Arranz-Gibert 等人表明，透明質(zhì)酸修飾的肽能夠?qū)?AuNP 遞送到大鼠腦中 [ 117 ]。Prades 等人證明，通過逆對映體方法修飾的肽毒性低、對蛋白酶的穩(wěn)定性更高，并提高了將藥物轉(zhuǎn)運到腦中的能力 [ 43 ]。此外，Oba 等人的研究表明，將環(huán)狀 dAA 和釘合肽添加到 R9 肽序列 (RRRRRRRRRR) 中可提高細(xì)胞穿透能力，因為 dAA 的存在可以穩(wěn)定 CPP 的螺旋二級結(jié)構(gòu) [ 123]。
2.4. 與肽介導(dǎo)的血腦屏障通過有關(guān)的肽內(nèi)化機制
CPPs 的精確內(nèi)化機制仍是一個問題，因為它取決于各種參數(shù)，例如肽序列、肽濃度、被結(jié)合的治療分子以及細(xì)胞膜的脂質(zhì)成分。因此，徹底檢查 CPPs 進入細(xì)胞的模式對于全面評估其安全性和有效性至關(guān)重要 [ 124 ]。迄今為止，兩種主要的跨膜途徑已被廣泛接受：（i）直接轉(zhuǎn)運和（ii）內(nèi)吞作用（圖 3胞吞作用是一種需要能量的主動分子運輸過程。CPPs 直接跨生物屏障轉(zhuǎn)運是一種能量獨立的機制，可以在低溫、能量耗竭和使用胞吞抑制劑等特定實驗條件下進行評估[ 125 ]。該機制主要包括三種不同的模型，即瞬時環(huán)形孔形成模型（如 MPG [ 126 ]）、反膠束模型（如 TAT [ 127 ]）和“地毯”模型（magainin 2 [ 128,129 ]]）。孔隙形成有兩種模型：桶板模型和環(huán)形模型。在桶板模型中，CPP 形成一個桶狀結(jié)構(gòu)，疏水表面靠近脂質(zhì)，親水界面位于內(nèi)部。在環(huán)形模型中，脂質(zhì)彎曲，使 CPP 靠近表面，CPP 和脂質(zhì)都會形成孔隙 [ 125 ]。反膠束模型是較早引入的一種潛在機制，用于直接滲透滲透素，主要依賴于疏水成分（如色氨酸）與膜內(nèi)疏水區(qū)之間的相互作用 [ 130]]�！暗靥骸蹦Ｐ鸵部梢苑Q為“膜變薄效應(yīng)”，因為它反映了帶正電荷的 CPP 與帶負(fù)電荷的膜之間的相互作用。當(dāng) CPP 在膜表面聚集時，它們會引起局部表面張力的降低，從而使其能夠插入膜中 [ 131 ]。
穿過血腦屏障涉及多種轉(zhuǎn)運機制，為藥物輸送到大腦提供了可能性 [ 131 , 132 ]。（i）被動穿過，包括被動擴散和吸附介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運。被動穿過存在非特異性轉(zhuǎn)運機制。（ii）主動穿過，涉及小分子（如葡萄糖和氨基酸）的特異性轉(zhuǎn)運蛋白。某些蛋白質(zhì)，如轉(zhuǎn)鐵蛋白或胰島素，可與特定受體結(jié)合。
有研究表明，細(xì)胞對富含精氨酸的肽的攝取是通過內(nèi)吞作用和巨胞飲作用機制進行的（圖 3）[ 124 ]。PACAP 的細(xì)胞攝取涉及直接轉(zhuǎn)位和內(nèi)吞作用，即，該 CPP 可能通過受體非依賴性機制穿過脂質(zhì)膜。作為一種生物活性肽，PACAP 在多種生理過程和信號通路中起著關(guān)鍵作用，尤其是在神經(jīng)功能中。其分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周器官中均有特征 [ 133 ]。PACAP 還通過三種主要受體采用受體依賴性內(nèi)化機制：PAC1 受體以及血管活性腸肽受體 1 和 VPAC2 受體 [ 134]。十多年來，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被認(rèn)為是 PACAP 轉(zhuǎn)位到細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的潛在機制。然而，Doan 等人提出了一種不依賴受體的細(xì)胞攝取 PACAP [ 135 ]。了解 PACAP 的內(nèi)化機制對于闡明從細(xì)胞外圍到細(xì)胞核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程至關(guān)重要。
其他 CPP，例如 PepNeg，也可以通過兩種途徑穿透 BBB。雖然直接轉(zhuǎn)位發(fā)生在一些低分子量成分中，但內(nèi)化機制取決于 CPP 濃度 [ 136 ]。Cesbron 等人通過透射電子顯微鏡 (TEM) 揭示了 HA2 融合肽功能化的金納米粒子在 HeLa 細(xì)胞中的內(nèi)化（圖 4）。所得結(jié)果表明，共軛納米粒子 (NP) 能夠進入細(xì)胞。此外，接枝的 PEG 鏈略微增加了內(nèi)體中的 NP 密度 [ 137 ]。
3. 納米粒子介導(dǎo)的藥物輸送
3.1. 脂質(zhì)納米顆粒類型
基于納米技術(shù)的遞送系統(tǒng)是用于高效運輸治療劑的最常見遞送系統(tǒng) [ 138 ]。納米顆粒在各種疾病治療和診斷中得到廣泛探索，為藥物遞送提供了廣泛的可能性 [ 139，140，141 ]。脂質(zhì)納米顆粒由膠體分散體組成，已被廣泛報道為安全有效的納米載體 [ 142，143，144，145，146根據(jù)其物理化學(xué)性質(zhì)，脂質(zhì)納米粒子可分為幾類，例如脂質(zhì)體，固體脂質(zhì)納米粒子，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，納米乳液，囊泡和立方型液晶納米粒子（圖5）。不同類型的脂質(zhì)納米粒子具有特殊的特性，可能會影響大腦藥物輸送，特別是在藥物釋放和穩(wěn)定性方面。選擇合適的脂質(zhì)納米粒子對于有效向大腦輸送藥物至關(guān)重要。了解各種脂質(zhì)納米粒子的類型及其獨特的特性將有助于優(yōu)化藥物輸送過程，以適應(yīng)復(fù)雜的大腦環(huán)境，從而治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
脂質(zhì)體已被廣泛用于腦靶向遞送系統(tǒng) [ 50 ]。脂質(zhì)體由球形水性核心組成，周圍包裹著雙層磷脂。一般來說，脂質(zhì)體如果不靶向配體就無法克服血腦屏障。然而，它們可以通過延長循環(huán)時間來增加腦中的藥物濃度。脂質(zhì)體的另一個優(yōu)點是它們可以封裝親水性和疏水性化合物 [ 147]。與靶向肽結(jié)合的脂質(zhì)體可以從根本上提高藥物療效。dos Santos Rodrigues 等人的研究報道了一種與 CPP 和轉(zhuǎn)鐵蛋白 (Tf) 結(jié)合的脂質(zhì)體制劑，它表現(xiàn)出更高的穿過 BBB 的能力。體內(nèi)研究的結(jié)果證實，TAT-Tf 脂質(zhì)體可將治療性 DNA 運送到小鼠腦內(nèi)[ 142 ]。因此，CPP 功能化的脂質(zhì)體系統(tǒng)在將治療藥物遞送到腦方面具有巨大的前景。
固體脂質(zhì)納米粒 (SLN) 在室溫和體溫下含有固體脂質(zhì)核心。SLN 可以封裝多種治療分子，保護它們免受網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，并降低其毒性 [ 148 ]。然而，由于脂質(zhì)相的固化和隨后的結(jié)晶，SLN 可能存在嚴(yán)重的穩(wěn)定性問題。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體 (NLC) 是由脂質(zhì)二元混合物形成的膠體系統(tǒng)。NLC 可以避免封裝的活性分子發(fā)生重結(jié)晶和相分離。NLC 具有增強的穩(wěn)定性并提供控制釋放，這對于長時間維持大腦中的藥物水平至關(guān)重要。因此，NLC 被認(rèn)為比SLN更穩(wěn)定[ 144、145、146]。
納米乳劑是兩種不混溶液體的油包水 (O/W) 或水包油 (W/O) 分散體，由適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┓�(wěn)定。它們由大小為 20 至 400 納米的小液滴組成。與傳統(tǒng)乳劑相比，納米乳劑的優(yōu)勢在于其穩(wěn)定性更高、表面積大、吸收快。納米乳劑的給藥途徑包括腸外、口服、局部和鼻內(nèi)給藥系統(tǒng)[ 149,150 ]。
立方體是脂質(zhì)納米顆粒，具有雙連續(xù)立方體或膠束立方體類型的內(nèi)部立方體結(jié)構(gòu)。它們可以通過涉及非層狀脂質(zhì)的脂質(zhì)混合物的自組裝形成 [ 57 , 66 ]。雙連續(xù)脂質(zhì)立方體相包含具有周期性最小表面的脂質(zhì)雙層，該雙層與三維水納米通道網(wǎng)絡(luò)交織在一起。立方體的優(yōu)點是生物相容性、親水和疏水化合物共同封裝的可能性、在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性以及易于被細(xì)胞內(nèi)化 [ 151 , 152立方體型液晶納米粒子由于其獨特的內(nèi)部自組裝立方體膜結(jié)構(gòu)，具有更高的藥物包封率和可控的藥物釋放曲線。納米載體的持續(xù)藥物釋放似乎對大腦藥物輸送至關(guān)重要。Rakotoarisoa 等人展示了立方體納米制劑將姜黃素和過氧化氫酶共同輸送到人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 (SH-SY5Y) 的能力，該細(xì)胞是神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞模型。結(jié)果表明，含姜黃素的立方體可以維持或增加酶促過氧化氫酶的活性。這種納米制劑表現(xiàn)出神經(jīng)保護特性 [ 153]。立方納米粒子的表面結(jié)構(gòu)和涂層會影響其吸收機制。Deshpande 等人建立了聚ε-賴氨酸 (PεL) 包被的立方納米粒子和未包被的空白立方納米粒子的不同吸收機制 [ 75 ]。
納米載體類型會影響藥物向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的輸送[ 154、155、156、157 ] 。表2列舉了一些例子，證明了所討論的 LNP 類型對于藥物向大腦或脊髓輸送的重要性。
3.2 納米載體的靶向和內(nèi)化能力
為了開發(fā)基于納米顆粒 (NP) 的載體，以便有效地跨 BBB 輸送藥物，必須解決幾個問題。我們需要確定 NP 是否能夠成功穿過 BBB，如果可以，闡明 NP 實現(xiàn)這種滲透的機制。納米顆�？梢酝ㄟ^幾種機制穿過 BBB [ 163 ]。小的親脂性分子 (<400 Da) 被動擴散穿過內(nèi)皮細(xì)胞層 [ 164對于相對較大的生物分子配體，該過程涉及受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用。特定的表面暴露配體與內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合，促使納米粒子內(nèi)化并穿過屏障。此外，當(dāng)納米粒子由于其特定電荷或表面特性與細(xì)胞膜成分相互作用時，可能會發(fā)生吸附介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用。此外，某些納米粒子或藥物遞送系統(tǒng)可以誘導(dǎo)暫時的血腦屏障破壞以促進其通過。NPs 穿越血腦屏障的能力取決于各種參數(shù)，包括大小、形狀、配體密度和結(jié)合親和力以及表面電荷。通過改變這些參數(shù)，可以改變 NPs 的血腦屏障穿越能力和內(nèi)化機制 [ 165]。劉等人發(fā)現(xiàn) TiO 2粒子的大小和形狀會影響其通透 BBB 的能力。具體而言，與較大的棒狀粒子相比，小球形 TiO 2 NPs 通透 BBB 的效率更高 [ 166 ]。NPs 穿過 BBB 的主要機制是通過內(nèi)皮細(xì)胞層的胞吞作用，這為增強 BBB 通透性以將藥物遞送至靶細(xì)胞提供了選擇 [ 167 ]。
為了提高靶向能力，磁性納米粒子的表面用聚（D,L-丙交酯-共-乙醇酸）（PLGA）和CPP等部分進行改性。經(jīng)過修飾的納米粒子被稱為第三代“靶向納米粒子”[ 168 ]。如上所述，靶向通常包括轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和其他肽，它們在BBB內(nèi)皮細(xì)胞上高度表達[ 142 ]。靜脈注射載有阿霉素的納米粒子可顯著延長單發(fā)腦瘤大鼠的生存時間。荷瘤小鼠腦切片的熒光圖像顯示，納米粒子和阿霉素在大型腫瘤周圍大量積聚[ 169Householder 等人提供了直接的生物分布證據(jù)，證明 100 納米納米粒子在健康小鼠鞘內(nèi)給藥后迅速分布在大腦和脊柱的蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)[ 170]。c 等人證明，載有神經(jīng)保護肽堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (bFGF) 并與抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 1 單克隆抗體 (TfRMAb) 結(jié)合的殼聚糖納米顆粒 (NP) 在通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運作用全身給藥后迅速滲透到 BBB。這種配方可增強對局灶性腦缺血的神經(jīng)保護作用。靶向遞送不僅具有神經(jīng)保護作用，而且還通過將施用的 bFGF 劑量減少約 300 倍而大大降低了全身副作用的風(fēng)險 [ 171 ]。
脂質(zhì)是用于腦部藥物輸送的聚合物納米載體系統(tǒng)的替代選擇（圖 6），因為迄今為止，只有有限數(shù)量的聚合物獲得了監(jiān)管部門的臨床使用批準(zhǔn) [ 54 , 56 , 128 ]，脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 特別適合配制親脂性藥物，并已廣泛研究用作大量針對 ND 的治療劑的載體（例如姜黃素 [ 172 ]、羅匹尼羅 (RP) [ 173 ] 和槲皮素 [ 174 ]）。此外，脂質(zhì)納米顆粒具有生物相容性和生物降解性等優(yōu)勢，有助于提高其整體安全性 [ 175]。它們可以同時包含親水性和疏水性藥物（作為單一化合物或組合）。此外，LNP 易于擴大生產(chǎn)規(guī)模，具有封裝和保護生物治療藥物的能力，具有良好的長期穩(wěn)定性，具有延長藥物釋放效果，尺寸小，便于細(xì)胞內(nèi)化，允許進行表面改性以促進藥物靶向，并便于藥物跨BBB運輸[ 103、104、105、106、107 ]。
雖然脂質(zhì)納米粒子因具有穿過血腦屏障的能力而有望將藥物輸送到大腦，但它們的療效受到一些限制。其中一個限制因素是誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致被身體清除或引起不良反應(yīng) [ 176,177 ]。針對特定的大腦區(qū)域仍然是一個障礙，因為大腦復(fù)雜的生物環(huán)境可能會阻礙納米粒子中治療有效載荷的有效運輸和釋放 [ 178 ]。因此，盡管脂質(zhì)納米粒子為大腦藥物輸送提供了途徑，但需要解決現(xiàn)有的缺點，才能成功應(yīng)用脂質(zhì)納米粒子治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
4. 神經(jīng)退行性疾病納米藥物開發(fā)的例子
4.1. 用于神經(jīng)保護和神經(jīng)修復(fù)的生物活性肽
生物活性肽是通過化學(xué)合成或酶水解蛋白質(zhì)（例如來自食物資源的蛋白質(zhì)水解物）獲得的氨基酸序列。此類肽可用于治療各種人類疾病[ 75 ]。許多出版物表明，一些具有神經(jīng)保護作用的生物活性肽（例如 PACAP）可以在預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病方面發(fā)揮潛在的治療作用。PACAP（表 1）最初是從綿羊下丘腦提取物中分離出來的，因為它能夠刺激大鼠垂體前葉細(xì)胞中環(huán)磷酸腺苷的形成[ 115]。在過去的三十年中，PACAP 已被證明在各種神經(jīng)病理學(xué)的體外和體內(nèi)模型中都發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用 [ 116 ]。雖然 PACAP 具有細(xì)胞穿透能力，但其神經(jīng)保護潛力引起了更多的關(guān)注，使其成為一種有前途的治療劑，而不是傳統(tǒng)的 CPP。PACAP 已被證明可以激活 CREB（cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白），這是一種參與各種細(xì)胞過程的重要轉(zhuǎn)錄因子。PACAP 與其受體的結(jié)合會觸發(fā)信號級聯(lián)（ERK、AKT 或 PLC 通路），從而導(dǎo)致 CREB 的激活（圖 7）[ 179在AD病理學(xué)中，在人類患者的腦脊液（CSF）樣本和腦組織中觀察到較低的PACAP水平，這與輕度認(rèn)知障礙和癡呆階段的認(rèn)知能力下降有關(guān)[ 180 ]。這些數(shù)據(jù)證實了這種生物活性肽在維持神經(jīng)元功能方面的重要作用。
PACAP 治療已顯示出通過保護神經(jīng)元免受 Aβ-淀粉樣蛋白-42 寡聚體的毒性而減緩 AD 進展的效果 [ 181 ]。這種保護可能是通過增強線粒體功能實現(xiàn)的 [ 181 ]。Chen 等人在野生型和 PACAP 缺陷型小鼠中發(fā)現(xiàn)了幾個在大腦中動脈閉塞 (MCAO) 后上調(diào)的基因，隨后在 MCAO 后通過 PACAP 治療抑制了這些基因。這種轉(zhuǎn)錄模式符合這些基因在損傷反應(yīng)中發(fā)揮作用的概念，因為外源性 PACAP 治療與中風(fēng)后神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)果的改善有關(guān) [ 182]]。此外，在黑質(zhì)和腹側(cè)被蓋區(qū)也觀察到了 PACAP 結(jié)合，這兩個區(qū)域都與帕金森病的發(fā)病機制密切相關(guān) [ 183 ]。PACAP 的神經(jīng)保護特性也在 PD 大鼠模型中得到證實，在該模型中，肽給藥可防止黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的退化，減緩認(rèn)知能力下降，并通過調(diào)節(jié)多巴胺水平和 PD 蛋白 7 (PARK7) 改善行為缺陷 [ 184]。雖然有大量證據(jù)強調(diào)了 PACAP 的關(guān)鍵作用及其對 ND 的治療潛力，但在將其轉(zhuǎn)化為藥物產(chǎn)品之前必須克服某些挑戰(zhàn)。將 PACAP 等神經(jīng)治療分子輸送到 CNS 會帶來一些挑戰(zhàn)。BBB 的存在和大腦中的一些外排機制使肽或蛋白質(zhì)類型的神經(jīng)治療劑的輸送變得困難。
Zhang 等人證明，含有兩種抗氧化肽 HDHPVC 和 HEKVC 的圓尾魚水解物 (RSH) 具有強大的神經(jīng)保護特性，包括抗氧化、抗凝和降血壓等一系列活性。他們還提供了進一步的證據(jù)，證實了 RSH 在減輕大鼠睡眠剝奪引起的記憶缺陷方面的保護作用 [ 185 ]。
Leo 等人最近測試了S. hispanica的幾種肽級分對 HMC3 細(xì)胞的神經(jīng)保護作用。S. hispanica中的 F-1–3 kDa顯著提高了 HMC3 細(xì)胞在叔丁基過氧化氫 (TBHP) 損傷后的存活率。這一結(jié)果證明了 F-1–3 kDa 肽的神經(jīng)保護作用。為了了解 F-1–3 kDa 肽的神經(jīng)保護機制，我們檢查了細(xì)胞內(nèi)的 ROS、NO 生成、H 2 O 2生成和 TNF-α。ROS、NO、H 2 O 2的生成和TNF-α在F-1–3 kDa肽孵育后均降低。因此，F(xiàn)-1–3 kDa肽的神經(jīng)保護作用可能有助于抗炎和抗氧化機制[ 154 ]。
對于阿爾茨海默病，使用針對淀粉樣蛋白β的肽抑制劑可以減輕這種蛋白質(zhì)的積累，這是阿爾茨海默病病理學(xué)的一個標(biāo)志[ 85 ]。淀粉樣蛋白β（Aβ）肽是來自一種稱為淀粉樣蛋白前體（APP）的較大蛋白質(zhì)的片段，它們傾向于聚集形成有毒的低聚物和原纖維。Aβ肽抑制劑旨在干擾或調(diào)節(jié)Aβ肽的聚集過程，目的是預(yù)防或減緩淀粉樣斑塊的形成[ 186]因此，過去二十年來，淀粉樣β肽抑制劑一直是AD治療研究的重點。這些抑制劑可以針對Aβ聚集的各個階段進行定制，包括單體、低聚物和原纖維，其開發(fā)對阿爾茨海默病治療的發(fā)展具有巨大的前景（如圖8所示）[ 187 ]。
4.2. 用于神經(jīng)保護和神經(jīng)修復(fù)的脂質(zhì)納米粒子
脂質(zhì)納米粒子 (LNP) 具有生物相容性和生物可降解性，有助于減輕與傳統(tǒng)藥物給藥相關(guān)的副作用 [ 52、143、165、188、189、190 ]。除了安全性之外，LNP 還有助于防止封裝的生物活性分子降解 [ 144、145、146、147、149、150、151 ] 。通過自組裝制備的雙載藥立方體型納米載體可以顯示涉及納米域的多室液晶組織（圖 9通過雙負(fù)載液晶LNPs來調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激已被提議作為預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的一種治療選擇[ 172 ]。
為了克服肽和蛋白質(zhì)遞送的問題，脂質(zhì)基納米載體已被廣泛研究用于納米藥物開發(fā)，因為它能夠保護封裝的治療成分，延長循環(huán)時間，并通過修改LNP表面增強靶向效果。Fukuta等人證明了脂質(zhì)體藥物遞送系統(tǒng)對缺血性中風(fēng)治療的有效性。將制備的PEG脂質(zhì)體靜脈注射到大鼠模型中。使用成像系統(tǒng)在缺血區(qū)域切片中檢測到DiL熒光。結(jié)果表明，PEG脂質(zhì)體可以在缺血區(qū)域中聚集。此外，與非缺血區(qū)域相比，缺血區(qū)域中的積累增強，說明PEG脂質(zhì)體能夠通過EPR效應(yīng)（增強滲透性和滯留效應(yīng)）進入病變區(qū)域[191 ]。Gajbhiye 等人報道了使用聚乙二醇化納米載體作為腦部靶向藥物的有效遞送。PEG 鏈延長了藥物進入大腦的循環(huán)時間[ 49 ]。Rodrigues 等人的研究介紹了使用雙重修飾脂質(zhì)體的其他例子，結(jié)果表明，與 CPP 和 Tf 結(jié)合的脂質(zhì)體在單次靜脈給藥后可以穿過血腦屏障。此外，體內(nèi)研究結(jié)果證實，TAT-Tf 脂質(zhì)體可促進治療性 DNA 的運輸和進入小鼠大腦。因此，該系統(tǒng)對于腦靶向基因遞送似乎非常有前景[ 67 ]。
盡管許多肽和蛋白質(zhì)已在細(xì)胞和動物模型中顯示出其神經(jīng)保護特性，但將這些發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用仍是一項重大挑戰(zhàn)。人體是一個錯綜復(fù)雜的互連系統(tǒng)，因此將治療劑精確輸送到大腦是一項重要任務(wù)。LNP 適用于神經(jīng)保護和神經(jīng)修復(fù)，因為它們具有封裝疏水性藥物和提高藥物輸送到目標(biāo)組織后的生物利用度等優(yōu)勢。例如，穿心蓮內(nèi)酯 (AG) 具有神經(jīng)保護作用，但溶解性差，生物利用度低。Graverini 等人表明固體脂質(zhì)納米顆粒 (SLN) 可以將 AG 輸送到大腦。SLN 改善了藥物的釋放特性和向 BBB 部位的運輸。這些結(jié)果已通過使用體外細(xì)胞模型、BBB 模型和大鼠體內(nèi)實驗的評估得到證實。143 ]。Zhu 等人證明了包裹神經(jīng)生長因子 (NGF) 的明膠納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體 (GNL) 可減少脊髓損傷 (SCI) 模型中的神經(jīng)元缺陷。作者研究了神經(jīng)元存活率、行為恢復(fù)情況，并通過蘇木精-伊紅染色測量了 SCI 恢復(fù)的效果。結(jié)果表明，施用 NGF-GNL 可通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) ER 應(yīng)激產(chǎn)生神經(jīng)保護作用 [ 162 ]。Ho 等人的研究展示了 PACAP 對中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 的神經(jīng)保護作用的一個例子，他們研究了納米顆粒-水凝膠復(fù)合材料中 PACAP 控制釋放的體內(nèi)功效 [ 192]]。為了達到治療效果，采用所創(chuàng)建的控釋系統(tǒng)在10天的治療期內(nèi)將PACAP局部輸送到中風(fēng)小鼠的大腦中。
4.3. 神經(jīng)治療藥物輸送治療阿爾茨海默病
對 AD 治療藥物的探索仍在進行中。AD 是最常見的進行性神經(jīng)退行性疾病，多年來一直是醫(yī)療保健面臨的最重大挑戰(zhàn)之一。其癥狀包括記憶喪失和認(rèn)知能力下降，這兩者都對患者的日常生活產(chǎn)生深遠影響。AD 病例數(shù)每年都在增加，尤其是在發(fā)達國家。根據(jù)世界衛(wèi)生組織 (WHO) 的預(yù)測，到 2050 年，全球患者數(shù)量可能高達 1.52 億 [ 193 ]。AD 是一種復(fù)雜的多因素疾病 [ 194]] 淀粉樣蛋白 β (Aβ) 聚集體的過度表達和積累被廣泛認(rèn)為是該疾病發(fā)病機制中的一個重要因素。因此，絕大多數(shù)臨床試驗和研究工作都集中在開發(fā)針對 Aβ 的藥物和干預(yù)措施上，以減緩 AD 的進展。目前有多個藥物開發(fā)項目處于第 2 和第 3 階段。由于許多試驗在早期就停止了，因此尚不清楚長期治療是否會產(chǎn)生有益效果 [ 194 , 195 ]。
4.3.1. 基于肽的策略
基于肽的 AD 治療策略主要集中在減少淀粉樣 β 斑塊的積累�；陔牡闹苿� CH-3 是由三種酶產(chǎn)生的牛酪蛋白水解物。Akio 等人評估了其 ACE 抑制活性和抗高血壓作用，與其他水解物相比，顯示出顯著的抗高血壓作用 [ 196 ]。Min 等人證明，口服 CH-3 肽可以改善 AD 小鼠模型的認(rèn)知功能。在該研究中，AD 動物模型是通過腦室內(nèi)注射 Aβ 1-42創(chuàng)建的在小鼠中，導(dǎo)致認(rèn)知障礙，這通過 Morris 水迷宮測試得到證實�？诜� CH-3 后，認(rèn)知功能恢復(fù)到與對照組相當(dāng)?shù)乃健４送�，�?AD 小鼠模型中還檢測了一種不同于 CH-3 的三肽 MKP。MKP 表現(xiàn)出穿透 BBB 的能力，并有效緩解了 Aβ 1-42引起的認(rèn)知障礙 [ 197 ]。
除了這些神經(jīng)保護肽之外，另一種針對 AD 的肽基策略涉及 Aβ 或 Tau 肽疫苗，由 Aβ 或 Tau 肽的各種片段組成。這些疫苗通過訓(xùn)練人體免疫系統(tǒng)識別和消除阿爾茨海默病患者大腦中存在的有害 Aβ 沉積物（或 Tau 蛋白纏結(jié)）發(fā)揮作用。ACI-35 就是這樣一種候選疫苗，它被設(shè)計為一種基于脂質(zhì)體的疫苗，含有 16 個合成 Tau 片段（Tau393–408）的拷貝，在殘基 S396 和 S404 處被磷酸化。這些 Tau 磷酸肽經(jīng)過修飾，兩端各包含兩條棕櫚酸鏈，使其能夠組裝成脂質(zhì)體。目前，這些有前景的疫苗正在進行臨床前和臨床研究，以評估其安全性和有效性 [ 198 ]。
4.3.2. 基于蛋白質(zhì)的策略
蛋白質(zhì)在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能方面起著核心作用。神經(jīng)營養(yǎng)因子 (NT) 是一類具有神經(jīng)保護作用和潛在治療 AD、PD 和亨廷頓氏病作用的蛋白質(zhì)。神經(jīng)營養(yǎng)因子可通過對特定神經(jīng)元群的神經(jīng)營養(yǎng)作用來預(yù)防或減少神經(jīng)元退化。哺乳動物神經(jīng)營養(yǎng)因子家族包括神經(jīng)生長因子 (NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3 (NT-3) 和神經(jīng)營養(yǎng)因子-4/5 (NT-4/5) [ 155 , 156 ]。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (GDNF) 是一種重要的蛋白質(zhì)，可維持中腦多巴胺能神經(jīng)元的存活 [ 155]。GDNF 功能障礙與許多神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。一項研究報告稱，AD 患者血漿中的 GDNF 水平下降[ 157 ]。因此，施用 GDNF 可能是某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的潛在治療方法。然而，GDNF 不會穿過血腦屏障。Dietz 等人在 PD 小鼠模型中證明了 TAT 可穿過血腦屏障遞送 GDNF 的有效性。進行的免疫組織化學(xué)分析證實，全身給藥后，Tat-GDNF 可以到達大腦區(qū)域[ 156 ]。這些基于蛋白質(zhì)的策略在臨床前研究中表現(xiàn)出低毒性，但在最終進行臨床試驗之前還需要進一步進行配方和安全性研究。
4.4. 細(xì)胞穿透肽與納米粒子的結(jié)合用于治療神經(jīng)退行性疾病
神經(jīng)退行性疾病，如 AD 和 PD，對將治療藥物靶向輸送到大腦提出了重大挑戰(zhàn) [ 52 , 57 ]。CPPs 和納米顆粒的結(jié)合具有多種優(yōu)勢，例如增加細(xì)胞攝取和靶向輸送特定細(xì)胞或疾病部位，從而最大限度地減少副作用并改善治療效果。多項研究強調(diào)了 CPP-NPs 結(jié)合物對治療各種疾病（例如癌癥）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、局部損傷以及成像探針的有益作用 [ 199]。Ahlschwede 等人的研究表明，陽離子 CPP（K16ApoE）與 NPs 的結(jié)合不僅可以顯著改善治療分子向腦內(nèi)的運輸，還可以靶向與AD 病理有關(guān)的特定肽（Aβ 40 ）。這一結(jié)果表明，CPP-NPs 結(jié)合物可以成為一種有前途的 AD 治療遞送系統(tǒng) [ 200 ]。Zhang 等人報道了一種雙靶向藥物遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)可遞送用于 AD 治療的 siRNA 治療劑。該配方可以抑制 β-淀粉樣蛋白轉(zhuǎn)換酶 1（BACE1）以減少 Aβ 的形成。此外，雙修飾的 NPs 在細(xì)胞模型中表現(xiàn)出低毒性 [ 201]。Wen等人展示了一種多功能靶向藥物遞送系統(tǒng)TAT偶聯(lián)磁性聚（D，L-丙交酯-共-乙交酯）（PLGA）/脂質(zhì)納米粒（MPL）的靶向功效（圖10 ）。制備過程如圖10a所示，使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察到TAT-MPL發(fā)出的強熒光（圖10b）。這一發(fā)現(xiàn)表明TAT-MPL能夠有效地將熒光結(jié)合物（FITC和QDs）遞送到bEnd.3細(xì)胞中[ 105 ]。
雖然 CPP 功能化納米粒子仍在研究中，但它們在 ND 治療中的廣泛應(yīng)用仍存在障礙。盡管 CPP-納米粒子組合促進了細(xì)胞內(nèi)藥物輸送，但它們在不同的生物環(huán)境中面臨著穩(wěn)定性、可能的細(xì)胞毒性、脫靶效應(yīng)和選擇性差的困難。由于 CPP 和 NP 之間的相互作用而引起的對免疫原性和身體清除的擔(dān)憂可能會損害貨物輸送的效率，最終會降低治療效果。與傳統(tǒng)的輸送途徑相比，“鼻腦”輸送等策略能夠更快地將藥物輸送到大腦，并為改善神經(jīng)退行性疾病和相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了替代方案。
5. 鼻-腦CPP介導(dǎo)的生物活性分子遞送在納米醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景
由于血腦屏障限制了大多數(shù)生物分子以治療劑量輸送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)元疾病的治療面臨巨大挑戰(zhàn)。除了血腦屏障帶來的挑戰(zhàn)之外，許多神經(jīng)保護劑（如 PACAP）的半衰期很短 [ 115 ]。具體來說，當(dāng) PACAP 靜脈注射 (IV) 時，由于二肽基肽酶 IV (DPP IV)（一種負(fù)責(zé)從多肽的 N 端裂解 X-脯氨酸或 X-丙氨酸二肽的外肽酶）的快速降解，其半衰期非常短，不足 5 分鐘 [ 115除靜脈給藥外，直接向腦注射由于其高度侵入性且不切實際的臨床應(yīng)用，不被認(rèn)為是一種現(xiàn)成的轉(zhuǎn)化選擇。一種替代且有效的向腦部輸送藥物的策略是使用非侵入性鼻-腦給藥系統(tǒng)。鼻內(nèi)途徑因其能夠?qū)⑺幬镏苯虞斔偷侥X部而不經(jīng)過體循環(huán)而受到廣泛關(guān)注[ 202 ]。雖然從鼻子到大腦的具體路徑仍不清楚，但 Pardeshi 等人提出藥物通過嗅覺神經(jīng)通路和三叉神經(jīng)通路進入大腦[ 203 ]。
過去十年，小分子量藥物、肽和蛋白質(zhì)的鼻腔給藥系統(tǒng)研究取得了長足發(fā)展[ 161,204 ]。例如，Boche 等人評估了納米乳劑制劑將富馬酸喹硫平 (QTP) 輸送到大腦的有效性。與靜脈注射制劑 (0.25 ± 0.44 μg/mL) 相比，鼻腔內(nèi)給藥的 QTP 納米乳劑在大腦中產(chǎn)生的峰濃度更高 (0.48±0.16 μg/mL)。這表明鼻腔內(nèi)納米乳劑給藥是將治療分子輸送到大腦的有效方法[ 205]。Brown等研究了TAT結(jié)合的D1–D2干擾肽經(jīng)鼻腔給藥后的抗抑郁作用。利用加壓嗅覺遞送（POD）裝置將TAT-D1–D2干擾肽施用于抑郁大鼠模型。通過強迫游泳試驗、免疫熒光和共聚焦顯微鏡成像評估研究結(jié)果。強迫游泳試驗結(jié)果顯示，與鹽水組和TAT組相比，TAT-D1–D2干擾肽和丙咪嗪的不動計數(shù)顯著減少，表明TAT-D1–D2干擾肽具有抗抑郁作用。此外，對接受治療的大鼠前額葉皮質(zhì)切片進行免疫熒光染色證實了TAT-D1–D2干擾肽能夠進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。然而，TAT-D1–D2 干擾肽進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機制仍是一個問題[206 ]。為了增強鼻到腦的藥物輸送，人們探索了各種方法，如殼聚糖表面改性、PEG 表面改性、脂質(zhì)表面改性和肽表面改性的納米系統(tǒng)[ 207 ]。目前有幾項臨床試驗正在進行中，旨在探索針對神經(jīng)退行性疾病的鼻內(nèi)療法[ 208 ]。
6 結(jié)論
近年來，人們對使用脂質(zhì)納米顆粒和 CPP 實現(xiàn)更有效的靶向遞送以治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病產(chǎn)生了濃厚的興趣。在這篇綜述中，我們總結(jié)了該領(lǐng)域的最新進展和創(chuàng)新，涵蓋的主題包括將脂質(zhì)納米顆粒制劑遞送至大腦、CPP 的選擇性靶向能力，以及 CPP 與納米顆粒結(jié)合的協(xié)同效應(yīng)。在治療神經(jīng)退行性疾病方面，脂質(zhì)納米顆粒藥物在增強治療分子的溶解度、穩(wěn)定性和生物利用度方面表現(xiàn)出優(yōu)勢。另一方面，CPP 結(jié)合藥物在改善細(xì)胞攝取和促進選擇性靶向方面表現(xiàn)出前景。開發(fā)兼具納米顆粒和 CPP 優(yōu)勢的雙重輸送系統(tǒng)，對靶向輸送系統(tǒng)的未來具有巨大的潛力。人們特別關(guān)注 PACAP 肽作為神經(jīng)保護藥物輸送方法中的治療劑的潛力。盡管穿越 BBB 存在固有的挑戰(zhàn)，但靶向藥物輸送系統(tǒng)（包括納米顆粒載體、雙重載藥脂質(zhì)納米顆粒和 CPP）已證明其在增強 BBB 滲透方面的實用性。此外，鼻腦藥物輸送的概念已成為一種有前途的向大腦輸送藥物的方法。為了充分理解潛在機制、減輕潛在的毒性問題并推進新型靶向輸送系統(tǒng)的開發(fā)，在將該策略轉(zhuǎn)化為人體臨床試驗之前，還需要進一步研究。
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